Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10-32
1.1 Механическая желтуха, современное состояние проблемы 10-21
1.2 Экспериментальное моделирование механической желтухи 22-23
1.3 Атомно-силовая микроскопия и ее роль в изучении плазматических мембран 23-28
1.4 Электронная спектроскопия в диагностике метаболических нарушений 28-30
Глава 2. Материалы и методы 33-54
2.1. Экспериментальные исследования 33-41
2.1.1 Разработка экспериментальной модели механической желтухи 34-37
2.1.2 Разработка способа оценки тяжести механической желтухи 37-41
2.2 Лабораторные методы исследования 41-53
2.2.1 Биохимические методы исследования 41-41
2.2.2 Морфологичекие методы исследования 41-42
2.2.3 Метод атомно-силовой микроскопии 42-51
2.2.4 Метод аналитической электронной микроскопии 52-53
2.3 Методы математического анализа 53-54
Глава 3. Возможности применения атомно-силовой микроскопии в оценке тяжести механической желтухи и развития печеночной недостаточности 55-81
3.1. Результаты атомно-силовой микроскопии эритроцита в зависимости степени тяжести механической желтухи и наличия печеночной недостаточности 55-63
3.2. Результаты морфогистологических исследований ткани печени в зависимости степени тяжести механической желтухи и наличия печеночной недостаточности 63-72
3.3 Диагностическая значимость атомно-силовой микроскопии в прогнозировании развитии печеночно-клеточной недостаточности на фоне МЖ 73-80
3.4 Компьютерная программа «Определение риска развития печеночной недостаточности в эксперименте у животных с механической желтухой разной степени тяжести» 80-81
Глава 4. Электронная микроскопия и ее диагностическая ценность при механической желтухе 82-91
4.1. Результаты электронной микроскопии эритроцита в зависимости от степени тяжести механической желтухе 82-89
4.2. Оценка значимости результатов электронной спектроскопии эритроцита в зависимости от степени тяжести механической желтухи и наличия печеночной недостаточности 89-91
Заключение 92-98
Выводы 99
Практические рекомендации 100
Список сокращений 101
Список литературы 102-129
- Атомно-силовая микроскопия и ее роль в изучении плазматических мембран
- Результаты атомно-силовой микроскопии эритроцита в зависимости степени тяжести механической желтухи и наличия печеночной недостаточности
- Диагностическая значимость атомно-силовой микроскопии в прогнозировании развитии печеночно-клеточной недостаточности на фоне МЖ
- Результаты электронной микроскопии эритроцита в зависимости от степени тяжести механической желтухе
Атомно-силовая микроскопия и ее роль в изучении плазматических мембран
Изобретение атомно-силовой микроскопии, являющейся разновидностью сканирующей зондовой микроскопии, было удостоено присуждения нобелевской премии по физике первооткрывателям Г. Биннингом и Г. Рорером в 1986 году [148].
В основе процесса лежит взаимодействие сил притяжения и отталкивания между зондом и поверхностью образца. Высокое разрешение достигается путем использования миниатюрного зонда и высоким разрешением детектирующей системы. Несомненно, положительным моментом является возможность применения микроскопии в медицине для изучения живых объектов [6].
Однако целью создания и разработки атомно-силовой микроскопии было изучение твердых тел, кристаллов и атомов в различных областях физики и химии. В дальнейшем была продемонстрирована возможность исследования биополимеров на примере визуализации молекулы ДНК [221].
Возможность сохранить живой объект при микроскопии, не разрушая клеточную мембрану, достигается тем, что данная методика не требует создания вакуума. Высокая степень разрешения, вплоть до нанометров, сопоставима только с рентгенструктурным анализом, однако, последний требует проводить кристаллизацию объектов [49].
Основные преимущества атомно-силовой микроскопии заключаются в следующем: нет необходимости специальной подготовки исследуемого биоматериала; возможность проведения микроскопии на воздухе или в жидкой среде без разрушения клеточной мембраны; достигается высокая степень разрешения с иллюстрацией поверхности изучаемого объекта до нанометров; возможность исследования жесткости, пластичности и адгезивности клеточной мембраны [50].
Необходимым условием проведения атомно-силовой микроскопии является фиксация биоматериала на подложке. В качестве подложки может быть использован различный материал: слюда, графит и другие слоистые материалы, а также различные стекла, полимерные материалы и металлические поверхности [63].
Способ измерения и фиксации силового взаимодействия зонда достигается путем контактной АСМ либо микроскопией прерывистого контакта [62].
Атомно-силовая микроскопия может быть применена для изучения структуры и локальных механических свойств клеток. С помощью атомно силового микроскопа становится реальным изучение адгезии клеток к различным субстратам. Определились области медико-биологических исследований, для которых метод АСМ является наиболее перспективным.
Прежде всего, это изучение нативных цитологических структур и механизмов их функционирования путем оценки физических свойств их поверхности.
Конструкция АСМ позволяет реализовать сразу несколько различных модификаций анализа. Результатом микроскопии является трехмерное топографическое изображение поверхности изучаемого объекта.
Одновременно можно регистрировать и другие характеристики, которые зависят от локальных физических свойств поверхности. Таким образом, различия в свойствах можно картировать и комбинировать их с изображением формы объекта. Например, АСМ позволяет определять распределение поверхностного потенциала на мембранах, эластичность и мобильность мембранных слоев, их адгезивные свойства [26].
Кроме изучения структурных свойств клеточной мембраны, есть возможность исследовать функциональные возможности на примере упруго-вязкостных свойств клеточной мембраны в условиях физиологического и патологического состояния [34].
В течение последнего десятилетия АСМ с успехом применялась для исследования многих биологических объектов, находящихся в нативном состоянии. В 1993 году с помощью АСМ было получено изображение мембраны гепатоцитов [43]. Была показана перспективность АСМ в изучении микроорганизмов. С помощью АСМ зарегистрировано изменение структуры липополисахаридов клеточной стенки бактерий Е.coli. Благодаря экспериментам с Е.coli, методом АСМ были изучены основные процессы, происходящие с клетками: рост, деление, деградация, бактериолиз и др. [200].
Методами атомно-силовой микроскопии исследованы также другие бактерии.
С помощью АСМ были определены ротавирусы и риккетсии, иммуносорбированные на полимер-антительные пленки. Атомно-силовая микроскопия продемонстрировала возможность наблюдения динамических изменений в структуре бактерий. В работе Оберлейтнера Г. приведены результаты прямых наблюдений образования микропор в бактериальной стенке при воздействии ионов кальция. В 1996 году метод АСМ с успехом впервые применен для исследования хромосом [87].
В настоящее время идет активное изучение состояния клеток эпидермиса при различных патологиях кожи, а также межклеточного взаимодействия в системе коллаген–вода–протеогликаны методом АСМ, при таких патологиях как акантолитическая пузырчатка, псориаз. Доказано достоверное изменение взаимодействия межклеточного матрикса кожи, что приводит к появлению клинических симптомов данных заболеваний [40].
Имеет место использования АСМ в исследовании особенностей рельефа биомембран клеток кожи при различной приобретенной патологии: рубцы, дисторофические изменения, возрастные изменения [64, 84].
Система крови — одна из важнейших гомеостатических систем организма. Возникающие в ней патологические процессы могут быть как проявлениями критических и терминальных состояний, так и причинами развития последних. Именно поэтому клетки крови, и в первую очередь эритроциты, являются постоянным объектом для биологических и медицинских исследований. В научной литературе широко представлены различные способы исследования формы и размеров эритроцитов с использованием методов световой и электронной микроскопии [75, 230].
Структура эритроцита методом АСМ была изучена в 1998г. Морфология эритроцитов с помощью метода АСМ была изучена Т.Г. Матюхиной, при этом АСМ позволила одновременно с анализом общей формы провести исследование и тонкой структуры мембранной поверхности. На поверхности были выявлены выступающие глобулы и эллипсоиды разного размера, которые интерпретированы как выступающие части интегральных и полуинтегральных мембранных белков, что полностью согласуется с жидкостно-мозаичной моделью строения мембраны [237].
N. Kubo и соавт. исследовали эритроциты больных аутоиммунной гемолитической анемией с целью визуализации антиэритроцитарных аутоантител на поверхности мембран эритроцитов. Полученные сканы позволили визуализировать белки класса IgG в виде возвышающихся над поверхностью мембраны образований диаметром до 40 нм. В своем сообщении японские исследователи отмечают перспективность изучения мембран эритроцитов методом АСМ для лучшего понимания природы аутоиммунных заболеваний [242].
А. Ebner и соавт. изучили структурные и механические параметры эритроцитов больных муковисцидозом и системной красной волчанкой. АСМ позволила выявить изменения поверхности мембран клеток и структурную перестройку их цитоскелета с образованием зон локального уплотнения [165].
О. Hekele и соавт. провели АСМ-исследование эритроцитов для определения структуры и эластических свойств мембран клеток у больных хронической почечной недостаточностью с анемией на фоне приема эритропоэтина, при этом достоверных различий с эритроцитами здоровых доноров выявлено не было. При этом у одного из обследованных контрольной группы было выявлено значимое упрочнение мембран эритроцитов и снижение их эластичности, при более детальном клиническом обследовании у него была выявлена латентная форма сахарного диабета. Патологическим изменениям структуры мембран эритроцитов при сахарном диабете посвящен ряд отдельных исследований. Методом АСМ у больных с гипергликемией определены особенности рельефа поверхности мембран эритроцитов, выявлено увеличение их жесткости. Указанные изменения структуры клеток при сахарном диабете определяют изменения реологических свойств крови и имеют четкую корреляционную связь с выраженностью расстройства микроциркуляции [245].
Результаты атомно-силовой микроскопии эритроцита в зависимости степени тяжести механической желтухи и наличия печеночной недостаточности
В данном разделе работы представлены результаты исследования нативных образцов крови у 36 мини-пигов при МЖ разной степени тяжести.
Для анализа сканов использовали метод мазка крови, чтобы исключить механическое воздействие соседних клеток и искажение их морфологии. Число клеток для анализа варьировало в пределах 50-60 эритроцитов, при этом, каждый эритроцит был просканирован как минимум дважды: первый раз – клетка целиком, второй раз – структурный анализ мембраны клетки.
Эритроциты здоровых минипигов (n=7) имели форму двояковогнутого сфероцита с четко контурированной мембраной и цитоплазмой однородной структуры. Мембрана эритроцита имела трехслойное строение, внутриклеточное содержимое равномерной электронной плотности и мелкозернистой структуры. На рисунке 3.1 представлено трехмерное изображение эритроцита, на рисунке 3.2. - линейные размеры эритроцита, наиболее показательным параметром которых является глубина ямки.
У животных при моделировании МЖ с легкой степенью тяжести (n=9) билирубин увеличивался до 11,00 [8,00; 11,50] мкмоль/л, р=0,02, активность ГГТ 65,0 [40,00; 71,00] Ед/л, р=0,004. Форма цитоскелета эритроцита животных имела форму двояковогнутого дискоцита в 80-90%. С нарастанием билирубинемии форма цитоскелета эритроцита менялась, причем при МЖ с легкой степенью тяжести статистически значимых изменений морфологии клетки не выявлено (рис.3.3, 3.4).
У животных с моделируемой МЖ средней степени тяжести (n=10) значение билирубина увеличилось до 36,5 [25,25; 45,50] мкмоль/л, р=0,007, ГГТ 165,5 [138,75; 301,25], р 0,001. Статистически значимо менялась форма эритроцита, он приобретал горизонтальную ориентацию, появлялись шиповидные выросты на билипидном слое мембраны (рис.3.5, 3.6).
У экспериментальных животных с МЖ тяжелой степени тяжести (n=10) показатель билирубина был 96,0 [77,50; 171,00], при р=0,009, ГГТ 439,0 [375,75; 538,00], р=0,003. На фоне увеличения тяжести МЖ трансформация эритроцита нарастает. На рисунках 3.7 и 3.8 иллюстрированы вертикальные срезы трехмерного изображения эритроцита, полученные при АСМ, которые отражают трансформацию эритроцита на высоте билирубинемии.
Расчет объема эритроцита рассчитывался по следующим линейным параметрам: ширина, длина, высота и наличие ямки, данные представлены в таблице 3.1.
Согласно полученным данным, цитоскелет эритроцита менялся следующим образом: прогиб мембраны в центре уменьшался и происходило увеличение объема эритроцита, при этом площадь под эритроцитом практически не изменялась (таблица 3.2).
Срез мембраны эритроцита при МЖ средней степени тяжести находился между срезами эритроцитов легкой и тяжелой, но срез не отражен на рисунке, поскольку создает множество пересечений с другими графиками.
Исследование шероховатости поверхности сканов эритроцита с использованием встроенного программного обеспечения NOVA АСМ микроскопа показало, что с нарастанием тяжести заболевания средняя шероховатость уменьшается с 40-44 до 26-30 нм, а дисперсия монотонно уменьшается с 112 до 84 нм2. В качестве области анализа шероховатости бралась только область мембраны эритроцита. Данные по шероховатости косвенно подтверждают уменьшение островершинности мембран эритроцитов.
Наряду с клетками, имеющими четко контурированную мембрану и цитоплазму однородной структуры, в периферической крови появляются эритроциты с шиповидными выростами на билипидном слое мембраны, увеличивается количество нарушений целостности мембраны, наличие шиповидных выростов на билипидном слое становится значительно больше.
По всей видимости, увеличение в крови количества трансформированных эритроцитов у животных с моделированной МЖ не является случайным фактом, нарушение структуры эритроцита обусловлено состоянием катион-транспортирующих систем, сбалансированностью молекулярной организации белковых и липидных компонентов мембраны эритроцита и уровнем АТФ. Эндогенная интоксикация, развивающаяся на фоне МЖ нарушает биохимические процессы, что в свою очередь вызывает изменения структуры мембраны и метаболизма в функционировании эритроцита.
Программа Image Analysis АСМ Integra Aura позволила определить геометрические параметры эритроцита. При определения геометрических параметров эритроцита был применен математический анализ и разработаны формулы, позволяющие определить площадь и объем эритроцита и показатели внутриклеточного давления.
Средняя площадь эритроцита у животных с моделируемой МЖ практически не изменялась, в то же время объем эритроцитов существенно нарастал и у животных с МЖ тяжелой степени тяжести составил 12,3±2,6 мкм3. Представляются интересными данные по увеличению внутриклеточного давления в эритроците. Причем увеличение давления происходило на фоне увеличения объема эритроцита (таблица 3.3).
Диагностическая значимость атомно-силовой микроскопии в прогнозировании развитии печеночно-клеточной недостаточности на фоне МЖ
Для прогнозирования развития ПН при разной степени тяжести МЖ на основе факторного анализа были разработаны формулы расчета индекса печеночной недостаточности. Первая формула включает в себя показатели концентрации свободного билирубина, ГГТ, АЛТ и АСТ: где, y – индекс печеночной недостаточности, СБ – концентрация общего билирубина, ГГТ – значения гаммаглютамилтрансферазы, АЛТ –значения аланинаминотрасферазы, АСТ–значения аспартатаминотрансферазы.
При апробировании данной формулы для расчета индекса печеночной недостаточности в зависимости от ее наличия были получены значения данного индекса, представленные в таблице 3.4.
На рисунке 3.3. - представлено графическое изображение наличия ПН при использовании разработанной формулы.
В связи с тем, что индекс ПН статистически значимо отличается между группами с наличием и отсутствием печеночной недостаточности (p 0,001), данный показатель может быть использован для диагностики печеночной недостаточности при первичном осмотре экспериментального животного с целью отбора группы биологических моделей для более углубленного обследования.
Для определения диагностической границы индекса ПН с целью диагностики данной патологии был использован ROC-анализ (рисунок 3.4). По результатам данного анализа площадь под характеристической кривой составила 0,919±0,044 [0,832; 1,000], что статистически значимо отличается от площади 0,50 (p 0,001).
В связи с тем, что использование индекса печеночной недостаточности, рассчитываемого по формуле 1, предполагается на первичном отборе при осмотре экспериментального животного, т.е. для отбора животных для дальнейшего обследования в отношении наличия или отсутствия печеночной недостаточности уже с применением более дорогостоящих методов исследования для выбора диагностической границы необходима граница с высоким значением чувствительности. Наиболее оптимальные значения чувствительности и специфичности были получены при границе 0,40 (чувствительность составила 100,0%, специфичность – 50,0%). Таким образом, при использовании формулы 1 для расчета индекса печеночной недостаточности при получении результата более 0,40 можно с высокой степенью вероятности предположить у животного на первичном осмотре наличие печеночной недостаточности.
Полученные нами данные приведены в таблице 3.5.
Чтобы получить более специфичный метод диагностики печеночной недостаточности, который бы позволял с полной уверенностью назначать патогенетическое лечение по поводу наличия печеночной недостаточности нами предложена вторая формула, которая включает в себя показатели концентрации свободного билирубина, ГГТ, АЛТ, АСТ и дополнительно относительный объем эритроцитов: где, y – индекс печеночной недостаточности, СБ – концентрация общего билирубина, ГГТ- значения гаммаглютамилтрансферазы, АЛТ –значения аланинаминотрасферазы, АСТ – значения аспартатаминотрансферазы.V – относительный объем эритроцитов.
При использовании данной формулы для расчета индекса печеночной недостаточности в зависимости от ее наличия были получены значения данного индекса, представленные в таблице 3.6.
В связи с тем, что индекс печеночной недостаточности, рассчитываемый с использованием формулы 2 также статистически значимо отличается между группами с наличием и отсутствием печеночной недостаточности (p 0,001), данный показатель может быть использован для диагностики печеночной недостаточности с целью назначения животным патогенетического лечения (рисунок 3.5).
Для определения оптимальной границы индекса печеночной недостаточности с целью диагностики данной патологии был использован ROC-анализ (рисунок 3.6). По результатам данного анализа площадь под характеристической кривой составила 0,928±0,041 [0,847; 1,000], что статистически значимо отличается от площади 0,500 (p 0,001).
В связи с тем, что использование индекса печеночной недостаточности, рассчитываемого по формуле 2, предполагается в случае более углубленного изучения состояния животного, то для выбора диагностической границы необходима граница с высоким значением специфичности. Наиболее оптимальные значения чувствительности и специфичности были получены при границе 1,80 (чувствительность составила 75,0%, специфичность – 100,0%). В связи с этим, при использовании формулы 2 для расчета индекса печеночной недостаточности при получении результата менее 1,80 можно с высокой степенью вероятности исключить у экспериментального животного наличие печеночной недостаточности.
Полученные нами данные по второй формуле приведены в таблице 3.7. Таким образом, использование формулы 1 на этапе и граничного значения индекса печеночной недостаточности, обеспечивающего высокую чувствительность, позволяет назначить экспериментальному животному более информативное исследование методом атомно-силовой микроскопии, а затем использование формулы 2 уже на стационарном этапе и граничного значения индекса печеночной недостаточности, обеспечивающего высокую специфичность, позволяет с высокой вероятностью диагностировать наличие печеночной недостаточности или ее отсутствие, а значит назначить животному своевременное патогенетической лечение.
Таким образом, способ определения наличия и прогнозирования развития ПН в эксперименте при МЖ разной степени тяжести с использованием АСМ, подтвержденный гистологическими данными, позволяет: оценить функциональное состояние эритроцитов, определить интенсивность нарушения в ионных каналах клетки, возможность дифференцировать степень тяжести состояния экспериментального животного в зависимости от которой определить выбор тактики ведения животного.
На основании вышеперечисленного разработан алгоритм диагностики печеночной недостаточности при МЖ разной степени тяжести (рис.3.7).
Результаты электронной микроскопии эритроцита в зависимости от степени тяжести механической желтухе
В данном разделе работы представлены результаты исследования нативных образцов крови у 36 мини-пигов при МЖ разной степени тяжести.
Эритроциты здоровых минипигов (n=7) имели форму двояковогнутого сфероцита с четко контурированной мембраной и цитоплазмой однородной структуры. На рисунке 4.1 представлено графическое изображение эритроцита, на рис 4.2 графическое спектральное изображение эритроцита по кислороду, этот элемент был выбран, как графически отражающий более наглядно изменения в клетке, основной функцией которой является газобменная. На рисунке 4.3. – оценочная расшифровка химического состава клетки, которая проводилась по следующим точкам, как наиболее значимым: натрий, кальций, азот, кислород, калий.
У животных при моделировании МЖ легкой степени тяжести с нарастанием билирубинемии изменялась форма эритроцита, мембрана клетки становилась менее выраженная. Менялся химический состав клетки, причем при МЖ легкой степени тяжести статистически значимых изменений в химическом составе клетки не выявлено (рисунок 4.4, 4.5, 4.6).
У животных с моделируемой МЖ средней степени тяжести происходило изменение формы сфероцита. Статистически значимо менялся химический состав клетки, уменьшается внутриклеточное содержание O, K, Na (рисунок 4.7, 4.8, 4.9).
У экспериментальных животных с МЖ тяжелой степени тяжести на фоне увеличения тяжести МЖ достоверно меняется химический состав клетки. На рисунках 4.10, 4.11 и 4.12 представлены графические изображения эритроцита, полученные при электронной спектроскопии, которые отражают значительное уменьшение в клетках кислорода на высоте билирубинемии.
Согласно современным представлениям об эндогенной эндотоксимии, оценочная расшифровка химического состава проводилась по следующим точкам, как наиболее значимым: натрий, кальций, азот, кислород, калий, данные представлены в таблице 4.1.
Согласно полученным данным, химический состав эритроцита менялся следующим образом: с увеличением тяжести МЖ меняется концентрация практически всех представленных элементов. Уменьшается концентрация натрия с нарастанием степени тяжести МЖ, достоверно изменяется концентрация кислорода и азота внутри клетки. Что касается концентрации таких элементов, как кальций и калий, то до МЖ средней степени тяжести, отмечается снижение концентрации этих элементов, а при МЖ тяжелой степени тяжести концентрация резко возрастает. Та же тенденция отмечается по отношению к углероду, имея уже достоверное значение.
По всей видимости, нарушение структуры эритроцита обусловлено состоянием катион-транспортирующих систем, сбалансированностью молекулярной организации белковых и липидных компонентов мембраны эритроцита и уровнем АТФ. Эндогенная интоксикация, развивающаяся на фоне МЖ нарушает биохимические процессы, что в свою очередь вызывает изменения структуры мембраны и метаболизма в функционировании эритроцита.
Программа QUANTAX 70 позволила определить спектральный состав эритроцита. При определении концентрации элементов эритроцита был применен математический анализ.
Таким образом, при механической желтухе меняется химический состав эритроцита, достоверно уменьшается концентрация кислорода в клетке эритроцита, помимо этого имеется тенденция к снижению концентрации калия и натрия. Структурные и физиологические особенности системы эритрон, а также доступность для исследования делают эритроцит чрезвычайно удобной моделью для изучения действия экзо-, эндогенных факторов и позволяют использовать эритроцит в качестве своеобразного информативного тест-объекта для оценки состояния организма при различных патологических процессах. Дальнейшее исследование изменений химического состава эритроцита при разной степени тяжести МЖ с позиции работы ионных каналов и особенностей эндотоксимии, позволит изучить проблему развития ПН при МЖ, выявить особенности патогенеза и морфогенеза и найти путь ее решения.