Введение к работе
Актуальность темы. Согласно данным Продовольственной и
сельскохозяйственной организации ООН (ФАО) мировое рыбное производство в
результате рыбного промысла и аквакультуры в 2013 году составило 160 млн. тонн,
против 157 млн. тонн в 2012 г. В результате роста спроса и оскудения промысловых
акваторий, сегодня уже половина морепродуктов выращивается искусственно. По
прогнозу ФАО к 2030 году более 65% морепродуктов будет выращиваться на
фермах. По официальным данным таможенной статистики в 2013 году в
Российскую Федерацию было импортировано более 1 млн. тонн рыбы и продукции
из промысловых видов гидробионтов, что на 8% больше, чем в 2012 году. Наиболее
эффективным способом исключения или снижения потерь биоресурсов от
бактериальных инфекций является антибиотикотерапия и
антибиотикопрофилактика.
В аквакультуре при искусственном выращивании в комбикорма могут добавлять различные антибактериальные препараты. Существуют инструкции и рекомендации по применению тех или иных антибиотиков для лечения и профилактики многих инфекционных, карантинных, а также особо опасных болезней рыб [Бабенко О.В., Оганесян Г.С., 1997]. Есть сведения, что прод укты аквакультуры погружают в раствор или используют лед с антимикробными веществами с целью пролонгирования срока годности [Serrano P., 2005]. Ряд зарубежных авторов [Swapna K.M. et al 2012] также сообщало об обнаружении остаточных количеств хлорамфениколя, сульфаниламидов и эритромицина в креветках выше максимально допустимого уровня (МДУ).
Информация о реальном перечне антибактериальных препаратах сильно варьирует, в зависимости от страны, где осуществляется производство, что связано с различиями в подходе к перечню разрешенных препаратов и нормированию антибиотиков [WHO technical report series, 1997; Furones, Rodgers, 2009; Fish and Fishery Products, 2011]. По этой причине проблема безопасности применения антибактериальных препаратов стала актуальной, как в национальном, так и в международном масштабе.
Несоблюдение ветеринарных требований по применению антибактериальных препаратов приводит к их накоплению, как в самой рыбе, так и в продуктах переработки. Все это вызывает различные негативные последствия для здоровья людей, животных, а также окружающей среды. Ряд авторов сходятся во мнении, что
поступление в организм человека антибиотиков с пищевыми продуктами крайне нежелательно, поскольку они могут оказывать токсическое действие, приводить к возникновению аллергических реакций, дисбактериозов, циркуляции резистентных штаммов, образованию Л-форм бактерий, влияющих на бактериальную флору, нарушению обмена веществ и другим негативным последствиям.
В этой связи актуальной является разработка ускоренных методов исследования для контроля ветеринарной безопасности антибактериальных веществ в рыбе, в том числе аквакультуре, для обеспечения получения продукции высокого ветеринарно-санитарного качества.
В настоящее время среди ускоренных методов определения остаточных количеств антибактериальных веществ лидирующее положение занимают иммуноферментные и микробиологические методы анализа. Иммуноферментный анализ (ИФА) позволяет быстро анализировать бол ьшое число проб [Нестеренко И.С., Вылегжанина Е.С., Филиппова К.М., Панин А.Н. и др., 2014] и является высокочувствительным и избирательным методом [Буркин М.А., Кононенко Г.П., Буркин А.А., 2011]. Он применяется при исследовании молока, молочных продуктов, яиц, колбасы, сыра, меда, мяса и других продуктов [Белоусов В.И., Матрёшин А.В., Мамаев М.А. и др. 2000; Морозова Е.Н., 2005; Быков Г.Т., Базарбаев С.Б., Белоусов В.И 2015]. Наряду с ИФА представляет практический интерес микробиологический метод на основе тест-системы PremiTest (производство R-Biopharm AG, Германия), который позволяет обнаруживать антибактериальные вещества в пищевых продуктах [Schneider M. J, Lehotay S.J, 2008; Gaudin V., Gaugain M., Sanders P., 2009; Hoff R. et al, 2012; Ekene V., Oboegbulem S., Nwanta J., 2014].
Степень разработанности. Для контр оля остаточны х количеств различных антибактериальных веществ в рыбе и аквакультуре впервые усовершенствованы и применены метод иммуноферментного анализ (ИФА) на основе тест-системы RIDASCREENTetracyclin (производство R-Biopharm AG, Германия) и микробиологический метод с применением тест-системы PremiTest (производство R-Biopharm AG, Германия). Данные тест-системы первоначально предложены для контроля остаточных количеств различных антибактериальных веществ в таких матрицах, как мясо с/х животны х, птица, печень, молоко, сыр, мед и различные корма. Актуальным является экспериментальное обоснование и определение пригодности данных тест-систем для контроля остаточных количеств различных
антибактериальных веществ конкретно в рыбе, в том числе аквакультуре, в частности в ракообразных, креветках, моллюсках и др.
Цель и задачи. Целью данной работы являлось усовершенствование и изучение возможности применения ускоренных методов контроля остаточных количеств антибактериальных веществ в рыбе и аквакультуре с решением следующих задач:
1. Провести экспериментальные исследования по усовершенствованию и
разработке технологий применения, а также определить параметры эффективности
экспресс-методов для контроля антибактериальных веществ в рыбе и аквакультуре:
с использованием иммуноферментного анализа на основе тест-системы ИФА RIDASCREENTetracycline;
с использованием микробиологического метода на основе тест-системы PremiTest;
2. Провести производственные испытания и разработать нормативно-
методическую документацию по определению остаточных количеств
антибактериальных веществ в рыбе и аквакультуре с использованием
иммуноферментного и микробиологического анализов.
Научная новизна. Усовершенствован и впервые применен
иммуноферментный метод анализа на основе тест-системы
RIDASCREENTetracyclin для обнаружения в рыбе и аквакультуре остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы. Определены основные параметры метода, а именно: предел обнаружения тетрациклина в образцах рыбы и аквакультуре - 1,5 мкг/кг, предел количественного определения – 3,3 мкг/кг; стандартное отклонение 0,3 мкг/кг, коэффициент вариации для контаминированных тетрациклином проб составил 16%, что соответствует критерию оценки пригодности метода. Экспериментально определена межоперационная точность метода для обнаружения остатков тетрациклина в пробах рыбы и аквакультуры, которая составила 0,9 мкг/кг и установлено, что при определении воспроизводимости метода расхождение между результатами исследований не превышало 10,0%. Проведен мониторинг производственных проб рыбы и аквакультуры методом ИФА на основе тест-системы RIDASCREENTetracyclin, в результате которого, остаточные количества тетрациклина обнаружены в 7% от общего количества проб, в пробах отечественного происхождения остаточных количеств тетрациклина не выявлено.
Усовершенствован и впервые применен микробиологический метод анализа на основе тест-системы PremiTest для обнаружения в рыбе и аквакультуре остаточных количеств антибактериальных веществ. Экспериментально адаптирована методика пробоподготовки для рыбы, в том числе аквакультуры. В частности определен оптимальный способ получения сока и впервые применена инкубация пробирок с образцами (более 20 образцов) на водяном термостате при 64С вместо стандартного нагревательного блока фирмы DSM (10 образцов). Определены параметры предела обнаружения следующих антибактериальных веществ, которые составили: для тетрациклина - 100 мкг/кг, сульфметазина – 75 мкг/кг, тилозина – 100 мкг/кг, амоксициллина – 12,5 мкг/кг, гентамицина – 200 мкг/кг и цефтиофура – 200 мкг/кг. Экспериментально установлено, что для получения оптимальных результатов при исследовании тест-системой PremiTest пробы рыбы и аквакультуры необходимо хранить при 4-70С не более 72 часов, и определено, что гомогенизированные пробы не подходят для анализа тест-системой PremiTest.
В результате сра внительных опытов методом ГОСТ 31903-2012 «Продукты пищевые. Экспресс-метод определения антибиотиков» нами было подтверждено наличие тетрациклина в контаминиро ванных пробах рыбы, которые исследо вали тест-системой PremiTest.
Проведен мониторинг производственных проб рыбы и аквакультуры микробиологическим методом на основе тест-системы PremiTest. Остаточные количества антибактериальных веществ обнаружены в 34% от общего числа исследованных проб, из них 19,2% в образцах отечественного происхождения и 14,8% в пробах импортного происхождения (в пробах из Китая, Уругвая, Аргентины и Мьянмы).
Теоретическая и практическая значимость работы. Показана высокая эффективность усовершенствованных методов иммуноферментного анализа RIDASCREENTetracyclin, а также микробиологического анализа PremiTest при определении остаточных количеств антибактериальных веществ в рыбе и аквакультуре.
Проведенные экспериментальные исследования позволили установить валидацию метода иммуноферментного анализа RIDASCREENTetracyclin (определена пригодность метода для определении антимикробных веществ в рыбе и других продуктах аквакультуры), а также была проведена верификация
оборудования (подтверждена эффективность применения имеющегося оборудования в технологическом процессе определения антибиотиков тетрациклиновой группы).
Проведенными опытами с применением тест-системы PremiTest определен предел обнаружения ряда антибактериальных препаратов, а именно: тетрациклина, сульфметазина, тилозина, амоксициллина, цефтиофура и гентамицина, которые составили от 12,5 до 200 мкг/кг; экспериментально установлено влияние различных факторов на качество проведения анализа. Экспериментальными исследованиями подтверждена практическая значимость применения данного метода.
На основании проведенных исследований разработаны и рекомендованы для применения:
«Методические рекомендации по обнаружению антибиотиков тетрациклиновой группы в рыбе и других объектах аквакультуры, с применением иммуноферментного анализа» (утв. Ученым советом ФГБНУ ВНИИВСГЭ 10.12.2014).
«Методическое пособие по скринингу антибактериальных препаратов в рыбе, икре, ракообразных, креветках и других морепродуктах с применением тест-системы PremiTest» (утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 14.03.2012). Методическое пособие отмечено Золотой медалью и Дипломом на XVI Российской агропромышленной выставке «Золотая осень» (2014г), а на Международной выставке AgroFarm2014 (2014) работа отмечена, как «Лучшая научная разработка», с вручением диплома и кубка.
Методология и методы исследования. Для контроля остаточных количеств антимикробных веществ в рыбе и аквакультуре использовали усовершенствованные методы иммуноферментного анализа на основе тест-системы RIDASCREENTetracyclin и микробиологического анализа с применением тест-системы PremiTest.
При усовершенствовании иммуноферментного анализа на основе тест-системы RIDASCREENTetracyclin использовали методику построения калибровочной кривой по стандартным растворам тетрациклина с определением предела обнаружения, предела количественного определения, стандартного отклонения, межоперационной точности, воспроизводимости метода, и других параметров метода.
Учет результатов проводили с помощью специального программного обеспечения RIDASoft. Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики.
При усовершенствовании микробиологического анализа PremiTest в серии опытов по исследованию рыбы и аквакультуры были определены пределы обнаружения тетрациклина, сульфметазина, тилозина, амоксициллина, цефтиофура и гентамицина.
Учет результатов проводили по принципу изменения цвета агара (индикаторной среды). Если цвет оставался фиолетовым, значит происходило ингибирование, что говорило о присутствии антибактериального агента, а если цвет агара изменялся с фиолетового на желтый - ингибирование не происходило, что учитывали, как отсутствии антибактериальных агентов выше предела обнаружения теста. Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики.
Положения, выносимые на защиту.
1. Усовершенствование и определение пригодности иммуноферментного
анализа для контроля остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы
в рыбе и аквакультуре на основе тест-системы RIDASCREENTetracyclin:
- валидация метода, по таким показателям, как предел обнаружения,
предел количественного определения, стандартное отклонение, коэффициент
вариации, а также межоперационная точность и воспроизводимость метода.
-
Результаты мониторинга остаточных количеств антибактериальных веществ тест-системой RIDASCREENTetracyclin в производственных пробах рыбы и аквакультуре отечественного и импортного происхождения, отобранных из розничной сети в период 2010-2016;
-
«Методические рекомендации по обнаружению антибиотиков тетрациклиновой группы в рыбе и других объектах аквакультуры, с применением иммуноферментного анализа» (утв. ФГБНУ ВНИИВСГЭ 10.12.2014).
-
Усовершенствование микробиологического анализа для контроля остаточных количеств различных антибактериальных веществ в рыбе и аквакультуре на основе тест-системы PremiTest:
- при разработке тест-системы PremiTest установлены пределы
обнаружения ряда антибактериальных веществ, в том числе тетрациклина,
сульфметазина, тилозина, амоксициллина, гентамицина и цефтиофура;
результаты пределов обнаружения антибактериальных веществ сравнивали с результатами исследований, изложенными в протоколе валидации тест-системы PremiTest для мяса с/х животных;
экспериментально установлены факторы, отрицательно влияющие на результаты анализа тест-системой PremiTest.
-
Результаты мониторинга остаточных количеств антибактериальных веществ тест-системой PremiTest в производственных пробах рыбы и аквакультуры отечественного и импортного происхождения, отобранных из розничной сети в период 2010-2016;
-
«Методическое пособие по скринингу антибактериальных препаратов в рыбе, икре, ракообразных, креветках и других морепродуктах с применением тест-системы PremiTest» (утв. РАСХН 14.03.2012).
Степень достоверности и апробация результатов. Материалы диссертации доложены и одобрены на:
- Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию заслуженного деятеля науки, доктора ветеринарных наук, профессора Абуладзе К.И. и доктора ветеринарных наук, профессора Колоболотского Г.В. (ФГБОУ ВО «МГАВМиБ им. К.И.Скрябина», г. Москва 15-16 мая 2012 г.);
Международной научно-практической конференции "Обеспечение качества и безопасности продуктов животного происхождения" (ФГБНУ «ВНИИВСГЭ», г. Москва 15 мая 2013 г.);
Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы товароведения и безопасности товаров», посвященной 20-летию экономического факультета (ГАОУ ВПО «МГОСГИ», г. Коломна 17 мая 2013 г.);
- Международной научно-практической конференции "Научные проблемы
обеспечения ветеринарно-санитарного благополучия животноводства и пути их
решения" (ФГБНУ «ВНИИВСГЭ», г. Москва 2 апреля 2014 г.);
- Расширенном совещании сотрудников ФГБНУ «ВНИИВСГЭ» (26 сентября
2016 г.)
Публикации. Опубликовано 6 научных статей, в том числе 4 – в издании, входящем в перечень ВАК Минобрнауки РФ (Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии»)
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания