Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Резекция желудка в хирургическом лечении рака и роль молекулярно генетического исследования в прогнозе развития рецидива рака желудка15
1.1 Субтотальная дистальная резекция желудка при раке 15
1.2. Субтотальная проксимальная резекция при раке23
1.3.Рецидив рака желудка 25
1.3.1. Рецидив рака желудка по линии резекции 28
1.3.2. Рецидив вне линии резекции 29
1.3.3. Дисплазия – как предпосылка для развития рецидива опухоли 30
1.3.4. Экзогастральные рецидивы опухоли 31
1.3.5. Факторы риска развития рецидивов 32
1.4. Хирургическое лечение рецидивов рака желудка и его результаты 34
1.4.1. Хирургическое лечение рецидивов рака желудка после дистальной резекции 34
1.4.2. Хирургическое лечение рецидивов рака желудка после проксимальной р е-зекции 35
1.4.3. Тактика лечения больных при обнаружении опухолевых клеток по линии резекции
1.5. Современные подходы в диагностике рака желудка 37
1.6. Молекулярный патогенез рака желудка 1.6.1. Ген Е- кадгерина (CDH1) 40
1.6.2. Опухолевый протеин р53 (TP53) 41
1.6.3. Ген -катенина (CTNNB1) 42
1.6.4. Ген RUN- связанный фактор транскрипции 3 (RUNX3) 42
1.6.5. Микросателлитная нестабильность43
1.6.6. Ген ERBB2 44
1.6.7. Эпигенетические процессы как механизм регуляции генов з
Глава 2. Общая характеристика клинических наблюдений и методов исследования46
2.1. Характеристика группы исследования 46
2.2. Классификации, используемые в работе 49
2.3. Общая характеристика клинических методов исследования и лечения
2.3.1. Особенности предоперационной подготовки больных 54
2.3.2. Выбор оперативного вмешательства 55
2.3.3. Послеоперационный мониторинг больных 58
2.4. Молекулярно-генетические маркеры 58
2.4.1. Тканевой материал 60
2.4.2. Методы исследования. Анализ метилирования генов CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK. Выделение геномной ДНК их опухолевого материала61
2.4.3. Анализ метилирования гена RUNX3
2.5. Приборы, реактивы и компьютерные программы 65
2.6. Статистическая обработка результатов 67
Глава 3. Результаты хирургического лечения больных, перенесших резекцию желудка по поводу рака68
3.1. Характеристика выполнены[ оперативных вмешательств 68
3.1.1. Характеристика радикальности выполненных операций 68
3.1.2. Послеоперационное химиотерапевтическое лечение 79
3.1.3. Комбинированные вмешательства 80
3.2. Характеристика послеоперационных осложнений 85
3.3. Анализ выживаемости больных, перенесших различные виды резекции ж е-лудка по поводу рака87
Глава 4. Исследование молекулярно - генетических маркеров в неизмененной слизистой культи желудка у больных, оперированных по поводу рака в объеме резекции100
Заключение 114 Выводы 122
Практические рекомендации 124
Список литературы 125
- Субтотальная проксимальная резекция при раке
- Микросателлитная нестабильность
- Методы исследования. Анализ метилирования генов CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK. Выделение геномной ДНК их опухолевого материала
- Анализ выживаемости больных, перенесших различные виды резекции ж е-лудка по поводу рака
Введение к работе
Актуальность темы.
В структуре онкологической смертности населения России рак желудка занимает второе место. В среднем, в России ежедневно выявляется 144 новых больных [Аксель Е.М., Давыдов М.И., 2010г].
Основным фактором прогноза при лечении рака желудка являются
объем хирургического вмешательства и установление стадии заболевания
[Черноусов А.Ф. соавт., 2004г]. В настоящее время субтотальная
дистальная резекция желудка может быть выполнена ез ущерба дл
радикальности ри условии чистоты инии резекции адекватной
лимфаденэктомии [Чиссов В.И., Александрова Л.М., 2010г]. Что касается
реконструктивного этапа операции, то основными требованиями к нему
являются низкая чстота послеоперационных осложнений, связанных
наложением анастомоза, а также физиологичность, обеспечивающая
минимум постгастрорезекционных расстройств минимальный иск
развития метахронного рака улти желудка. Субтотальная дистальная
резекция желудка по Бильрот-I при раке обеспечивает, как необходимый
объем резекции органа, так и хорошие непосредственные и отдаленные
результаты, о подтверждено многочисленными исследованиями
ближайших и отдаленных результатов [Черноусов А.Ф., Поликарпов С.А., 2004г].
Накопленный в мире опыт позволяет отметить, что сегодня методом
выбора лечении рака проксимального отдела желудка остается
хирургический. Проксимальная субтотальная резекция желудка может быть выполнена при небольших размерах опухоли (диаметром не более 4 см), локализующихся в проксимальном отделе без распространения на верхнюю треть тела желудка, а также при раннем рке верхней трети желудка [Давыдов М.И. и соавт., 2008г].
Рецидив рака желудка после хирургического лечения возможен даже при выполнении операции в объеме R0 и существенно ухудшает отдаленный
прогноз. На возникновение локорегионарных метастазов влияет не только снижение объема радикализма, но и прогрессирование опухолевого процесса. Рецидив рака желудка, в отличие от первичной опухоли , характеризуются большей агрессивностью, выражающейся в склонности к инфильтративному росту, высокой степенью инвазивности, частым прорастанием в окружающие органы и отдаленным метастазированием [Давыдов М.И. и соавт., 2008г].
Улучшение результатов лечения рака желудка во многом связывают с
улучшением ранней диагностики. Однако, ранние формы этого
онкологического заболевания характеризуются отсутствием
патогномоничных клинических симптомов, а возможности лабораторных методов диагностики недостаточны.
Улучшение раннего выявления опухолей желудка связывают с
необходимостью использования дополнительных критериев и новых методов
диагностики в клинической практике. В последнее время в связи со
значительным прогрессом, достигнутым в области изучения канцерогенеза,
все большее значение начинают приобретать молекулярно-генетические
маркеры, основанные на использовании ДНК- и РНК-технологий.
Определение молекулярных маркеров п роводится в оп ерационном
материале, полученном в процессе хирургического лечения или в биоптатах,
полученных посредством эндоскопического исследования, с последующим
или предварительным морфологическим контролем. К молекулярно-
генетическим маркерам относятся структурные и функциональные
повреждения, выявляемые в геноме опухоле вой клетки. Повреждения ДНК
или РНК опухолевых клеток приводят к изменению генной экспрессии, в
результате чего происходит нарушение регуляции клеточного цикла,
изменение спектра адгезионных белков, активация факторов
неоангиогенеза, повышение показателей метастатической и инвазивной активности опухолевых клеток. [Залетаев Д.В., Стрельников В.В., Немцова М.В., 2011г].
Молекулярно-генетические онкологические маркеры обладают достаточной степенью чувствительности и специфичности, они просты в лабораторном исследовании. Однако их внедрение в клиническую практику требует тщательной научной разработки и подготовки.
Несмотря на схожие механизмы регуляции каждая опухоль является уникальной, ее развитие и прогрессия модифицируется особенностями генома конкретного пациента и ее собственным молекулярным патогенезом, поэтому единого универсального маркера для диагностики злокачественных опухолей в настоящее время не существует. Разработка комплексных систем диагностических и прогностических маркеров, которые включают молекулярно-генетические, иммуногистохимические и биохимические, позволит получить дополнительную информацию, необходимую для эффективной диагностики, лечения и послеоперационного мониторинга пациентов с раком желудка. [М.В. Немцова и соавт., 2013г].
Цель работы.
Целью данной работы является исследование морфологически неизмененной слизистой культи желудка больных, еренесших его резекцию по поводу рака для послеоперационного мониторинга, используя систему молекулярно-генетических маркеров.
Задачи работы.
1. Оценить отдаленные результаты оперативного лечения в зависимости
от характера опухолевого процесса и вида выполненной операции.
после дистальной субтотальной резекции желудка
после проксимальной резекции желудка
-
Провести анализ эффективности комплексного лечения больных, оперированных по поводу рака в объеме субтотальной резекции.
-
Оценить молекулярно-генетические изменения (аномальное метилирование генов CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAP К, RUNX3) в биоптатах слизистой культи желудка у больных, ранее оперированных по поводу рака
-
Провести анализ корреляции молекулярно-генетических изменений в биоптатах слизистой культи желудка у ранее оперированных больных с такими характеристиками опухоли, как глубина инвазии стенки желудка, степень дифференцировки, размер первичной опухоли, прохождение линии резекции в зоне первичной опухоли.
-
Оценить перспективы использования системы молекулярно-генетических маркеров ачестве прогностической ля оценки риска генерализации процесса и развития рецидива.
Научная новизна.
Впервые проведено комплексное исследование аномального
метилирования генов CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAP К, RUNX3 в
послеоперационных биоптатах слизистой культи желудка, полученных при
эндоскопическом исследовании у больных, оперированных объеме
субтотальной резекции. В результате проведенного исследования показана связь молекулярной патологии возможным развитием генерализации опухолевого процесса. Показано, что молекулярно-генетические изменения возникают о негативных клинических проявлений у ациентов, ри отсутствии опухолевых клеток в биоптатах. На основании полученных данных показано, что исследуемые молекулярно-генетические маркеры могут быть использованы в качестве дополнительных для прогнозирования течения опухолевого процесса у ранее оперированных больных.
С целью оценки результатов оперативного лечения в зависимости от характера опухолевого процесса и вида выполненной операции (дистальной субтотальной резекции желудка или проксимальной резекции желудка), проведен анализ эффективности комбинированного лечения больных и оценены отдаленные результаты. С учетом данных молекулярно-генетического анализа подтверждено, что выполнение резекций желудка в объеме R0 и ри условии расширенной лимфаденэктомии не олько правомочно, но и не снижает степень онкологического радикализма и качества жизни у больных раком желудка.
Практическая значимость.
Изучены отдаленные результаты хирургического лечения больных раком желудка. Доказано, что выполнение оперативного вмешательства в объеме резекций (субтотальной дистальной по Бильрот-1 или проксимальной) при условии отсутствия опухолевых клеток в краях резекций и адекватной лимфаденэктомии правомочно и не приводит к развитию локорегионарных рецидивов или генерализации опухолевого процесса.
Показано, что выполнение заведомо циторедуктивных операций вследствие распространенности опухолевого процесса или наличия тяжелых конкурирующих заболеваний в сочетании с послеоперационной системной химиотерапией позволяет продлить жизнь пациентам, не снижая ее качества.
Проведено комплексное исследование эпигенетических изменений в
послеоперационных биоптатах слизистой культи желудка, полученных при
эндоскопическом исследовании. В результате исследования показано, что
аномальное метилирование генов N33, CDH1 и RUNX3 является маркерами
неблагоприятного прогноза, развития генерализации опухолевого процесса,
при ониторинге оперированных больных. Выявлены ассоциации
молекулярно-генетических повреждений такими клиническими
характеристиками, как наличие отдаленных метастазов (р=0,0462), наличие сопутствующих заболеваний желудочно-кишечного ракта (р=0,0077), частности атрофического гастрита (р=0, 0378), а также с высоким риском генерализации опухолевого процесса (р=0,029), что позволить использовать анализ молекулярных изменений в качестве дополнительных маркеров прогноза у ранее оперированных больных.
Предложенные ДНК-маркеры позволяют дополнить морфологические и биохимические исследования, которые используется в настоящее время для послеоперационного мониторинга больных.
Апробация работы.
Диссертация апробирована 05.03.2014 года на кафедре факультетской хирургии №1 лечебного факультета Первого МГМУ имени И.М. Сеченова.
Материалы диссертации были представлены и обсуждены:
На конференции «Актуальные проблемы онкогенетики» (Москва, 26-28 октября 2011 г)
На XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 23-27 апреля 2012г)
На XVII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 12-14 ноября 2013г)
Номинант в категории «Лучший проект года», подноминации «Лучший научно-исследовательский проект» Всероссийской премии области онкологии ассоциации онкологов России IN VITA VERITAS (Санкт-Петербург, 12 сентября 2013г)
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Научные положения диссертации соответствуют паспорту
специальности 14.01.17 - хирургия (медицинские науки). Хирургия - область
медицинской науки, изучающая заболевания и повреждения, в лечении
которых важнейшее значение приобретают методы кровавого и бескровного
оперативного вмешательства. Создание овой хирургической техники,
разработка новых оперативных вмешательств новых хирургических
технологий, а также совершенствование методов профилактики, ранней
диагностики и лечение хирургических болезней удут способствовать
сохранению здоровья населения, сокращению сроков временной
нетрудоспособности восстановлению трудоспособности. Области
исследования - изучение ичин, механизмов развития распространенности хирургических заболеваний; разработка усовершенствование методов диагностики и предупреждения хирургических заболеваний; обобщение интернационального опыта, разных хирургических школ и отдельных хирургов; экспериментальная и клиническая разработка методов лечения хирургических болезней и их внедрение в клиническую практику; усовершенствование методов диспансеризации и профилактики хирургических заболеваний.
Научные положения диссертации соответствуют паспорту научной специальности 03.02.07 – генетика (медицинские науки). Генетика - это область науки, изучающая явления изменчивости и наследственности, закономерности процессов хранения, передачи и реализации генетической информации на молекулярном, клеточном, организменном и популяционном уровне. Области исследования: молекулярные и цитологические основы наследственности; генетический код, структурно-функциональная организация генома; процессы репликации, рекомбинации, репарации; мутационная изменчивость, геномная и хромосомная перестройка; эпигенетика; реализация генетической и нформации (транскрипция, трансляция), механизмы регуляции экспрессии генов, роль геномных перестроек в реализации генного действия, взаимодействие генов; генетика индивидуального развития, апоптоз, иммуногенетика; генетика человека, медицинская генетика.
Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования данных специальностей.
Публикации.
Субтотальная проксимальная резекция при раке
Несмотря на стойкое снижение показателей заболеваемости раком желудка в целом, популяционные исследования показывают стойкое увеличение частоты опухолей проксимальной локализации и пищеводно-желудочного перехода. В США, частота аденокарциномы проксимального отдела желудка и дистальной трети пищевода увеличивается так интенсивно, как ни одно другое злокачественное заболевание [128; 134]
Большинство исследователей характеризуют рак проксимального отдела желудка с распространением на пищевод как опухоль высоко злокачественную, склонную к быстрому росту с переходом инфильтрации на пищевод и высоким индексом лимфогенного метастазирования в лимфатические узлы как брюшной полости, так и средостения. На момент хирургического лечения лимфогенные метастазы выявляются в 80% наблюдений [127; 128].
Исследования показали, что наиболее значимыми факторами прогноза в настоящее время является метастатическое поражение лимфатических узлов в сочетании с характером выполненного вмешательства R0 [33; 127; 128]. Причем если выполнение радикального вмешательства R0 при раке кардии позволяет достичь 5-летней выживаемости 41,4%, то оставление даже микроскопической ре-зидуальной опухоли R1 (клетки или комплексы клеток по линии резекции) не позволяет надеяться на благоприятный исход лечения: все пациенты погибают в первые два года. Накопленный в мире опыт позволяет отметить, что на сегодняшний день методом выбора в лечении рака проксимального отдела желудка остается хирургический [33; 44; 75].
Согласно материалам Национального Онкологического Института (Токио, Япония) [112], проксимальная субтотальная резекция желудка может быть выполнена лишь у пациентов при небольших размерах опухоли (до 4 см в наибольшем измерении), локализующихся в проксимальном отделе без распространения на верхнюю треть тела желудка.
Нельзя не упомянуть о различии во взглядах на рациональный объем оперативного вмешательства при раннем раке желудка. При раннем раке верхней трети желудка ряд авторов считают субтотальную проксимальную резекцию онкологически адекватной операцией [18; 20]. Их оппоненты, с целью увеличения объема лимфодиссекции или для улучшения функциональных результатов, рутинно выполняют гастрэктомию [19; 38]. Также есть мнение, что субтотальную проксимальную резекцию желудка и резекцию нижнегрудного отдела пищевода из трансхиатального доступа возможно выполнять при раннем раке кардиального отдела желудка и экзофитных формах рака кардиального отдела желудка. После субтотальной проксимальной резекции желудка с резекцией нижнегрудного отдела пищевода из трансхиатального доступа 2-х и 3-х летняя выживаемость, по результатам ряда исследований, была наилучшей [69]. Столь высокие показатели отдаленной выживаемости связаны с тем, что данный вид оперативного вмешательства выполняли у больных с ранними стадиями заболевания [69; 74].
Проблема лечения рецидива рака желудка возникла почти одновременно с зарождением хирургии рака желудка. В течение длительного периода таких больных относили к категории инкурабельных, поскольку считалось, что большинство из них погибают от диссеминации опухолевого процесса, а травматичность повторного вмешательства не совместима с жизнью [26].
Современные представления о возможностях хирургического лечения рецидива рака желудка значительно расширились. В частности доказана целесообразность повторного хирургического вмешательства не только после дистальной резекции желудка, но и после проксимальной резекции и гастрэктомии. На основании изучения путей метастазирования рецидивного рака разработаны методики расширенной лимфодиссекции при повторной операции, определена тактика лечения больных, у которых обнаружены опухолевые клетки по линии резекции [26].
К настоящему времени как в отечественной, так и зарубежной литературе накоплен достаточно большой опыт по клиническому и морфологическому изучению рецидивирования ракового процесса. Изучение имеющихся публикаций показывает, что проблемы терминологии рецидивов рака тесно связаны с вопросами их классификации. На протяжении всего периода разработки вопросов патогенеза, профилактики и лечения рецидива рака желудка отечественные исследователи предлагали различные классификации, на первом этапе рассматривая эту
патологию как вариант рака оперированного желудка. Так, Ю.Е.Березов в монографии «Хирургия рака желудка» (1976) предложил выделить три основных группы опухолей оперированного желудка:
А. - Оставленный (резидуальный) рак, к которым относил возобновление роста из частично оставленной опухоли или ее регионарных метастазов в силу нерадикальности операции;
Б. - Повторный (рецидивный) рак, возникающий не ранее 3 лет после резекции желудка по поводу рака — это вновь появившаяся опухоль, имеющая причинную связь с ранее удаленной опухолью;
В. - Первоначальный (инициальный) рак, или рак желудка, резецированного по поводу доброкачественных заболеваний [7].
Сходный принцип классификации использовался и в других работах (В.И. Плотников, 1984, В.М.Ефетов,1986, И.Б. Щепотин, 1992). Отмечалось, что не всегда возможно определить источник развития опухоли: оставленные ли это комплексы рака после первой операции или возникшие вновь, особенно при тотальном поражении резецированного желудка и в сочетании с экстраорганным компонентом. Исследование, проведенное в МНИОИ им П.А.Герцена показано, что при изучении слизистой оболочки желудка, окружающей опухоль, практически всегда обнаруживаются участки дисплазии эпителия в той или иной степени выраженности, которые могут нарастать с последующим развитием рака, и иногда достаточно нескольких месяцев или двух-трех лет для возникновения рецидивной опухоли. При низких темпах нарастания диспластических изменений в оставленной слизистой оболочке желудка процесс развития рецидива может растянуться на десятилетия [11]. При этом, как показали исследования слизистой оболочки оперированного желудка и анастомоза, при радикальной по линии резекции операции в участках слизистой оболочки непосредственно над зоной анастомоза дис-пластические изменения нарастают более интенсивно [28].
Микросателлитная нестабильность
Микросателлиты - это повторяющиеся последовательности, повторяющаяся единица которых состоит из 1-6 пар оснований. Эти повторы рассеяны по всему геному, а их длина варьирует у разных индивидуумов. Микросателлитная нестабильность определяется как изменения длины указанных микросателлитов в опухолевой ткани, вызванное повреждением генов системы репарации ДНК. Микросателлитная нестабильность обнаруживалась при различных спорадических карциномах, а также при наследственном неполипозном колоректальном раке. При этом синдроме имеются генеративные мутации генов системы репарации MSH2 или MLH1 [94; 103]. Соматические мутации MSH2 и MLH1 редко встречаются при спорадических карциномах, даже при раке желудка с микросателлитной нестабильностью [108; 123]. Результаты многих исследований предполагают, что гиперметилирование островков CpG в промоторе гена MLH1 обусловливает инактивацию генов и последующую микросателлитную настабильность при спорадических раках желудка [107]. Микросателлитная нестабильность наблюдалась при раке желудка, при этом частота ее встречаемости варьировала от 9,5% до 44%, в зависимости от группы случаев и количества исследуемых маркеров [139; 94]. Примечательно, что при раке желудка, ассоциированном с аденомой желудка, существенно чаще определяется МН, по сравнению с карциномами без аденомы [94]. Рак желудка с МН относятся к хорошо изученному подтипу опухолей, обладающему отличительными клинико патологическими особенностями, такими, как антральная локализация, кишечный тип, экспансивный характер роста, низкая частота метастазирования в лимфатические узлы и улучшенная выживаемость.
Повреждение гена Erbb2 играет важную роль в развитии и прогрессирова-нии любых эпителиальных опухолей. Амплификация гена Erbb2 и гиперэкспрессия Erbb2 белка были выявлены при раке желудка во многих исследованиях. Показано, что амплификация Erbb2 чаще встречается при кишечном типе рака желудка, чем при диффузном [25; 113]. В некоторых исследованиях, рак желудка с амплификацией Erbb2 стойко ассоциировался с неблагоприятным исходом [121].
Метилирование ДНК - это модификация цитозина путем присоединения метильной группы к углероду, расположенному в 5 положении в CG- динуклео-тиде, что приводит к образованию 5- метилцитозина. Функции метилирования в нормальной клетке заключаются в инактивации Х хромосомы, родительском геномном импринтинге, выключении определенных аллелей генов, защите генома и его структурной целостности путем инактивации чужеродных и мобильных последовательностей ДНК, репрессии транскрипции генов. Метилирование промо-торного участка генов приостанавливает транскрипцию и обуславливает модификацию структуры хроматина в виде его конденсации путем деацетилирования ги-стоновых белков [88; 100; 114]. В опухолевых клетках дефекты метилирования ДНК определятся в виде гипометилирования генома, возрастающего с увеличением степени малигнизации, а также аберрантного гиперметилирования СрG- островков в определенных сайтах генома. Наиболее вероятным следствием гипоме-тилирования генома при канцерогенезе может быть усиление его нестабильности и повышение мутаторного потенциала клетки, что приводит к превращению про-онкогенов в онкогены. При этом аберрантное гиперметилирование инактивирует гены, тормозящие клеточный рост, стимулирующие дифференцировку и отвечают за репарацию нарушений ДНК, создавая благоприятный фон для возникновения и дальнейшего прогрессирования опухолей (инвазии, метастазирования). К негативным регуляторам генной экспрессии относят и молекулы РНК некодирующей последовательности длиной 18-25 нуклеотидов, имеющие название микроРНК [119]. Появление же генетических нарушений в злокачественных клетках обусловлено возможностью возникновения именно эпигенетических альтераций.
Следует отметить, что дисбаланс метилирования в клетках определяется еще до появления их злокачественного фенотипа, а это дает возможность использования генома маркеров метилирования ДНК с диагностической и прогностической целью как наиболее ранние и достоверные показатели.
Методы исследования. Анализ метилирования генов CDH1, RASSF1A, MLH1, N33, DAPK. Выделение геномной ДНК их опухолевого материала
Для получения ДНК ткани опухоли использовали следующий метод выделения ДНК [116].
Ткань опухоли отмывали 1 ml PBS, измельчали и затем гомогенизировали. Гомогенат переносили в пробирку, затем добавляли экстракционный буфер (10 мМ Tris-НCl, 2 мМ ЭДТА, 4 мМ NaCl, рН=8,0) и протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл и SDS до 0,5 %. Инкубировали 2 часа при 370С до получения прозрачного раствора. Далее пр оводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, смеси фенол-хлороформ и хлороформом с последующим центрифугированием и отбором верхней фазы. Полученный в результате раствор ДНК перемешивали с 1/10 объема 5 М ацетата натрия, рН 5,3, и ДНК осаждали с помощью 2,5 объемов холодного 96% этанола, выдерживали образец 30 мин при температуре - 700С.
Пробу центрифугировали при 00С 15 мин с ускорением 12000 g. Высушивали осадок ДНК на воздухе и растворяли в 200 мкл ТЕ рН 8,0.
Выход ДНК составлял 25-50 мкг на 1г ткани. После полного растворения ДНК, измеряли ее концентрацию на спектрофлюориметре фирмы «Hoefer» (Германия) и снимали спектр поглощения в диапазоне от 220 до 320 нм, с целью определения чистоты ДНК. При этом проверяли выполнение следующих условий: отношение поглощения на длинах волн 230нм/260нм 0,5, 260нм/280нм 1,8. Максимум поглощения наблюдался в районе 260 нм.
Рестрикционный анализ.
Для определения аномального метилирования проводилась обработка опухолевой ДНК соответствующей метилчувствительной рестриктазой HpaII по следующей схеме: к 1000 нг геномной ДНК добавляли 10 е.а. фермента и 2 мкл соответствующего 10хбуфера, доводили до 20 мкл дистиллированной водой и оставляли на 10 часов в термостате при температуре оптимальной для используемой рестриктазы. Определение аномального метилирования промоторных областей генов-супрессоров опухолевого роста MLH1, N33, CDH1, RASSF1A и DAPK.
Метилирование CpG-островков промоторных областей генов определяли при помощи метил-чувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). Метод МЧ-ПЦР основан на способности метилчувствительных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин. В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК гид-ролизованную метилчувствительными рестриктазами Hpall (CCGG). Геномую ДНК (1 мкг) обрабатывали 10 ед активной рестриктазы в 10 мкл инкубационной смеси в течение ночи. Для амплификации использовали 150 нг гидролизованной ДНК. При проведении ПЦР учитывали присутствие сайтов узнавания используемых рестриктаз в амплифицируемом фрагменте, который содержал не менее трех-четырех Hpall сайтов. В случае модификации цитозинов в метилцитозин ДНК не расщепляется, и продукт ПЦР может быть выявлен в геле. В отсутствие метилирования ДНК полностью гидролизуется, и продукт ПЦР не образуется.
С целью исключения ложноотрицательных результатов проводили мульти-локусные ПЦР с двумя парами прайм еров: один фрагмент принадлежал изучаемому гену (MLH1, N33, CDH1, RASSF1 и DAP К), другой служил внутренним контролем (фрагмент гена МеСР2, не содержащий сайтов узнавания указанных рестриктаз). ПЦР проводили по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтри-фосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ КС1, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,4), 5 мМ MgCb, 10% диметил-сульфоксида. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95 С в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатура-ция при 95 С - 30 с, отжиг и элонгация при 58-62 С - 2 мин 30 с.
Определено метилирование гена N33 у пациента №9. На геле имеется фрагмент соответствующий метилированной форме и внутренний контроль ПЦР. Для остальных генов CDH1 и RASSF1 метилированная форма имеется только для положительного контроля К+, а для пациентов № 10 и №11 метилирование не определено.
Метилирование CpG-островка промоторных областей гена RUNX3 определяли при помощи метил-специфичной ПЦР (МС-ПЦР). Метод МС-ПЦР основан на модификации геномной ДНК бисульфитом натрия. В ходе такой обработки происходит химическое превращение неметилированных остатков цитозина в урацил, тогда как 5-метилцитозин остается в неизменном виде. По изменению нуклеотидного состава в результате обработки бисульфитом натрия можно судить о состоянии метилирования каждого цитозинового остатка на исследуемом фрагменте ДНК. Использование специфических праймеров позволяет разделить метилированную и неметилированную формы исследуемой ДНК.
Геномную ДНК денатурируют с помощью NaOH (конечная концентрации 0,3 М) с последующей инкубацией при 65 С в течении 15 минут и проводят би-сульфитную модификацию при помощи бисульфита натрия (конечная концентрация 2 М) и гидрохинона (конечная концентрация 0,5 М) в течение 15 часов при 60 С. Очистку ДНК-би сульфитной смеси проводят с помощью 750мкл буфера для очистки (гуанидин гидрохлорид 7М, силикагель 17,5мг/мл). Тщательно перемешивают и центрифугируют 4 мин при 13000 об/мин. Полученный осадок промывают изопропанолом (1мл) и высушивают. К сухому осадку добавляют 50мкл деионизованной воды, ресуспензируют, и используют для проведения реакции МС-ПЦР. МС-ПЦР проводится при помощи специфических праймеров на метилиро ванную (metRUNX3 F:ataatagcggtcgttagggcgtcg, metRUNX3 R:gcttctactttcccgcttctcgcg) и не метилированную (unmetRUNX3 F:ataatagtggttgttagggtgttg, unmetRUNX3 R;acttctactttcccacttctcaca). Фрагменты, по лученные в результате ПЦР, разделяют посредством вертикального электрофо 65 реза в ПААГ. Результаты ПЦР оцениваются при окраске геля нитратом серебра, с последующим фотографированием или сканированием.
Анализ выживаемости больных, перенесших различные виды резекции ж е-лудка по поводу рака
В общей группе наблюдений 103 больных показатель 2-х летней выживаемости составил 98 ± 0,06%, 3- х летней - 97 ± 0,09% по отношению к больным, судьба которых была изучена. Результаты представлены на рисунке 12.
Известно, что на выживаемость больных после радикальных операций по поводу рака желудка в первую очередь влияет ряд факторов, такие как стадия заболевания, анатомическая форма опухоли, метастазы в лимфатические узлы, глубина опухолевой инвазии, локализация опухоли и объем выполненного оперативного вмешательства. [78].
Мы провели анализ продолжительности жизни радикально оперированных больных в зависимости от основных факторов, влияющих на отдаленные результаты хирургического лечения. В таблице № 12 приведены отдаленные исходы в зависимости от стадии заболевания.
При анализе 2-х и 3-х летней выживаемости оперированных больных в зависимости от стадии заболевания, видно, что выше стадия заболевания, тем ниже продолжительность жизни. Кроме того продолжительность жизни выше у больных с «чистыми» краями резекции. Из 103 прослеженных в отдаленные сроки пациентов, после операции два года и более прожили при 0 стадии 2 (1,9±0,04%); I стадии заболевания - 48 (46,6±0,02%), II стадии - 24 (23,3±0,01%), III стадии - 22 (21,3±0,05%), IV стадии - 5 (4,8±0,05%). Общая двухлетняя выживаемость составила - 101 пациент (97,9+0.17%). Из 103 прослеженных больных, три года и более прожили 100 (97±0,08%) пациента. Показатели трех летней выживаемости в зависимости от стадии заболевания составили: 0 стадии 2 (1,9±0,04%); I стадии заболевания - 48 (46,6±0,02%), II стадии - 24 (23,3±0,01%), III стадии - 22 (21,3±0,05%), IV стадии - 4 (3,8±0,08%).
Столь высокие показатели 3-х летней выживаемости больных, перенесших резекции желудка по поводу рака в клинике факультетской хирургии (таблица №13) по сравнению с другими авторами можно объяснить следующим образом. Выживаемость в группах больных, перенесших субтотальные дистальные и проксимальные резекции желудка, рассчитывали по количеству больных, включенных в наше исследование, то есть 103 человека. 98/103 были выполнены субтотальные дистальные резекции желудка, и, преимущественно, это были больные с I и II стадиями заболевания, чаще без отдаленных поражений, что заведомо могло обуславливать хорошие отдаленные результаты и как следствие – высокую выживаемость.
Проксимальная резекция желудка выполнены лишь 5 из 103 больным с небольшими юкстакардиальными раками, преимущественно I стадии и без отдаленных метастазов.
Таким образом, учитывая, что в исследование попали больные с преимущественно ранними стадиями и без отдаленных поражений, нельзя однозначно расценивать показатели клиники факультетской хирургии в сравнении с данными других авторов. Но даже анализ выживаемости столь небольшой группы больных указывает на эффективность и радикальность проведенного лечения.
В доказательство вышесказанному приведем клинический пример.
Клинический пример №4.
Больная Л., 80 лет. Поступила в клинику факультетской хирургии в сентябре 2009г с жалобами на отрыжку воздухом, чувство тяжести и эпизодически возникающую рвоту съеденной пищей, возникающие после еды; на общую слабость.
Из анамнеза известно, что в августе 2009 года пациентка находилась в одной из городских больниц с диагнозом: «ЦВБ. Дисциркуляторная энцефалопатия 2 ст. ИБС: стенокардия напряжения 2-3 ф.к. Атеросклеротический и постинфарктный кардиосклероз. Атеросклероз аорты, сосудов сердца, головного мозга. Гипертоническая болезнь 3 ст. НК 2А. Желудочковая экстрасистолия. Порок аортального клапана (стеноз и недостаточность). Сахарный диабет 2 типа средней степени тяжести. Диабетическая нефропатия с развитием ХПН». При обследовании было выявлено инфильтративно-язвенное поражение нижней трети тела желудка, гистологически - низко-дифференцированная аденокарцинома. При рентгенологическом исследовании пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки (рисунок 13): в нижней трети тела по задней стенке имеется несколько дефектов наполнения с деформацией стенок препилорического отдела и ригидностью от уровня угла до выходного отдела. Слизистая в нижней трети тела желудка с хаотичным рельефом складок, перистальтика в этой области не прослеживается. Эвакуация контраста происходит через 15-20 минут. Рисунок 13: Рентгенограмма больной с инфильтративно-язвенной формой рака тела желудка.
При КТ органов брюшной полости: КТ-картина опухоли желудка, метастатического поражения регионарных лимфатических узлов. Желчнокаменная болезнь. Кисты правой почки.
Тяжесть состояния больной была обусловлена наличием конкурирующих соматических заболеваний.
Клинический диагноз звучал следующим образом: «рак тела желудка, ин-фильтративно-язвенная форма T3N1M0, IIB стадия, гистологически - низко-дифференцированная аденокарцинома. Желчнокаменная болезнь. Хронический калькулезный холецистит. ЦВБ. Дисциркуляторная энцефалопатия 2 ст. ИБС: стенокардия напряжения 2-3 ф.к. Атеросклеротический и постинфарктный кардиосклероз. Атеросклероз аорты, сосудов сердца, головного мозга. Гипертоническая болезнь 3 ст. НК 2А. Желудочковая экстрасистолия. Порок аортального клапана (стеноз и недостаточность). Сахарный диабет 2 типа средней степени тяжести. Диабетическая нефропатия с развитием ХПН. Диабетическая полинейропа-тия».
В отделении пациентке проводилась инфузионная терапия, направленная на коррекцию водно-электролитных расстройств, переливание эритроцитарной массы и плазмы, противоязвенная терапия и инсулинотерапия. Была начата предоперационная подготовка, включавшая кардиотропную терапию, коррекцию гиперг-ликемии, однако резистентная к терапии гипертония с элементами транзиторной ишемии миокарда, стойкая гипергликемия, эпизоды нарушения ментального статуса на фоне приходящих нарушений кровоснабжения головного мозга потребовали длительной подготовки больной в условиях отделения реанимации.
Несмотря на тяжесть конкурирующих заболеваний и крайне высокий анестезиологический риск в октябре 2009 года была выполнена операция: дистальная субтотальная резекция желудка по Бильрот- I, лимфаденэктомия D2.5. Холе-цистэктомия. При ревизии: асцита нет, отдаленных метастазов, канцероматоза брюшины нет. В антральном отделе желудка по малой кривизне определяется опухоль, размером 5х6см в диаметре, плотно-эластической консистенции. Опухоль прорастает серозный покров желудка, прорастает в капсулу перешейка поджелудочной железы. Отмечены увеличенные до 1 см плотные л/у по ходу пече-ночно-двенадцатиперстной связки, увеличенные до 5-6 мм мягко эластичные л/у по ходу чревного ствола, общей печеночной артерии, под привратником. Имеется единичный плотный метастаз в большом сальнике, в непосредственной близости от двенадцатиперстной кишки.
