Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 11
2.1 Микробная контаминация мясного сырья энтеробактериями как показатель его санитарного качества 11
2.2 Влияние биопленки, образуемой на технологическом оборудовании, на контаминацию продуктов питания микроорганизмами 18
2.3 Дезинфекционные мероприятия, направленные на повышения качества выпускаемой мясной продукции .24
2.4 Контроль качества и безопасности на мясоперерабатывающих предприятиях, основанный на принципах НАССР 30
2.5 Применение петрифильмов для ускоренного производственного мониторинга мяса и контроля качества санитарных мероприятий .38
2.6 Экспрессный АТФ-биолюминесцентный мониторинг чистоты на предприятии по переработке мяса 42
3. Собственные исследования 47
3.1 Материалы и методы 47
3.2 Результаты исследований 53
3.2.1 Определение чувствительности и селективных свойств микробиологических тест-подложек PetrifilmTM 53
3.2.1.1 Установление чувствительности микробиологических тест-подложек PetrifilmTM Aerobic Count Plate (AC) при определении КМАФАнМ 53
3.2.1.2 Определение высеваемости и селективных свойств тест-подложек PetrifilmTM Enterobacteriaceae Count Plate (EB) 55
3.2.1.3 Определение степени высеваемости и селективности БГКП на тест-подложках PetrifilmTM Сoliform Count Plate (CC) 59
3.2.1.4 Определение чувствительности и селективности тест-подложек PetrifilmTM Staph Express Count Plate 62
3.2.1.5 Использование микробиологических тест-подложек для ускоренного исследования мясного сырья 65
3.2.2 Санитарно-микробиологический мониторинг поверхностей технологического оборудования мясосырьевого цеха при действующем режиме профилактической дезинфекции .65
3.2.3 Определение дезинфицирующей активности Биомола КС3 в отношении энтеробактерий, естественно контаминирующих технологические поверхности 76
3.2.4 Определение КМАФАнМ и санитарно-показательной микрофлоры на поверхностях технологического оборудования после применения 3%-ного раствора Биомола КС3 82
3.2.5 Исследование возможности применения биолюминесцентной АТФ-метрии для контроля качества санации поверхностей технологического оборудования .85 Обсуждение результатов Заключение .120
Предложения для практики .122
Список сокращений и условных обозначений 123
Список использованной литературы 124
- Влияние биопленки, образуемой на технологическом оборудовании, на контаминацию продуктов питания микроорганизмами
- Контроль качества и безопасности на мясоперерабатывающих предприятиях, основанный на принципах НАССР
- Установление чувствительности микробиологических тест-подложек PetrifilmTM Aerobic Count Plate (AC) при определении КМАФАнМ
- Определение дезинфицирующей активности Биомола КС3 в отношении энтеробактерий, естественно контаминирующих технологические поверхности
Влияние биопленки, образуемой на технологическом оборудовании, на контаминацию продуктов питания микроорганизмами
Арабские ученые, исследовав бактерии, изолированные из мясного фарша, пришли к выводу, что наиболее часто встречалась E. coli (44%) и Enterobacter (12%), , Citrobacter (4%), Serratia (8%), Edwardsiella (12%), (8%), Klebsiella (4%) roteus (16%) (140). Другие исследователи микрофлоры сырого мяса отмечали, что чаще регистрировали виды Serratia (17,3%), E.coli (10,0%), Klebsiella (6,7%) и Enterobacter (6,0%) (71, 160). Исходя из данных, представленных учеными, можно сделать заключение о том, что в разных странах и на разных производствах процент обнаружения бактерий будет неодинаков. Однако очевидно, что наиболее часто все же встречаются бактерии семейства Enterobacteriaceae (48, 165).
Бактерии, принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae, включают 48 родов и 219 видов, однако эти цифры в будущем увеличатся. Это семейство включает в себя ряд важных патогенных энтеробактерий, таких как Salmonella, Yersinia enterocolytica, патогенные штаммы кишечной палочки (в том числе O157), Shigella и Cronobacter. Другие члены семьи считаются условно-патогенными микроорганизмами (например, Klebsiella, Serratia и Citrobacter) (50, 169).
В настоящее время обнаружение бактерий семейства Enterobactericeae, в частности, БГКП, является доказательством плохой гигиены или неправильной обработки (особенно термообработки), в случае сбоя процесса дезинфекции и дальнейшего загрязнения продуктов (17, 44, 76).
В большинстве случаев БГКП (включающие Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter и Escherichia) используются как фактор фекального загрязнения пищевых продуктов. Тем не менее, микроорганизмы, не относящиеся к группе кишечных палочек, например, Aeromonas, ферментируют лактозу и могут быть ошибочно отнесены к колиформным бактериям, если дополнительные подтверждающие тесты не выполняются (116). Поэтому в некоторых странах, в зависимости от нормативных требований, пищевая промышленность перешла к тестированию качества продукции по наличию энтеробактерий вообще. Так, регламент ЕС предлагал необходимость тестирования сухих детских молочных смесей для рода Salmonella и Cronobacter (в частности, С. sakazakii) по выявлению бактерий семейства Enterobacteriaceae. И хотя не существует универсального соотношения между обнаружением энтеробактерий и наличием сальмонелл и кронобактера, тестирование продуктов по индикаторным бактериям является простым и относительно дешевым способом (94, 124, 134, 137).
Большинство кишечных болезней в мире, связанных с потреблением продуктов, связаны с бактериями семейства Enterobacteriaceae. Во многих развитых странах сальмонеллез является второй наиболее распространенной причиной бактериального пищевого происхождения после кампилобактериоза. Сальмонеллы широко распространены в природе и большое разнообразие видов-хозяев, включая млекопитающих, птиц, рыб и рептилий. В последнее время сальмонеллезы связаны с загрязнением свежих продуктов. Salmonella вызывает разные формы заболевания и обычно является причиной локализованной инфекции желудочно-кишечного тракта. Большинство здоровых люди выздоравливают без специального лечения, хотя иногда бактерии могут попадать в кровь или лимфатическую систему, что ведет в результате системной инфекции к более тяжелой болезни или даже смерти (2, 150, 176). Род Yersinia широко распространен в природе и может быть найден в почве, воде и у животных, в частности, свиней, но лишь немногие из них являются патогенными для человека. Заражение йерсиниозом может вызвать широкий спектр желудочно-кишечных симптомов, которые зависят от штамма, дозы и восприимчивости и возраста хозяина. Инфекция может иногда привести к осложнениям, включая кожные заболевания и артрит (81, 129).
Род Escherichia обычно находится в желудочно-кишечном тракте человека и других животных, и выделяется, часто в больших количествах, с калом в окружающую среду. Большинство штаммов безвредны – это комменсалы, и хозяева остаются бессимптомными носители этих бактерий. Однако существуют патогенные штаммы, которые генетически разнообразны, энтеропатогенны и энтеротоксигенны. Некоторые хозяева могут выступать в качестве резервуаров для этих бактерий и в последующем загрязнять воду, продукты питания и окружающую среду (88, 139).
Инфекции, связанные с бактериями рода Cronobacter, обычно ассоциируются с болезнями новорожденных. В 1980 году бактерия, вызывающая вспышки среди младенцев, была названа С. sakazakii. Несмотря на широкое распространение, естественная среда обитания Cronobacter остается неизвестной. Неонатальный менингит является наиболее широко признанным клиническим признаком инфекции (82, 120).
С таксономической точки зрения род Shigella следует рассматривать как подгруппу кишечных палочек. Шигеллез, как правило, ограничен воспалением подвздошной и ободочной кишок, но иногда происходит перфорация кишечника (112, 149).
Кроме известных патогенных бактерий, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae, некоторые виды, такие как Providencia alcalifaciens , Klebsiella SPP., Serratia SPP. и Citrobacter SPP., могут стать причиной инфекций человека, включая бактериемии, менингит, инфекции мочевыводящих путей и раневые инфекции (142, 160).
Контроль качества и безопасности на мясоперерабатывающих предприятиях, основанный на принципах НАССР
Для оперативного контроля в производственных условиях часто используют косвенные методы детекции микробных клеток - так называемые «быстрые» методы. Они основаны на определении какого-либо физико-химического параметра анализируемого образца, абсолютная величина которого или её изменение пропорциональны количеству присутствующих в образце микробных клеток.
К косвенным методам детекции микробных клеток относятся: турбидиметрический (определяется мутность микробной суспензии), импедиметрический (регистрируется изменение электропроводности микробной суспензии, которое происходит после того, как титр клеток в ячейке прибора превысит 106 - 107 кл/мл), микрокалориметрический (регистрируется тепловыделение популяции микроорганизмов), методы, основанные на измерении интенсивности дыхания (54, 62, 73).
Методы индикации микробных клеток по содержанию различных внутриклеточных или внеклеточных метаболитов представляют большой интерес, так как отличаются повышенной точностью и воспроизводимостью. Известно, что количественное определение микробных клеток в различных образцах проводят по содержанию различных метаболитов: гемина, гематина, пирувата, эндотоксина, лактата, нуклеиновых кислот (гибридизационные тесты), различных антигенов (иммуноферментный анализ), внутриклеточного АТФ (биолюминесцентный метод) (23, 100, 102).
Метод АТФ-метрии известен уже несколько лет. В его основу положен тот факт, что все живые клетки содержат аденозинтрифосфат (АТФ), который, будучи высокоэнергетическим соединением, участвует в клеточном метаболизме. Метод основан на явлении биолюминесценции (оно известно по светлячкам, у которых в темноте светится кончик брюшка, так как там содержится вещество люциферин и фермент люцифераза). Свет генерируется в присутствии АТФ и ионов металлов (в частности, магния) (157, 168).
Все продукты растительного или животного происхождения, органические загрязнения, оставляемые людьми при прикосновении к исследуемой поверхности, содержат АТФ, причем микробное ATФ представляет собой лишь относительно небольшую долю от общего АТФ. Чем грязнее поверхность, тем больше на ней АТФ (154, 155, 161).
Первоначально для измерения уровня АТФ использовали
сцинтилляционные счетчики, затем начали применять ФЭУ (фотоэлектронные умножители). Первые люминометры были крупногабаритными и их трудно перемещать по производственной зоне.
При появлении портативных люминометров и изобретения способа получения синтетических люциферина и люциферазы метод АТФ-метрии стал относительно дешевым и легким в использовании. Результаты анализа доступны почти мгновенно, а люминометры можно запрограммировать так, что информация передается на компьютер и обрабатывается с помощью специальных программ (трендов). Из-за легкости, с которой теперь могут быть выполнены определения АТФ, этот метод является удобной альтернативой традиционным микробиологическим исследованиям и позволяет в течение нескольких секунд обнаружить наличие пищевых остатков на технологических поверхностях. Это необходимо, так как принципы HACCP требуют, чтобы проводился регулярный плановый мониторинг критических контрольных точек с целью своевременного принятия корректирующих действий. Такие измерения должны обеспечить индикацию качества очистки, но не должны быть интерпретированы как прямой показатель микробного загрязнения поверхности (25, 73, 106). Многочисленными исследованиями определено, что качество гигиенической оценки с помощью АТФ-метрии технологических поверхностей зависит от структуры материалов и, соответственно, остатков продукта, оставшегося на неровных участках поверхности. Таким образом, предельные значения ATФ должны быть определены индивидуально для каждого конкретного производственного подразделения. Если эти условия будут соблюдены, метод биолюминесценции может быть рекомендован для рутинного применения (95, 104, 106).
Некоторые ученые считают, что количество АТФ напрямую коррелирует с концентрацией бактерий на поверхностях технологического оборудования. Биологические образцы, как правило, помимо микробного АТФ содержат соматический и внеклеточный АТФ в концентрациях, часто превышающих концентрацию микробного на несколько порядков. Эти исследования больше касаются определения АТФ у чистых культур или применения различных методов разрушения немикробной АТФ в образце, в результате чего микробные клетки остаются неповрежденными. Поэтому для правильного определения микробного АТФ проводят специальную пробоподготовку образца, включающую такие стадии, как концентрирование микробных клеток или удаление из образца немикробного АТФ. Этот метод представляет практический интерес для подсчета количества живых микроорганизмов, подвергнутых значительным стрессовым воздействиям (замораживание-оттаивание, лиофилизация и др.) (128, 157).
Румынскими учеными при сравнении биолюминесцентного и классического микробиологического методов исследования смывов с технологических поверхностей и образцов мяса птицы на перерабатывающих предприятиях было отмечено, что данные методы имели низкую корреляцию (0,46) (153).
Аналогичные данные были получены японскими исследователями при оценке микробиологического качества питьевой воды на мясоперерабатывающем заводе (коэффициент корреляции двух методов был не более 0,35-0,42) (152).
Статистический анализ подобных исследований воды в США однако показал высокую корреляционную зависимость между АТФ и содержанием микроорганизмов в образцах (0,8-0,84) (173).
Словацкие ученые сравнили качественный (АТФ-метрия) и количественный микробиологический методы при анализе дезинфекционных мероприятий на нескольких мясокомбинатах страны и не заметили прямой корреляционной зависимости между уровнем АТФ и содержанием бактерий на поверхностях технологического оборудования. Микробиологический метод дал отрицательные результаты при высоком уровне АТФ (100).
Испанские исследователи при оценке очистки и дезинфекции поверхностей молокоперерабатывающих предприятий отметили, что при использовании АТФ-метрии оборудование в 97% случаев после санитарных мероприятий находилось в ненадлежащем состоянии, при этом лишь в 50% проб при микробиологических исследованиях были обнаружены санитарно-показательные бактерии (175).
Подобные факты свидетельствуют о том, что тонкая микробная биопленка или даже невидимые слои продукта могут оставаться на поверхности и не обнаруживаться традиционными методами. Кровь и ткани, остающиеся на оборудовании, могут участвовать в увеличении значений АТФ, потому что фермент люцифераза реагирует как с эукариотической, так и с прокариотической АТФ. Наличие невидимых остатков свидетельствует о неадекватной санитарии, и наличие загрязнений может быть обнаружено с помощью АТФ-метрии, в то время как методы бактериологического анализа полезны только для количественного определения микроорганизмов, оставшихся на оборудовании (64, 67, 69).
Люминесцентный метод не может заменить классические микробиологические методы, но он важен для мясоперерабатывающих предприятий, где применение системы НАССР, то есть быстрое реагирование (мгновенные результаты) на возникшую проблему является необходимым. Достижения в этой области в сочетании с важностью быстрых микробиологических анализов составит основу подобной практики в будущем. Мясоперерабатывающие предприятия, как и другие отрасли пищевой промышленности, несут ответственность за выпуск безопасной и качественной продукции. В отличие от контроля качества, который является реактивной системой, фокусирующейся на юридических требованиях, собственно обеспечение качества пищевых продуктов является превентивным подходом. Эти процедуры должны быть надежными, быть сосредоточены на потребителе и регулярно пересматриваться.
Установление чувствительности микробиологических тест-подложек PetrifilmTM Aerobic Count Plate (AC) при определении КМАФАнМ
Корреляционная зависимость между бактериальной контаминацией и значениями АТФ представлена на рис.12 (средние значения).
Кроме того, было отмечено, что у золотистого стафилококка показатели АТФ были выше показателей у энтеробактерий в среднем в 1,3-2,2 раза, что может быть связано с особенностями структурно-функциональной организацией стафилококков.
На следующем этапе в соответствии с принципами НАССР были выбраны критические контрольные точки – зоны максимального риска загрязнения, т.е. оборудование и предметы, непосредственно контактирующие с мясным сырьем и являющиеся наиболее вероятным источником микробиологического загрязнения. С этой целью мы определили уровень КМАФАнМ в смывах с поверхностей различных объектов мясосырьевого цеха в процессе работы. Результаты проведенных исследований приведены в таблице 11.
Из данных таблицы 11 видно, что наибольшее количество бактерий содержалось на поверхностях таких объектов, как столы рабочие для разделки, разделочные полимерные доски, биг боксы, китайки, пластиковые ящики, транспортеры и конвейер разделки птицы (1,6 х 106 - 6,3 х 107 против 2,2 х 104 -4,7 х 105 КОЕ/см3 на других технологических точках мясосырьевого цеха).
Учитывая то, что была отмечена пропорциональная зависимость между уровнем АТФ и концентрацией клеток у чистых культур бактерий, нам было важно установить, существует ли корреляция этих значений в производственных условиях. С этой целью были исследованы смывы с технологических поверхностей мясосырьевого цеха с определенным значением КМАФАнМ на содержание АТФ. Результаты проведенных исследований показаны на рис.13. Рис.12
Корреляционная зависимость между числом микроорганизмов и значениями АТФ На основании анализа результатов, представленных на рис. 13 видно, что в условиях мясосырьевого цеха, в отличие от лабораторных испытаний, не отмечено зависимости между числом бактерий и уровнем АТФ на поверхностях технологического оборудования. Это, вероятно, объясняется наличием на поверхностях различных белковых и жировых компонентов, соматических клеток и внеклеточной АТФ, увеличивающих или снижающих люминесцентный сигнал. Поэтому мясное загрязнение является одним из важных факторов, приводящих к образованию защитных «биопленок» на поверхностях технологического оборудования.
На следующем этапе проводили комплексное исследование уровня КМАФАнМ, БГКП, энтеробактерий и суммарной АТФ в смывах с технологических поверхностей, контактирующих с мясом, до проведения профилактической дезинфекции. Результаты опытов, проведенных по этому вопросу, представлены в таблице 12.
Как видно из данных, приведенных в таблице 12, средний уровень КМАФАнМ до санации составлял (2,4±0,3)х106 -(5,6±0,7)х107 КОЕ/см3, БГКП – (2,0±0,3)х103 - (6,8±0,7)х104 КОЕ/см3, энтеробактерий – (2,7±0,4)х104 - (5,9±0,7)х105 КОЕ/см3. В то же время уровень КМАФАнМ, БГКП и энтеробактерий оказался заметно выше на таких объектах, как биг боксы и транспортеры, причем количество бактерий при разделке кур было в среднем выше в 10 раз по сравнению с таковым при разделке говядины и свинины. Рис. 13
Что касается показателей уровня АТФ в исследованных смывах, числовые значения находились в пределах 23066,7±2768,3 - 80233,3±5205,1 RLU, причем несколько выше показатели были в смывах с поверхностей биг боксов (42100,0±3675,6 - 46100,0±1571,6 RLU) и транспортеров (52066,7±2720,9 -80233,3±5205,1 RLU), тогда как на остальных объектах уровень АТФ находился в пределах 23066,7±2768,3 - 37866,7±3496,2 RLU. Несмотря на то, что содержание бактерий в смывах с поверхностей оборудования, контактирующего с мясом кур, было выше, каких-либо заметных различий в показаниях биолюминометра отмечено не было.
Следующим вопросом, который нам необходимо было решить, был выбор пороговых значений АТФ для правильной оценки результатов качества мойки. С этой целью важно было установить верхнее и нижнее пороговые значения, так как при превышении верхнего порогового значения санитарная мойка оборудования считается неудовлетворительной и должна быть выполнена повторно. Если АТФ не превышает нижнего порогового значения, то качество профилактической дезинфекции считается удовлетворительным и технологический процесс не прерывается. Установлены ориентировочные пороговые значения АТФ для оценки качества мойки на различных производствах, но эти значения в пределах одного и того же предприятия могут значительно варьировать. Именно поэтому в соответствии с принципами системы НАССР установление пороговых значений для каждой из выбранных контрольных точек в условиях мясосырьевого цеха Черкизовского мясокомбината являлось очень важным.
Определение дезинфицирующей активности Биомола КС3 в отношении энтеробактерий, естественно контаминирующих технологические поверхности
Санитарно-профилактические мероприятия проводят прежде всего для того, чтобы максимально эффективно удалить с поверхности все нежелательные материалы (пищевые остатки, микроорганизмы и посторонние примеси) до приемлемого уровня, при котором угроза для качества или безопасности продукта минимальна. В соответствии с принципами НАССР должны тщательно выполняться программы очистки и дезинфекции, а также мониторинг и контроль этих программ для обеспечения их успешного выполнения (78, 119).
В связи со значительным процентом обнаружения в смывах при действующем режиме санации условно-патогенной микрофлоры, преимущественно энтеробактерий, мы провели ряд опытов по отработке новых режимов профилактической дезинфекции с целью снижения уровня контаминации поверхностей технологического оборудования.
Было установлено, что большинство объектов было эффективно продезинфицировано препаратом Биомол КС3 в 3%-ной концентрации при однократном применении (температура 45-500С, экспозиция 15-20 мин и расход препарата 0,2-0,4 л/м2). Наиболее загрязненные объекты обеззараживались только при двукратной обработке 3%-ным раствором Биомола КС3 при температуре 45-500С и экспозиции по 15 минут.
При определении остаточной загрязненности технологического оборудования после отработки нового режима дезинфекции санитарно показательная микрофлора выделялась лишь в 4,9% проб, что в 5, 7 раза ниже, чем при использовании 1%-ного раствора Биомола КС3. Применение 3%-ного р ра Биомола КС3 позволило снизить уровень энтеробактерий, не включающих БГКП с 26,0 до 5,4%, БГКП с 14,8 до 0,2%, а стафилококков – с 4,9 до 0,1% по сравнению с действующим режимом санации технологических поверхностей и инвентаря. Также отмечено снижение уровня КМАФАнМ в 7,2 раза. Согласно принципам НАССР на мясоперерабатывающих производствах после операций по мойке и дезинфекции необходимо проводить не только микробиологические исследования, но и контроль степени чистоты остатков продукции, которая становится источников загрязнения мясного сырья. Одним из методов, которые могут быть применимы для быстрого мониторинга чистоты технологических поверхностей, является остаточный уровень АТФ. Это метод интегральной оценки загрязнения на основе количественного обнаружения аденозинтрифосфата в образцах. В настоящее время применение АТФ биолюминометров различных фирм и моделей для оценки эффективности санитарной гигиены стало привычным, поскольку результаты проведения измерений в смывах можно получить в кратчайшие сроки (в течение нескольких минут), а работа с приборами достаточно проста (154, 156, 172).
Исследователи разных стран пытаются выяснить, насколько количество микроорганизмов коррелирует с уровнем АТФ, при этом данные исследований могут значительно варьировать (152, 168).
Результаты наших опытов с использованием чистых тест-культур в концентрациях от 102 до 106 КОЕ/мл позволили установить линейную зависимость показаний биолюминометра и количеством жизнеспособных клеток, что соответствует данным других авторов (58, 173). Однако при сравнении КМАФАнМ и уровня АТФ в смывах с оборудования и инвентаря мясосырьевого цеха нами не отмечалось какой-либо корреляционной зависимости между этими показателями. Это можно объяснить присутствием на поверхностях невидимых биопленок и органических загрязнений, изменяющих люминесцентный сигнал. Подобный факт отмечает большинство исследователей (153, 157), хотя некоторые ученые придерживаются противоположной точки зрения, выявляя в производственных условиях прямо пропорциональную зависимость между содержанием бактерий на технологических поверхностях и уровнем АТФ (128, 173).
В соответствии с принципами НАССР предполагается обоснованный выбор критических контрольных точек (ККТ) как наиболее важных при контроле гигиены на производстве, поскольку именно состояние чистоты в этих точках обеспечивает безопасность и высокое качество продукции. ККТ являются зонами максимального риска загрязнения – оборудование и инвентарь, непосредственно контактирующие с мясом и мясопродуктами. Сравнивая показатели биолюминометра с установленными пороговыми значениями, ответственные за качество санации сотрудники на месте принимают решение либо о продолжении технологического процесса, либо о необходимости повторной мойки и дезинфекции (32, 54, 73, 104, 110).
Прежде, чем установить нижнее и верхнее пороговые значения АТФ, мы провели опыты по визуальной оценке и микробиологической контаминации наиболее загрязненных точек в мясосырьевом цехе и установлении таким образом критических контрольных точек.
Было установлено, что помимо незначительных видимых загрязнений остатками мяса и жира наибольшее КМАФАнМ (1,6 х 106 - 6,3 х 107 КОЕ/см3) было на поверхностях таких объектов, как столы рабочие для разделки, разделочные полимерные доски, биг боксы, китайки, пластиковые ящики и транспортеры, которые и были выбраны в качестве ККТ для дальнейшей отработки параметров АТФ-метрии.
Уровень АТФ в смывах с критических контрольных точек был в пределах 23066,7±2768,3 - 80233,3±5205,1 RLU, особенно на поверхностях биг боксов (42100,0±3675,6 - 46100,0±1571,6 RLU) и транспортеров (52066,7±2720,9 -80233,3±5205,1 RLU).