Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1 Частота, виды и причины возникновения дефектов суставного хряща 14
1.2 Морфологические, биохимические и физиологические особенности суставного хряща 17
1.3 Регенерация суставного хряща при полнослойном и неполнослойном дефектах 20
1.4 Развитие дегенеративно-дистрофических процессов в суставе при дефектах суставного хряща 22
1.5 Современные методы лечения дефектов суставного хряща 25
1.6 Применение клеточных технологий при дефектах суставного хряща 30
1.7 Характеристика и обоснование применения мезенхимальных стволовых клеток при дефектах хряща 36
1.8 Резюме 45
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования
2.1. Модель эксперимента 46
2.2. Получение и культивирование и подготовка к имплантации стромальных клеток костного мозга 49
23. Формирование дефектов суставной поверхности и
имплантация мезенхимальных стромальных клеток 53
2.4. Проведение макроскопического и гистологического
исследования регенерата з
2.5. Проведение цитофлоуметрического исследования 62
2.6. Методы статистической обработки і 64
ГЛАВА Ш. Регенерация полнослойного дефекта суставной поверхности
3.1 Регенерация полнослойного дефекта суставной поверхности без имплантата 65
3.2 Регенерация полнослойного дефекта суставной поверхности после имплантации плазматического сгустка 69
3.3 Регенерация полнослойного дефекта суставной поверхности имплантации мезенхимальных стромальных клеток в плазматическом сгустке 73
3.4 Регенерация полнослойного дефекта суставной поверхности?
после имплантации мезенхимальных стромальных клеток в виде суспензии 78
3.5 Сравнение морфологических характеристик регенерации при полнослойном дефекте суставной поверхности в различных условиях 80
3.6 Резюме 91
ГЛАВА IV. Регенерация неполнослоиного дефекта суставной поверхности
4.1 Регенерация неполнослойного дефекта суставного хряща (контроль) 92
4.2 Регенерация неполнослойного дефекта суставного хряща после имплантации суспензии стромальных клеток костного мозга 93
4.3 Распределение суспензионно введенных клеток в суставе 97
4.4 Резюме 99 Обсуждение результатов 100
Заключение 107
Выводы 109
Практические рекомендации 110
Список использованной литературы 1
- Морфологические, биохимические и физиологические особенности суставного хряща
- Получение и культивирование и подготовка к имплантации стромальных клеток костного мозга
- Регенерация полнослойного дефекта суставной поверхности после имплантации плазматического сгустка
- Регенерация неполнослойного дефекта суставного хряща после имплантации суспензии стромальных клеток костного мозга
Морфологические, биохимические и физиологические особенности суставного хряща
Повреждения суставного хряща (СХ) в связи с заболеванием или травматического генеза довольно часто встречаются ортопедам. Однако интерес к нем возрос в последние десятилетия в связи с пониманием значения в развитии дегенеративно-дистрофических изменений в суставе [9,20,119,125,152,196] и появлением артроскопических технологий [22,43,75,101]. По данным Curl W.W. и соавторов [75] повреждения СХ встречаются в 63% артроскопий; Агоеп А. и соавторы [43] обнаружили патологию СХ у 66% больных, в том числе у 11% имелся локальный полнослойный дефект; Hjelle К. и соавторы [101] выявили локальное хондральное и остеохондральное повреждение при 19% артроскопий.
Среди людей молодого возраста основной причиной повреждения хрящевого покрова сустава является травма [22,142,152,186,196]. Внутрисуставные переломы составляют от 4 до 7% всех повреждений скелета [31].СХ при этом непосредственно вовлекается в зону перелома. Но кроме непосредственного нарушения целостности СХ, при внутрисуставных переломах имеется заинтересованность прилежащей суставной поверхности. Происходит разволокнение и разрывы коллагеновой сети, выход из матрикса хряща протеогликанов (ПГ). Хондроциты (ХЦ) также страдают в различной степени, нарушается их способность синтезировать утраченный хрящевой матрикс (ХМ) [5,125,142,196]. Ситуация усугубляется обычно используемой при лечении внутрисуставных переломов длительной иммобилизации, которая значительно нарушает трофику СХ, биохимический гомеостаз синовиальной среды сустава [1,7,31,36]. Сращение СХ при внутрисуставных переломах наблюдается крайне редко [20], а нарушения в прилегающем хрящевом покрове приводит к формированию дефекта СХ. Но чаще СХ повреждается при травмах без рентгенологически определяемого перелома эпифиза (транс- и субхондральные переломы), которые в клинической практике часто скрываются за, казалось бы, прогностически благоприятным диагнозом , «ушиб сустава, гемартроз»Ластота подобных повреждений составляет 5 - 7% всех травм и 18% травм конечностей [22,24]. Меркулов В.Н. и Карам Е.А. выявили трансхондральные и субхондральные переломы соответственно в 48,7% и 23,6% случаев при артроскопии коленного сустава по поводу травм у детей [22]. Hardaker W.T. и соавторы выявили повреждения СХ в 16% при артроскопиях по поводу гемартроза коленного сустава [97]. Часто травмы СХ сопутствуют другим повреждениям внутрисуставных структур [102,137]. Например, при разрыве передней крестообразной связки коленного сустава в 20-40% обнаруживаются повреждения СХ [71,137,190]. Нестабильность сустава, наличие свободных внутрисуставных тел, поврежденного мениска и т.д. является еще одним фактором, травмирующим СХ.
Морфологическая картина зоны повреждения при трансхондральных и субхондральных переломах характеризуется наличием участков механической деструкции хряща различной степени выраженности. В редких случаях она ограничивается небольшими очагами разрушения суставного хряща с образованием поверхностных дефектов или звездообразных разрывов в глубоких слоях. Чаще обнаруживаются узкие или более широкие щелевидные дефекты, частичное отщепление хряща от костной пластинки, размозжение с формированием глубоких и широких дефектов в виде бухт и узур, занимающих значительную часть или всю толщину хряща [22,196,200].
Рассекающий остеохондрит встречается чаще в детском и подростковом возрасте и составляет от 2,5 до 18% ортопедической патологии коленного сустава [22,12,9]. При болезни Кенига патологический процесс развивается первоначально не в суставном хряще, а в субхондральной области. Затем происходит нарушение целостности суставного хряща с образованием трещин и эрозий, в некоторых местах наблюдается его разволокнение. В дальнейшем наблюдается отделение хрящевого и костного фрагмента с образованием свободных внутрисуставных тел; на материнском ложе остается кратерообразный дефект.
Деформирующий остеоартроз (ДОА) несомненно, является, главной причиной развития дефектов суставной поверхности у людей старше 40 лет [126,138,89]. ДОА является полиэтиологическим заболеванием и составляет более 80% всех форм суставной патологии [3,32]. В США ежегодно по поводу ДОА проводится более 1 миллиона операций [119]; в Германии на лечение данной категории больных расходуется 10-20 миллиардов евро [166].
В основе ДОА лежит нарушение метаболизма ХЦ, которые продуцируют измененные, неполноценные в функциональном отношении, элементы ХМ [80,169,174], обладающие пониженной резистентностью к механическим нагрузкам. Это происходит на фоне повышенной активности металлопротеиназ (ММР - matrix metalloproteinase) [80,169]. Повышение пролиферативной и синтетической активности ХЦ в начальные этапы болезни не способно предотвратить утечку ХМ. В результате, через последовательные степени хондромаляции, на фоне сохраняющейся механической нагрузки, формируется «костный шлиф» [18,30] - участок суставной поверхности, полностью лишенный хрящевого покрова. Как правило, подобные дефекты имеют большую площадь, чем посттравматические, и окружены зоной хряща с нарушенными метаболическими, механическими и биохимическими свойствами [126,138].
Таким образом, дефекты хрящевого покрова сустава являются распространенным состоянием, развивающимся в молодом возрасте чаще вследствие травм или рассекающего остеохондрита, в пожилом — как результат механодеструкции хряща при ДОА.
Получение и культивирование и подготовка к имплантации стромальных клеток костного мозга
Гетерогенность первичной культуры стромальных клеток КМ заметна уже при микроскопическом осмотре полученных колоний [51,53,211] и выражается в различном размере и скорости роста колоний, а также морфологии клеток, варьирующей от фибробластоподобных веретеновидных до уплощенных больших клеток. Более того, при сроках культивирования 20 дней и больше некоторые колонии становятся позитивными при окраске на щелочную фосфатазу, в то время как другие остаются негативными; появляются также колонии, позитивные на щелочную фосфатазу в центральных регионах и негативные на периферии [83]. Иногда клетки в некоторых колониях начинают спонтанно дифференцироваться- в остеогенном, хондрогенном или адипогенном направлениях [50,105].
В экспериментах с клонированием и дифференцировкой in vitro гетерогенность культивированных стромальных клеток становиться еще более заметной. Причем здесь мы опять сталкиваемся с разногласиями в результатах среди исследователей, использовавших одинаковый дизайн экспериментов и аналогичные дифференцировочные среды. Количество трипотентных клеточных линий (остео-, хондро-, адипогенных) колеблется от 2% [145] до 50% [155]. Обнаруживают также бипотентные (остео-хондрогенные, остео-адипогенные, хондро-адипогенные) и монопотентные (остеогенные, хондрогенные или адипогенные) клеточные линии, а также штаммы клеток, которые не обладают способностью дифференцироваться в специальных средах [145]. Некоторые исследователи находят, что все клонированные клетки стромы костного мозга обладают остеогенными свойствами [133,155] и делают вывод, что остеогенный путь дифференцировки является «путем по умолчанию» для МСК. Но в другие авторы [145] не подтверждают предпочтений МСК в том или ином направлении дифференцировки.
Кроме гетерогенности МСК, эти исследования еще раз демонстрируют относительность дифференцировочных тестов для оценки мультипотентности МСК и подтверждения их стволовых свойств. Интересно, что при повторном пассировании и клонировании уже клонированных линий МСК исследователи получают вновь гетерогенную культуру [51,53,216]. Это говорит о значительной изменчивости МСК, по крайнем мере при культивировании, а также о несовершенстве классической модели иерархической организации мезенхимальных тканей [145,155]. На основании вышеизложенных данных некоторые авторы [51] делают заключение, что «даже тщательно очищенные и охарактеризованные популяции МСК являются не более «чистыми», чем первичная культура, полученная путем простой адгезии к культуральному пластику» (перевод автора).
Изменения МСК с возрастом человека
Этот вопрос является чрезвычайно важным для использования актогенных МСК в клинической практике. Среди многих практикующих врачей и некоторых исследователей бытует мнение, что с возрастом количество стволовых клеток в организме уменьшается, оставшиеся клетки утрачивают свой пролиферативнй и дифференцировочный потенциал [76,144,158]. В то же время, большинство заболеваний, при которых требуется увеличить регенеративный потенциал организма, ассоциированы с пожилым и старческим возрастом. Однако с одном из последних исследований [164], проведенном на овцах в возрасте от 4 месяцев до 8 лет (предельный возраст для этих животных) показано, что с возрастом в самом деле происходит уменьшение мононуклеарных клеток, получаемых из КМ. Но абсолютное количество МСК (оцениваемое по тесту колониеобразования), а также их способность к пролиферации и дифференцировке достоверно не изменяются.
Хондрогенный потенциал МСК
Для получения хондрогенной дифференцировки МСК in vitro большинство исследователей [51,111,117,164,182,188,211,212] используют культивирование в хондрогенной среде (примеры которой показаны выше) в микромассах из 250.000 - 500.000 клеток, полученных путем центрифугирования. В этих условиях пролиферация клеток прекращается, клетки приобретают округлую форму и начинают продуцировать сульфатированные протеогликаны и коллаген П типа, что свидетельствует об их дифференцировке в направлении гиалинового хряща. Добавление одних только ФР недостаточно для хондрогенной дифференцировки [155,165,212].
In vivo в первых опытах, проведенных A. Friedenshtein, хондрогенная дифференцировка была получена при имплантации первичной культуры стромальных клеток костного мозга в организм в диффузионных камерах [83]. При имплантации полученных клеток в открытых системах (под кожу, под капсулу почки) всегда получалась костная ткань.
Аналогичная ситуация наблюдается при образовании суставного хряща в период эмбрионального развития. Образованию первой хрящевой ткани в организме предшествует конденсация клеток мезенхимы с образованием клеточной массы высокой плотности [11,116,180].
Анализ этих данных позволяет предположить, что конденсация МСК в клеточную массу высокой плотности с сопутствующей гипоксией и тесными межклеточными контактами являются принципиально важными для проявления хондрогенных свойств этих клеток, а также одним из путей для улучшения регенерации СХ в экспериментах и клиническом использовании.
При культивировании МСК в микромассах без добавления ФР хондрогенной дифференцировки не происходит, микромасса «рассьшается» на 2-3 день [69,212]. Это показывает важность микроокружения и необходимость дополнительных дифференцировочных стимулов. Но в одном из исследований [69] показано, что синовиальная среда сустава и синовиальная жидкость также создает благоприятное для хондрогенеза микроокружение. Имплантация первичной культуры стромальных клеток КМ в суставную полость в носителе (PLGA) приводила к выработке клетками протеогликанов и коллагена П типа. Такой же эффект наблюдался in vitro при добавлении в культуральную среду вместо ФР синовиальной жидкости.
Некоторые хондрогенные ФР (TGFbl, IGF, IGF-связывающий белок) обнаружены в синовиальной жидкости [128,146]. Однако точный спектр ФР в нормальных условиях и при различных патологических состояниях не известен. Можно только предположить, что он максимально приближается к необходимому для дифференцировки и поддержания хондрогенного фенотипа МСК.
В примере использования МСК для восстановления дефектов суставной поверхности, приведенном в главе 1.6, клетки изолировались от суставной полости лоскутом надкостницы, чем возможно объясняются довольно скромные результаты. Сохранение сообщения имплантированных клеток с синовиальной жидкостью могло бы улучшить качество регенерации и результаты лечения.
Регенерация полнослойного дефекта суставной поверхности после имплантации плазматического сгустка
Лучшие результаты на всех сроках наблюдения отмечаются для группы с имплантацией СККМ (Р„ 0,05). Однако необходимо отметить, что наибольшая разница отмечалась на 6 и 12 неделях. К 24 неделе различия уменьшались, оставаясь статистически достоверными. Различия между 1-й и 2-й контрольными группами менее выражены (на 24 неделе Р„ =0,05).
Мы провели сравнение результатов по каждому их показателей микроскопического исследования, чтобы оценить их динамику и вклад в комплексную оценку регенерации.
Заполнение области дефекта (рис. 19) вновь образованной тканью достоверно отличалась между группами с имплантацией СККМ и имплантацией ПС без клеток на 6 и 12 неделях (Ри 0,05). К 24 неделе регенерат в группе с имплантацией ПС достигал уровня суставной поверхности, иногда был выше ее. Между группами с имплантацией СККМ и без имплантата по этому параметру нет статистически достоверной разницы. 3,5
Связь регенерата с окружающим хрящом (рис. 20) достоверно отличалась (Ри 0,05) между группами с имплантацией СККМ и имплантацией ПС без клеток, на 2 и 12 неделях наблюдения. К 24 неделе различия уменьшались, в основном за счет ухудшения этого показателя в группе с клеточным имплантатом. Соединение было заметно лучше в группе «пустого» контроля в сравнении с группой с имплантаций бесклеточного ПС (Ри 0,05) на всех сроках наблюдения. Обращает внимание также, что этот параметр в группе с имплантацией клеток был хуже, чем в группе без имплантата, причем эти различия нарастали к 24 неделе (Ри 0,05). В группе без имплантата нарушение соединения чаще выражалось в гипоцеллюлярности в зоне соединения и неровностях поверхности. Нарушений непрерывности, фиссур и расщелин между вновь образованной тканью и окружающим хрящом не было. В группе с имплантацией СККМ нарушения соединения выражались в расщелинах. Причем на 6 неделе подобные нарушения были единичными, на 12 неделе расщелины встречались более часто, но по одной стороне регенерата и не доходили до уровня субхондральной пластинки. На 24 неделе расщелины становились более глубокими, со стороны регенерата отмечались участки фиброза.
Заметно лучшие результаты в группе без имплантата мы объясняем особенностями механических свойств ПС, который при движениях в суставе испытывает не только по оси конечности, но и в плоскости суставной поверхности, о чем будет сказано в обсуждении результатов.
По окрашиваемости матрикса ТС имеется статистически достоверная разница Ри 0,05) между группой с имплантацией СККМ и обеим группами контроля (рис. 21) на всех сроках наблюдения. Между группой с имплантацией ПС и без имплантата достоверной разницы нет. 4 3,5-И 3Tl
Окрашиваемость матрикса по Ван Гизон. Измерения даны в баллах по шкале ICRS. Ри 0,05 Оба этих параметра характеризуют способность ХЦ вырабатывать протеогликаны и коллаген II типа, специфический для гиалинового хряща. На основании этих двух параметров можно сказать, что имплантированные клетки дифференцируются в хондральном направлении. Окрашиваемость матрикса ТС и по ВГ сохраняется на одном уровне на всех сроках наблюдения.
Плохое прокрашивание матрикса ТС и грубые коллагеновые фибриллы в группах с имплантацией ПС и без имплантата свидетельствуют о преимущественно фиброзном характере образующейся ткани.
В 6 недель морфология клеток в группе с имплантацией СККМ была максимально приближена к морфологическим характеристикам ХЦ нормального гиалинового хряща. На более поздних сроках наблюдения в этой группе параметр достоверно ухудшался (Ри 0,05). На 12 неделе это проявлялось преимущественно в увеличении количества клеток в составе изогенных групп и нарушении упорядоченности их расположения в виде колонн в радиарной зоне. Через 24 недели после имплантации СККМ отмечалось появление единичных фибробластоподобньгх клеток, еще большее нарушение упорядоченности их расположения. Эти изменения напоминают ситуацию в СХ при ранних сроках ДОА, когда происходит увеличение пролиферативной1 активности ХЦ и увеличения количества клеток в изогенных группах.
Сохранение стабильных параметров окрашивания матрикса ТС и по ВГ, говорит о том, что клетки вновь образованной хрящевой ткани» продолжают продуцировать нормальные компоненты межклеточного матрикса, либо имеющиеся макромолекулы еще не успели разрушиться.
Однако на всех сроках наблюдения имеются достоверные различия группы с имплантацией СККМ от обеих контрольных групп (Ри 0,05). В то время, как различия между группой с имплантацией ПС без клеток и «пустого» контроля не достоверны, динамики их на различных сроках наблюдения нет.
Строение поверхности и глубоких слоев регенерата - два показателя, говорящие о способности вновь образованной ткани выдерживать механическую осевую и тангенциальную нагрузку при движениях сустава. Здесь можно также заметить (рис. 24, 25) тенденцию к некоторому ухудшению этих показателей к группе с имплантацией СККМ (хотя данные статистически не достоверны (Ри 0,05).
Регенерация неполнослойного дефекта суставного хряща после имплантации суспензии стромальных клеток костного мозга
Также можно создать носитель, который бы обладал большей жесткостью. Многочисленные исследования в настоящее время в изучении синтетических носителей (PLA, PLGA и др.), которым можно придать любые механические свойства [123,152,160,166,186,196]. Однако технология их изготовления не позволяет создать имплантат с клеточной массой высокой плотности. Изменить механические свойства ПС может увеличение концентрации тромбина при использовании стандартного набора [48]. Также можно использовать биорастворимый армирующей наполнитель.
Необходимо также отметить, что худшие свойства регенерата были после имплантации ПС без клеток. Особенно примечательно замедленное формирование субхондральной кости в этой группе. По-видимому, близко расположенные нити фибрина в ПС препятствуют прорастанию сосудов, которые необходимы для формирования костной ткани. Хотя в группе в имплантацией ПС с культурой клеток субхондральная кость формировалась уже к 6-й неделе. Островки хрящевой ткани ниже субхондральной пластинки в этой серии показывают, что образование кости происходит с участием МСК по энхондральному типу.
Возможность остеогенной дифференцировки МСК является их преимуществом перед культивированными ХЦ при лечении полнослойных дефектов суставной поверхности.
Однако, ГЩСП встречаются значительно реже неполнослойных. Причем НДСП как правило имеют значительную площадь, иногда на всю нагружаемую поверхность сустава, и окружены дегенеративно измененным хрящом. Использование клеток в носителе при этом сложно выполнимо. Оптимальным в этих условиях является использование МСК в виде суспензии, что значительно упростит методику и стоимость лечения.
Теоретической предпосылкой для второй части нашей работы является предположение о тропности МСК к области повреждения.
Это явление (хоуминг-эффект) в настоящее время активно изучается в кардиологии, неврологии и других областях применения клеточных технологий [77,154,205]. Показано, что МСК экспрессируют на своей поверхности широкий спектр рецепторов к молекулам межклеточного матрикса и другим клеткам. Благодаря этому они могут избирательно и более прочно прикрепляться к местам повреждения тканей и органов.
Мы не встретили в доступной нам литературе экспериментальных исследований с использование пункционного введения МСК в полость сустава. Поэтому эксперимент носил поисковый характер и был проведен на ограниченной группе животных с использованием только одного срока наблюдения.
Как и описано в литературе [7,20,125,142], при изучении НДСП в контрольной группе мы не увидели каких-либо признаков регенерации. Дефект сохранялся таким же, как сразу после формирования. После введения МСК отмечалось формирование новой ткани, по свойствам очень приближенной к нормальному СХ. Объяснить формирование новой ткани можно только тем, что введенные МСК попадают в зону дефекта, адгезируются к поверхности, пролиферируют и дифференцируются в ХЦ. Для того, чтобы доказать преимущественной накопление МСК в зоне повреждения СХ мы провели эксперимент с использованием клеток, прижизненно окрашенных флуоресцентным красителем. Результаты показали, что накопление суспензионно введенных МСК в зоне дефекта СХ в 2 раза превышало таковое в области интактной суставной поверхности, что подтверждает нашу гипотезу.
Необходимо также отметить, что на указанном сроке наблюдения мы не заметили формирования свободных или связанных с тканями сустава хондральных и остеохондральных тел, формирования экзостозов по краям суставной поверхности и других признаков неблагоприятного воздействия суспензионно введенных МСК на сустав.
Преимущественное накопление МСК в зоне дефекта СХ с формированием новой хрящевой ткани и отсутствие неблагоприятного влияния дает нам основание рекомендовать этот метод к клиническому применению. Хотя конечно необходимы дальнейшие исследования подобного эффекта при дегенеративно измененном СХ, а также более длительные сроки наблюдения.
Кроме того, необходимо исследовать возможности по увеличению адгезии МСК к области дефекта. Одной из таких возможностей может быть удаление с поверхности поврежденного СХ отрицательно заряженных молекул протеогликанов, например путем внутрисуставного введения и кратковременной экспозиции раствора трипсина или других протеолитических ферментов. Это может увеличить вероятность прикрепления МСК, которые также имеют отрицательно заряженную поверхность.
Влияние МСК на регенерацию СХ путем продукции специфических цитокинов также не исключено и нуждается в дальнейшем изучении.
Еще один вопрос, которого хотелось бы коснуться в обсуждении результатов, касается природы вводимых клеток. Метод получения МСК путем адгезии к культуральному пластику в настоящее время широко используется в научных исследованиях и клинической практике [53,65,136,147,165]. В то же время практически все исследователи, начиная с A.Friedenstein указывают, что получаемая в итоге популяция клеток очень неоднородна. Многочисленные попытки выделить специфический клеточный антиген, который бы однозначно указывал на МСК, а также получить чистую культуру этих клеток пока не увенчались успехом. Характеризация полученной культуры различными маркерами, по нашему мнению, не имеет большого значения. Несмотря на видимую однородность
106 полученной популяции, клетки показывают различную способность к дифференцировке в специфических средах [145,147,164]. Но и опыты in vitro не могут достоверно показать дифференцировочный потенциал полученных клеток, так как условия в живом организма значительно отличаются от лабораторных. Истинную мультипотентность и, соответственно, стволовые свойства клеток, могут в настоящее время доказать только дорогостоящие опыты с имплантацией в организм.
Однако, несмотря на имеющиеся противоречивые данные о природе МСК и их свойствах, существование среди стромальных элементов КМ клеток, обладающих способностью к хондрогенной дифференцировке не взывает сомнения. Также можно считать доказанным, что эти клетки можно выделить из КМ путем адгезии. Поэтому в описании результатов исследования мы использовали термин «стромальные клетки костного мозга» (СККМ), подразумевая гетерогенную популяцию клеток, среди которых имеются МСК, способные в соответствующих условиях дифференцироваться в клетки суставного хряща.
