Введение к работе
Актуальность темы связана с возрастающим интересом к проблемам хроматографии биологически активных веществ (БАВ). Такой интерес вызван постоянно расширяющимся кругом практических задач, решаемых с помощью колоночной хроматографии БАВ. К наиболее актуальным можно отнести задачи биотехнологии (по масштабированному и препаративному разделению, выделению и концентрированию БАВ с целью получения особо чистых биопрепаратов), некоторые задачи медицины (по экстракорпоральной деток-сикации человека методами гемо-, плазмо- и ликворосорбции), задачи молекулярной биологии (по получеігию информации о физико-химических характеристиках БАВ), задачи анализа БАВ (с целью идентификации состава и количества конкретных компонентов в сложных биохимических средах). Недостаточное развитие научных основ хроматографии БАВ тормозит решение перечисленных задач. Простое же перенесение на хроматографию БАВ принципов, характерных для низкомолекулярных и минеральных веществ, не привело к желаемому успеху. Главная причина этого состоит в том, что хроматография БАВ, как правило, осуществляется в неравновесном (HP) режиме — не характерном для низкомолекулярных веществ. HP режим вызван, прежде всего, медленной внутридиффузионной кинетикой межфазного массообмена БАВ в колонке и принудительным сокращением времени протекания самого процесса хроматографии (для сохранения биологической активности веществ). Учитывая сказанное, а также факт, что вопросам элютивной неравновесной хроматографии (в том числе хроматографии БАВ) не уделялось должного внимания, в силу новизны этого направления, можно считать проведение теоретических и экспериментальных исследований в этой области весьма актуальным. Детальное исследование закономерностей неравновесной хроматографии будет, без сомнения, способствовать решению перечисленных задач.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в установлении общих закономерностей неравновесного движения медленно диффундирующих веществ в колонке, разработке на их основе хроматоидентификации БАВ, а также в выявлении возможности проведения хроматографии БАВ в условиях HP режима. Для достижения этих целей решались следующие задачи: 1) разработка и анализ теории неравновесного движения и разделения веществ в колонке; 2) экспериментальное исследование элютивного движения некоторых БАВ в колонке для случая отсутствия (эксклюзионный вариант) и наличия (ионообменный вариант) взаимодействия между пористым материалом и БАВ; 3) проверка адекватности теории и эксперимента по закономерностям движения и разделения БАВ в условиях HP режима; 4) разработка и анализ
теории неравновесной хроматографии, адекватной различным элютивным методам ввода пробы в колонку.
Научная новизна. 1) Построена линейная теория неравновесного движения хроматографической зоны медленно диффундирующего вещества для случая внутридиффузионной кинетики межфазнога млссо,обмена, новыми элементами которой являются: решения (для обеих фаз колонки) уравнений хроматографии в HP режиме для случаев произвольного и «импульсного» краевых условий на входе колонки; аналитические соотношения, дающие взаимно-однозначное соответствие между основными характеристиками движения зоны (объем удерживания, высота и ширина зоны и др.) т— с одной стороны, и параметрами хроматографической системы — с другой. 2) Впервые экспериментально установлены и теоретически обоснованы новые закономерности движения зоны в HP режиме, такие, как смещецие зоны от скорости элюции, дисперсности гранул и от других параметров; пародоксальные (с позиций традиционных воззрений) изменения высоты и ширины зоны от параметров системы; 3) Впервые установлено (на теоретическом и экспериментальном уровнях), что хроматоидентификация веществ в HP режиме возможна по сумме равновесных и кинетических параметров массообмена и гидроструктурных параметров (скорости элюции, дисперсности гранул, длины колонки). 4) Обоснована на теоретическом и экспериментальном уровнях (на примере эксклюзионной хроматографии БАВ) возможность экспресс-разделения веществ с близкими молекулярно-равновесными свойствами по различию их молекуляр-но-кинетических свойств. 5) Установлена адекватность теории динамики движения и разделения медленно диффундирующих веществ в HP режиме с экспериментом для БАВ. 6) Впервые доказана на теоретическом и экспериментальном уровнях неравноценность методов ввода пробы в колонку на закономерности движения и разделения веществ в условиях HP режима.
Практическая значимость достигается в разработках, открывающих следующие возможности: 1) априорную количественную оценку основных характеристик движения зоны в HP режиме по предложенным аналитическим соотношениям; 2) хроматоидентификацию веществ, движущихся в HP режиме, по равновесным, кинетическим и гидроструктурным параметрам системы; 3) способы перевода движения зоны из неравновесного (HP) режима в квазиравновесный (KB) режим варьированием физико-химических или гидроструктурных параметров системы; 4) экспериментальное определение эффективных коэффициентов диффузии веществ в порах сорбента по наклону прямых в координатах «относительный объем задержки вещества — обратная скорость элюции»; 5) экспресс-разделение веществ с близкими молекулярно-равновесными свойствами за счет различия их молекулярно-кинстических свойств (коэффициентов диффузии) методом эксклюзионной хроматографии в HP режиме.
Защищаемые положения. 1) Развитие линейной теории сугубо неравновесного движения вещества хроматографической зоны в колонке (для случаев ионообменной, адсорбционной, эксклюзиошюй хроматографии БАВ) при учете внутридиффузионной кинетики межфазного массообмена, основные защищаемые положения которой включают: общие решения (для обеих фаз колонки) уравнений хроматографии для HP режима при произвольных и «импульсных» краевых условиях; аналитические соотношения между основными характеристиками движения зоны и параметрами хроматографической системы; строгую хромато-идентификацию веществ. 2) Факт существования новых (не характерных для традиционной хроматографии) закономерностей движения медленно диффундирующих веществ (в том числе БАВ) в колонке, подтвержденных экспериментально и получивших теоретическое обоснование. 3) Обоснование возможности экспресс-разделения БАВ с близкими мо-лекулярно-равновесными свойствами в условиях HP режима хроматографии. 4) Неравноценность методов ввода пробы в колонку на закономерности движения и разделения веществ в HP режиме. 5) Адекватность развитой теории неравновесного движения и разделения медленно диффундирующих веществ с экспериментом для БАВ.
Апробация и публикации. Результаты выполненных исследований по теме диссертации докладывались на XI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Алма-Ата, 1975), на Всесоюзной научной конференции «Биологически активные вещества природного и сиігтетического происхождения» (Ленинград, 1977), на I Всесоюзной конференции по применению хроматографии в биологии и медицине (Москва, 1983), на Всесоюзном семинаре, посвященном памяти А.В. Киселева (Москва, 1985), на I-V Всесоюзных и VI-VII Российских симпозиумах по молекулярной жидкостной хроматографии (Дзержинск, 1979; Звенигород, 1982; Рига, 1984; Алма-Ата, 1987; Рига, 1990; Москва 1993; Москва, 1996).
По теме диссертации опубликованы 23 печатные работы.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), основной части, включающей теоретические и экспериментальные результаты исследования (главы 2 — 5), заключения и выводов, списка литературы, двух приложений. Общий объем работы 120 стр. на стандартных листах, включая 27 рисунков, 1 таблицу, 2 приложения, список цитируемой литературы из 113 наименований.