Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Значение мелатонина и его рецепторов в патогенезе острого панкреатита (обзор литературы) 11
1.1. Эпидемиология и современные классификации острого панкреатита .. 11
1.2. Спорные вопросы в тактике лечения острого панкреатита 15
1.3. Проблемы диагностики тяжелых форм острого панкреатита 18
1.4. Существующие прогностические системы и маркеры тяжести острого панкреатита 21
1.5. Роль мелатонина в патогенезе острого панкреатита 23
1.5.1. Патогенетические факторы агрессии и защиты при остром панкреатите 24
1.5.2. Источники и эффекты мелатонина 24
1.5.3. Способы реализации эффектов и разновидности рецепторов мелатонина 25
1.5.4. Влияние мелатонина и его рецепторов на тяжесть течения острого панкреатита 27
Глава 2. Материалы и методы 30
2.1. Общая характеристика исследованных лабораторных животных 30
2.2. Общая характеристика обследованных пациентов с перенесенным острым панкреатитом и здоровых добровольцев 31
2.3. Метод определения содержания рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках крови 37
2.3.1. Метод получения первичных специфических антител к МТ-рецепторам 40
2.3.2. Метод непрямой иммунофлюоресценции 43
2.4. Методы статистической обработки результатов 48
Глава 3. Результаты исследования экспрессии рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках крови 51
3.1. Результаты определения содержания рецепторов мелатонина у исследованных лабораторных животных 51
3.2. Исследование экспрессии МТ-рецепторов первого и второго типов у здоровых добровольцев контрольной группы 53
3.3. Результаты определения экспрессии рецепторов мелатонина у пациентов основной группы 56
Глава 4. Анализ полученных результатов экспрессии рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках крови 71
Заключение 79
Выводы 91
Научно-практические рекомендации 91
Список литературы 92
- Эпидемиология и современные классификации острого панкреатита
- Общая характеристика исследованных лабораторных животных
- Результаты определения содержания рецепторов мелатонина у исследованных лабораторных животных
- Анализ полученных результатов экспрессии рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках крови
Введение к работе
Статистика последних лет показывает, что в большинстве развитых стран первое место в перечне заболеваемости острой хирургической патологией занимает острый панкреатит (ОП). В Санкт-Петербурге в 2004 году больные ОП составили 41,7% от общего числа больных с ургентными заболеваниями органов брюшной полости [2].
Летальность при тяжелых формах острого панкреатита составляет 8-24%, а по некоторым данным достигает 70% [3,7,13,16,19,20,28,71,86,101]. В Санкт-Петербурге летальность при остром панкреатите в 2003 году составила 21,6% и значительно возросла по сравнению с 2002 годом (18,6%) [2].
Столь высокие показатели летальности обусловлены деструктивными формами острого панкреатита и его гнойно-септическими осложнениями. При отечных формах панкреатита летальность не превышает 1% [95]. В связи с этим своевременное проведение комплексной интенсивной терапии, ранней антибиотикопрофилактики, энтерального питания и выполнения других необходимых лечебных мероприятий приводит к достоверному снижению показателей летальности [115]. Таким образом, особую важность приобретает возможность прогнозирования тяжести течения заболевания, вероятности развития деструктивных и инфицированных форм на самых ранних его стадиях.
В настоящее время в практической медицине пытаются использовать множество качественных и количественных критериев некроза и инфицирования ткани поджелудочной железы: уровень С-реактивного белка [39], интерлейкина-10 [98], интерлейкина-18 [133], глюкозы, кальция [74], карбоксипептидазы В [116], прокальцитонина [32], фосфалипазы А2 [35], амилоида А в плазме крови [94]; трипсиногена [116], глутатион пероксидазы и селена в моче [133]. Однако, перечисленные маркеры позволяют лишь диагностировать уже наступившие изменения в поджелудочной железе и не дают возможности прогнозировать развитие у пациентов некротических и
инфицированных форм острого панкреатита на момент появления первых клинических проявлений заболевания.
Известно, что при схожей начальной клинической картине заболевания у одних пациентов патологические процессы в ткани железы могут носить полностью обратимый характер,, а у других могут приводить к формированию некрозов, присоединению бактериальной инфекции с последующим развитием полиорганной недостаточности и септического шока. Причина такой неоднородности в тяжести течения острого панкреатита может заключаться не только в комплексе экзо- и эндогенных факторов, вызвавших заболевание, но и в индивидуальной эффективности механизмов противодействия воспалению в поджелудочной железе. Одним из этих факторов, как показывают экспериментальные исследования последних лет, является мелатонин.
Мелатонин долгое время считался медиатором циркадных ритмов, вырабатывающимся в эпифизе (шишковидной железе) из серотонина и преимущественно влияющим на функционирование центральной нервной системы [68, 70].
Дальнейшие исследования выявили, что в желудочно-кишечном тракте содержится более 95% эндогенного серотонина - основного источника мелатонина. Таким образом, было подтверждено, что APUD-клетками пищеварительной системы вырабатывается в 400 раз больше мелатонина, чем клетками шишковидной железы [77]. Кроме того, источником мелатонина также являются печень, желчный пузырь, поджелудочная железа, почки, надпочечники, яичники, эндометрий, плацента, воздухоносные пути, некоторые клетки крови [21, 22].
Сегодня известно, что помимо регуляции циркадных ритмов и явного седативного эффекта, мелатонин также оказывает антидепрессивное воздействие [124], тормозит апоптоз [54, 82, 92], стимулирует регенеративные процессы [64, 69], регулирует репродуктивную функцию [100] и половое созревание [37], регулирует деятельность
антиноцицептивной системы [103], вмешивается в работу дыхательного центра [128], является онкостатиком [85, 122, 123] и иммуномодулятором [55,56,91].
С практической точки зрения, весьма интересной является способность мелатонина препятствовать развитию воспаления в желудочно-кишечном тракте [57]. Считалось, что противовоспалительный эффект мелатонина обусловлен его непосредственной способностью связывать свободные радикалы [104, 125]. В последнее время появились работы, указывающие на рецептор-опосредованный механизм противовоспалительных эффектов и отсутствие признаков существенного повышения активности антиоксидантной системы [80]. На сегодняшний день описаны три типа мембранных рецептора к мелатонину, два из которых (МТ1 и МТ2) были обнаружены у млекопитающих [68]. Эти рецепторы были обнаружены во многих органах и тканях, в том числе и в пищеварительной системе [68, 89, 114].
По данным последних публикаций, основанных на экспериментальных исследованиях, рецептор-опосредованная противовоспалительная активность мелатонина может оказаться ключевым или одним из наиболее важных факторов, определяющих тяжесть течения острого панкреатита [80, 81].
Таким образом, различные исходы острого панкреатита при схожих начальных проявлениях и принципиально одинаковой тактике лечения могут быть патогенетически обусловлены качеством и количеством рецепторов первого и второго типов, их соотношением и активацией эндогенным мелатонином.
Возможность получения информации об экспрессии МТ-рецепторов, как об одной из возможно наиболее важных эндогенных противовоспалительных систем, может стать основой построения патогенетически обусловленного прогноза развития деструкции ткани поджелудочной железы и вариантов течения острого панкреатита. Однако, в
ходе анализа литературы подобные предположения и исследования, посвященные изучению данной гипотезы, нам не встретились. Цель и задачи исследования.
Цель исследования - обосновать возможность прогнозирования тяжести течения острого панкреатита с помощью определения экспрессии рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках крови (МНК).
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: На экспериментальном этапе:
1. Получить путем иммунизации лабораторных животных специфические
антитела, позволяющие в дальнейшем производить определение
количества мононуклеарных клеток крови, несущих МТ-рецепторы.
2. Оценить особенности экспрессии рецепторов мелатонина в МНК у
близкородственных лабораторных крыс.
На клиническом этапе:
Изучить распределение МТ-рецепторов в мононуклеарах и лимфоцитах (ЛФЦ) крови у условно здоровых людей и у пациентов, перенесших острый панкреатит различной степени тяжести.
Выявить взаимосвязь экспрессии рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках с тяжестью течения острого панкреатита.
Основные положения, выносимые на защиту.
Предложенный метод иммунофлюоресценции с использованием полученных специфических антител позволяет проводить количественную оценку содержания и соотношения МТ1 и МТ2 рецепторов в мононуклеарных клетках крови.
Уровень экспрессии рецепторов мелатонина в МНК крови является генетически детерминированным признаком, позволяющим оценивать эффективность противовоспалительных ресурсов организма и резистентности поджелудочной железы при развитии острого панкреатита.
3. Анализ соотношения лимфоцитов, содержащих МТ1 и МТ2-рецепторы, может стать наиболее ранним критерием прогноза вариантов течения ОП. Научная новизна.
Нами впервые выдвинута гипотеза о наличии связи между количеством и соотношением МТ1 и МТ2 рецепторов в лимфоцитах и всех мононуклеарных клетках крови и тяжестью течения ОП. Для реализации данной гипотезы был впервые разработан и испытан на группе лабораторных животных метод определения содержания рецепторов мелатонина в мононуклеарах крови. При помощи разработанного метода было исследовано содержание МНК крови, несущих рецепторы мелатонина, у группы условно здоровых лиц и у пациентов, перенесших острый панкреатит различной степени тяжести. Для выявления и обоснования возможности прогнозирования течения острого панкреатита был впервые проведен анализ взаимосвязи особенностей течения заболевания и экспрессии МТ1 и МТ2-рецепторов. В результате проведенного анализа полученных данных была выявлена корреляционная связь между тяжестью поражения поджелудочной железы и соотношением двух типов рецепторов мелатонина в лимфоцитарной фракции мононуклеаров, на основании которой были разработаны рекомендации по прогнозированию течения острого панкреатита.
Практическая значимость работы.
Разработанный метод достоверной оценки экспрессии рецепторов мелатонина может позволить максимально рано прогнозировать развитие деструктивных форм заболевания и предельно своевременно, но, при этом, обоснованно применять весь комплекс лечебных мероприятий и тем самым повысить эффективность лечения больных острым панкреатитом.
Лабораторный анализ содержания и соотношения МТ-рецепторов в лимфоцитах крови может стать одним из основных составляющих
используемых в клинике тактических схем диагностики и прогноза острого панкреатита. Доказанная прогностическая ценность описанных показателей экспрессии позволяет рекомендовать их для более широкого применения в хирургических стационарах.
Внедрение результатов работы.
Предлагаемый способ прогнозирования тяжести течения острого панкреатита применяется в практической работе хирургического отделения клиники общей хирургии СПбГМУ имени акад. И.П.Павлова. Полученные результаты используются при подготовке студентов, аспирантов, врачей-интернов и клинических ординаторов на кафедре общей хирургии.
По результатам исследования опубликовано 3 печатные работы. Оригинальный метод получения специфических антител к рецепторам мелатонина зарегистрирован в виде рационализаторского предложения (удостоверение № 1516 от 5.12.2008).
Апробация работы.
Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на научно-практической конференции, посвященной 50-летнему юбилею городской клинической больницы №20 (Санкт-Петербург, 2008).
Эпидемиология и современные классификации острого панкреатита
Несмотря на постоянное совершенствование методов диагностики и лечения острого панкреатита, сохраняется тенденция к росту заболеваемости и летальности при данной патологии. В разных регионах острым панкреатитом заболевает от 5 до 80 человек на 100 тысяч населения [95, 127]. Так, в Англии за 10 лет показатель заболеваемости возрос на 43% [127], а в Дании за тот же период количество заболевших острым панкреатитом увеличилось с 17,1 до 37,8 на 100 тысяч человек [71]. В Санкт-Петербурге в 1980 году больные с панкреатитом составляли 20,1% от общего числа больных с ургентными заболеваниями органов брюшной полости, а в 2004 году этот показатель возрос до 41,7%, и острый панкреатит занял первое место среди неотложных абдоминальных хирургических заболеваний [2].
В процессе изучения этиологии заболевания были выявлены многочисленные факторы, способные привести к развитию острого панкреатита (таблица 1.1) [60]. Ведущая роль отводится желчнокаменной болезни и употреблению алкоголя. Два этих фактора являются причиной развития данного заболевания в 80% случаев [42]. Соотношение двух этих этиологических типов ощутимо варьирует в различных географических регионах. Билиарный панкреатит, как правило, не рецидивирует после холецистэктомии и/или санации холедохолитиаза. ОП, вызванный приемом алкоголя, носит рецидивирующий характер и рано или поздно приводит к хронизации процесса. Значительно реже причиной развития острого панкреатита становятся повышение уровня триглицеридов при сахарном диабете и при наследственных нарушениях метаболизма липопротеинов, гиперкальциемия при первичном или вторичном гиперпаратиреоидизме, приводящая к внутрипротоковой активации трипсиногена и аутолизу ткани поджелудочной железы. Наследуемые мутации генов, отвечающих за синтез трипсиногена, ингибитора серин-протеазы, и CFTR-гена (cystic fibrosis transmembrane regulator), и, кроме того, различные опухоли панкреатического протока и большого дуоденального сосочка являются также в достаточно редких случаях причиной ОП [60].
Даже с использованием всех достижений современной интенсивной терапии, в 15-20% наблюдений развитие острого панкреатита приобретает деструктивный характер. По данным большинства авторов, при панкреонекрозе у 40-70% больных происходит инфицирование очагов некротической деструкции, что является главной причиной высокой летальности пациентов, которая в последние годы остается стабильно высокой и в различных медицинских учреждениях варьирует от 10 до 70% [13, 19, 20, 71, 86, 95, 108]. В тоже время при неосложненных отечных формах панкреатита летальность не превышает 1% [95].
Несмотря на многовековую историю проблемы острого панкреатита, его диагностики и лечения, в настоящее время сохраняется множество разногласий в вопросе классификации данного заболевания. Отсутствие единой общепринятой классификации ОП затрудняет сравнительную оценку эффективности различных методов прогнозирования, диагностики и лечения больных. Использование оптимальной, рациональной классификации и однозначного, не допускающего двойного толкования определения каждого из ее компонентов, может стать необходимым фундаментом для разработки новых способов раннего прогнозирования развития деструктивных и инфицированных форм острого панкреатита.
В настоящее время в России большинство клиницистов используют классификацию В.С.Савельева и соавт. [24, 25]. За рубежом в ходе длительной эволюции существующих классификаций на международном симпозиуме по острому панкреатиту в Атланте в 1992 году [47] была принята современная классификация, основанная на оценке естественного течения острого панкреатита, тяжести поражения поджелудочной железы и окружающих тканей и предусматривающая точную формулировку каждого своего компонента [43, 47] (таблица 1.2).
Вместо привычного разделения ОП на отечный и некротический, авторы классификации, принятой в Атланте, предлагают пользоваться двумя клиническими понятиями: острый панкреатит тяжелого течения и острый панкреатит легкого течения [47, 118]. Первая из этих форм ОП клинически ассоциируется с развитием органной недостаточности и/или местных осложнений, таких как некроз, абсцессы, псевдокисты. Вторая разновидность ОП, для которой характерны минимальная дисфункция органов и, как правило, в итоге клиническое выздоровление, обычно имеет морфологической основой интерстициальный отек, но может сопровождаться развитием микроскопических участков некрозов паренхимы поджелудочной железы и парапанкреатической клетчатки. Таким образом, стирается четкая грань между отечной и некротической формами острого панкреатита, а основу его классификации составляют особенности клинического течения заболевания [8].
В данной классификации варианты деструктивного ОП разделены в зависимости от преобладания солидного или жидкостного компонента в пораженной поджелудочной железе и окружающих тканях. Так, для панкреонекроза характерны плотные участки диффузного или фокального некроза поджелудочной железы, обычно в сочетании с некрозом парапанкреатической жировой клетчатки. При этом принципиально выделение двух основных форм панкреонекроза: стерильного и инфицированного, что определяет принципиальные различия в тактике лечения [8]
Авторы выделяют при ОП три варианта скопления жидкости [126, 129]: острые жидкостные скопления без сформированной стенки - при этом в одних случаях происходит рассасывание жидкостных скоплений, а в других прогрессирование, вплоть до формирования кист и абсцессов; острые псевдокисты с неэпителиальной волокнистой стенкой и стерильным либо инфицированным содержимым; панкреатические абсцессы, которые можно определить как скопления гноя в окружности поджелудочной железы, не содержащие некротических тканей, либо содержащие их в минимальных количествах. Основным достоинством данной классификации служит четкий акцент на различие стерильного панкреонекроза, требующего в подавляющем большинстве случаев консервативного лечения, и инфицированного, являющегося безусловным показанием к хирургическому вмешательству.
Общая характеристика исследованных лабораторных животных
С целью оценки генетически детерминированной экспрессии рецепторов мелатонина на мембранах мононуклеарных клеток крови нами были исследованы 12 самцов половозрелых белых лабораторных крыс. Все животные относились к линии Вистар, были одного возраста и имели одинаковый вес 180-200 г. Для исключения возможного влияния факторов внешней среды на количество МТ-рецепторов условия содержания и режим питания крыс в течение всего срока жизни были абсолютно идентичны. Исследуемые животные содержались при 12-часовом световом дне на стандартном рационе с брикетированным кормом при свободном доступе к воде и пище. У всей группы крыс выполнено изъятие не менее 1,0 мл крови в один день в интервале с 10 до 11 часов. С этой целью все животные умерщвлялись методом дислокации шейных позвонков с последующей декапитацией для эксфузии крови. Все процедуры в эксперименте на животных выполнялись в соответствии с положениями Хельсинкской Декларации Всемирной Медицинской Ассоциации о гуманном отношении к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии (Хельсинкская Декларация Всемирной Медицинской Ассоциации: рекомендации для врачей по проведению биомедицинских исследований на людях. - Хельсинки. 1964, дополнения 1975, 1983, 1996, 2000). Полученный материал хранился и транспортировался в вакутейнерах с ЭДТА при температуре не более 4С. В рамках данной работы были обследованы 41 пациент, ранее перенесших острый панкреатит различной степени тяжести, которые представляют основную группу. Все больные находились на лечении в клинике общей хирургии Санкт-Петербургского Государственного медицинского Университета имени акад. И.П.Павлова в период с 1998 по 2006 год. Был произведен ретроспективный анализ историй болезни и результатов обследования всех представителей группы. Пациенты этой группы поступали в клинику в экстренном порядке. Сроки поступления составили от 3-х часов до 3-х суток с момента первых проявлений заболевания. В данную группу вошли только пациенты мужского пола, так как у женщин не исключены различия в содержании МТ-рецепторов на клеточных мембранах в разные фазы менструального цикла [93]. Кроме того, из исследования исключались больные с любым вариантом желчекаменной болезни и другими поражениями холедоха и большого дуоденального сосочка, так как у таких пациентов острый панкреатит мог представлять билиарную форму, которая этиологически и патогенетически отличается от токсикогенной формы заболевания. При оценке полученных в ходе исследования результатов мы придерживались международной классификации острого панкреатита, принятой в Атланте в 1992 году [47]. Диагноз острого панкреатита ставился на основании данных осмотра больного и результатов динамической клинико-лабораторной и инструментальной диагностики. Обязательные лабораторные исследования включали в себя клинический анализ крови, общий анализ мочи, анализ мочи на содержание сс-амилазы, биохимические анализы крови (аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, билирубин, глюкоза, мочевина, К+, Na+), кислотно-основное состояние крови. Основное внимание уделялось определению уровня а-амилазы крови и мочи в сочетании с изменением лейкоцитарной формулы. Вместе с клинико-лабораторной картиной, ведущую роль в диагностике острого панкреатита играли инструментальные методы обследования: динамическая ультрасонография и компьютерная томография. Ультразвуковое исследование в динамике выполнялось всем больным острым панкреатитом. Признаками деструктивного панкреатита, которые проявлялись, как правило, на 3-й сутки от начала заболевания, являлись: увеличение размеров поджелудочной железы, неоднородность ее структуры, размытость контуров. Эхонегативные участки различной конфигурации, размеров соответствовали очагам панкреонекроза. Наличие свободной жидкости и острых жидкостных скоплений в брюшной полости, очагов деструкции в ткани поджелудочной железы, клетчатке забрюшинного пространства также свидетельствовали о деструктивном характере панкреатита. В случаях воспалительного увеличения головки поджелудочной железы отмечалось расширение внутрипеченочных и общего желчного протоков. Для более четкой оценки размеров и локализации очагов деструкции в забрюшинном пространстве выполнялась компьютерная томография. Исследование проводили как с введением контрастного вещества (пероральное и/или внутривенное), так и в обычном режиме. У больных определялось увеличение размеров поджелудочной железы с изменением ее плотности (очаги некроза), жидкостные образования — очаги деструкции в ткани поджелудочной железы и забрюшинном пространстве.
Результаты определения содержания рецепторов мелатонина у исследованных лабораторных животных
С целью оценки возможных колебаний экспрессии МТ-рецепторов в популяции со схожим генотипом был проведен анализ содержания данных рецепторов у группы из 12 самцов белых крыс одной генетической линии. Результаты исследования приведены в таблице 3.1.
В результате исследования было выявлено, что среднее содержание рецепторов мелатонина первого типа в МНК крови у близкородственных особей составило 76,57+0,51%, второго типа - 80,46+0,78%. Среднее значения соотношения рецепторов МТ2 к МТ1 - 1,05+0,01. Следует отметить, что колебания показателей экспрессии МТ-рецепторов, как видно на рисунке 3.1, и первого, и второго типов у крыс одного вида были минимальны.
Полученные результаты косвенно свидетельствуют о том, что уровень экспрессии рецепторов у генетически близких особей практически идентичен при условии максимального исключения влияния факторов внешней среды.
В процессе анализа полученных данных выявлено, что у условно здоровых животных содержание МТ2-рецепторов, реализующих противовоспалительные эффекты мелатонина, превышает количество МНК, несущих МТ1-рецепторы (t=5,002; р 0,001).
В целях определения количества мононуклеарных и лимфоцитарных клеток крови, имеющих на своей мембране рецепторы мелатонина, у людей, не страдавших острым панкреатитом и другими воспалительными заболеваниями пищеварительной системы, а также для последующего сравнения с основной группой были исследованы 29 условно здоровых добровольца мужского пола. Среднее значение количества мононуклеаров, содержащих МТ1-рецепторы, у представителей контрольной группы составило 64,27+2,74%. МТ2-рецепторы обнаруживались в среднем в 65,23+2,52% мононуклеарных клетках. Необходимо отметить, что минимальные и максимальные значения количества МНК, несущих МТ-рецепторы, в группе соответственно составили для МТ1 42,1% и 78,3%, а для МТ2 46,0% и 79,7%. Среднее значения соотношения рецепторов МТ2 к МТ1 в мононуклеарах среди представителей группы составило 1,02+0,03, а минимальное и максимальное значение этого показателя — 0,85 и 1,3 соответственно.
Также было исследовано содержание и соотношение лимфоцитов крови, содержащих рецепторы мелатонина того и другого типов. Средние значения количества ЛФЦ с МТ1 и МТ2-рецепторами в контрольной группе соответствовали 56,41+3,59% и 59,11+3,73%. Минимальные и максимальные значения количества лимфоцитов, несущих МТ-рецепторы, в группе соответственно составили для МТ1 34,5% и 75,6%, а для МТ2 32,6% и 79,1%. Среднее значение показателя МТ2/МТ1 в лимфоцитах, отражающего соотношение клеток с МТ1 и МТ2 рецепторами среди условно здоровых лиц, равнялось 1,06+0,06. Крайние отклонения данного показателя в ЛФЦ соответствовали 0,79 и 1,50.
Таким образом, наши исследования показали, что среди обследованных здоровых мужчин количество МНК с рецепторами первого типа находится в прямой корреляционной зависимости с количеством мононуклеаров, несущих рецепторы второго типа (г=0,77; р 0,001) (рисунок 3.2). Статистически достоверных отличий средних значений МНК с МТ1 и МТ2-рецепторами не обнаружено (t=0,26; р 0,5)
Анализ полученных результатов экспрессии рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках крови
В результате экспериментального этапа проведенного нами исследования было показано, что у особей одного биологического вида со схожим генотипом уровень МНК, содержащих МТ-рецепторы, как первого, так и второго типов, практически идентичен. Данное наблюдение косвенно свидетельствует о том, что экспрессия данных маркеров в мононуклеарных клетках крови является генетически детерминированным признаком. В свете полученных ранее экспериментальных данных о важнейшей роли мелатонина и его рецепторов в патогенезе острого панкреатита [80, 81] можно высказать предположение, что различные по тяжести варианты течения ОП при идентичных пусковых механизмах и схожих клинических проявлениях в раннем периоде могут объясняться генетически обусловленной разницей в экспрессии рецепторов мелатонина у разных индивидуумов. Изучению данной гипотезы были посвящены все дальнейшие экспериментальные, клинические и аналитические этапы проделанной нами работы.
В ходе последующей оценки полученных данных было обнаружено, что у условно здоровых лабораторных животных, использованных в эксперименте, экспрессия МТ2-рецепторов, через которые происходит реализация противовоспалительного эффекта мелатонина, в мононуклеарных клетках крови достоверно выше, чем экспрессия рецепторов первого типа. В дальнейшем для более удобного сравнения соотношения экспрессии рецепторов мелатонина первого и второго типов в разных группах был введен показатель МТ2/МТ1, который представляет собой частное от содержания клеток с МТ2 к количеству клеток с МТ1-рецепторами в процентах от общего количества клеток конкретной популяции. У лабораторных крыс среднее значение данного показателя составило 1,05±0,01.
Одним из первых наблюдений, сделанных в процессе клинического этапа нашего исследования, стало отсутствие корреляционной связи количества лимфоцитов и мононуклеаров крови, обладающих рецепторами мелатонина, с возрастом в обеих исследуемых группах людей. Этот факт позволил сделать вывод о том, что экспрессия МТ-рецепторов в данных клеточных популяциях не зависит от возраста.
В контрольной группе, состоящей из условно здоровых мужчин в возрасте от 22 до 67 лет, не имевших в анамнезе воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта, также было отмечено превалирование содержания, как лимфоцитов, так и мононуклеаров в целом с МТ2-рецепторами. Данное соотношение отображено в средних значениях показателя МТ2/МТ1 в группе, который в обеих популяциях был больше 1,0 и составил 1,02+0,03 в МНК и 1,06+0,06 в ЛФЦ.
При обследовании группы пациентов в возрасте от 23 до 68 лет, перенесших острый панкреатит различной степени тяжести, сделано наблюдение о том, что количество клеток исследуемых фракций, содержащих рецепторы мелатонина второго типа у данной категории исследуемых лиц заметно ниже в сравнении с полученными показателями в контрольной группе (рисунок 4.1). При этом достоверной разницы в экспрессии МТ1-рецепторов выявлено не было.
Кроме того, в основной группе отмечено ощутимое снижение показателя МТ2/МТ1, равняющегося 0,95+0,03 для мононуклеаров и 0,96+0,06 для лимфоцитов. Таким образом, было обнаружено, что для больных острым панкреатитом в анамнезе характерно преобладание мононуклеарных и лимфоцитарных клеток крови с рецепторами мелатонина первого типа за счет уменьшения экспрессии МТ2-рецепторов.
В процессе последующей обработки полученных данных была установлена отчетливая взаимосвязь экспрессии определяемых маркеров в МНК и ЛФЦ с наличием у пациентов основной группы хронической сопутствующей патологией воспалительного характера (рисунок 4.2).
В результате проведенного статистического анализа было выявлено, что при наличии у больных, перенесших острый панкреатит, хронических воспалительных заболеваний различной этиологии и локализации отмечается значительная деэскалация уровня экспрессии МТ-рецепторов второго типа в обеих популяциях клеток. Вследствие этого, в данной подгруппе условный баланс между содержанием клеток с МТ1 и МТ2-рецепторами еще больше смещается в сторону превалирования МТ1-несущих мононуклеаров и лимфоцитов. Данный факт, с учетом публикуемой информации о положительных лечебных эффектах мелатонина при самых разнообразных заболеваниях, может объясняться тем, что при исходно меньшем количестве клеток, несущих на мембране рецепторы второго типа, происходит снижение противовоспалительного действия самого мелатонина в организме человека, а это, в свою очередь, приводит к развитию хронических воспалительных заболеваний.
Следующим этапом нашего исследования стало изучение связи экспрессии определяемых клеточных маркеров в МНК и ЛФЦ с тяжестью состояния пациентов во время перенесенного острого панкреатита, оцениваемой по шкале SAPS. Распределение внутри основной группы ее представителей по суммам баллов SAPS не позволило сформировать полноценные подгруппы для статистического сравнения. В связи с этим был произведен корреляционный анализ между значениями содержания и соотношения рецепторов мелатонина в исследуемых клеточных фракциях и суммами баллов SAPS. Результаты проведенного анализа подтвердили наличие статистически достоверной корреляции тяжести состояния и прогнозируемой летальности с экспрессией МТ2-рецепторов и соотношением МТ2/МТ1, как в лимфоцитах, так и во всей популяции мононуклеаров крови. При этом достоверной корреляционной зависимости значений SAPS с содержанием клеток с МТ1-рецепторами в группе получено не было. Кроме того, обращают внимание обнаруженные статистически достоверные отличия средних значений баллов SAPS у пациентов с отсутствием либо наличием сопутствующих хронических воспалительных заболеваний. Таким образом, выявленные закономерности могут свидетельствовать об имеющейся связи между экспрессией МТ2, а также соотношением рецепторов мелатонина первого и второго типов и толерантностью организма человека к таким тяжелым воспалительным заболеваниям, как острый панкреатит. Иными словами, снижение значений показателя МТ2/МТ1 вызывает более тяжелое течению заболеваний, что неизбежно приводит к увеличению уровня прогнозируемой летальности.
Наибольший интерес для клиницистов, имеющих непосредственное отношение к диагностике, прогнозированию течения и лечению острого панкреатита, представляет изучение взаимосвязи тяжести течения данного заболевания и экспрессии определяемых маркеров в мононуклеарах и лимфоцитах крови. При оценке содержания МНК с МТ-рецепторами у пациентов с легким и тяжелым течением ОП (рисунок 4.3) значимых отличий в экспрессии рецепторов первого типа получено не было. Необходимо также отметить, что по количеству МТ1-содержащих мононуклеаров все обследованные пациенты, независимо от варианта течения заболевания, сопоставимы с представителями контрольной группы.
