Содержание к диссертации
Введение
I. Материал и методы
1. Материал 8
2. Выделение ДНК 10
3. Фрагментирование ДНК II
4. Определение длины фрагментов II
5. Радиоактивное мечение ДНК in vitro . 12
6. Кинетика реассопиации ДНК 13
7. Получение уникальных последовательностей 14
8. Молекулярная ДНК-ДНК гибридизация и изучение термостабильности дуплексов . 14
9. Критерий гибридизации 15
10. Буклеазная обработка 17
11. Измерение радиоактивности .17
II. Структура генома
1. Введение 17
2. Кинетика реассоциации ДНК стрекоз . 26
III. Гомологии повторящихся послбщовательносм ДНК
1. Введение 35
2. Гибридизация повторяющейся ДНК стрекоз . 39
IV. Гомологии уникальных послещовательностей ДНК
I. Введение 48
2. Гомологии УП ДНК стрекоз надсемейства i ibeiiuioidea 50,'
3. Гомологии УП ДНК стрекоз надсемейства coenagrionoidea 56
4. Гомологии УП ДНК стрекоз надсемейства Aeschnoidea , ,,60
5. Сопоставление уровня гомологии уникальной ДНК стрекоз и других животных 63
Обсуждение 66
Выводы 72
Благодарности 73
Список литературы
- Выделение ДНК
- Молекулярная ДНК-ДНК гибридизация и изучение термостабильности дуплексов
- Кинетика реассоциации ДНК стрекоз
- Гибридизация повторяющейся ДНК стрекоз
Введение к работе
В гаплоидном наборе хромосом человека содержится примерно три с половиной миллиарда пар нуклеотидов. Каждый из них занимает своё положенное ему место, замена даже единственного нуклео-тида способна привести к мутации, к тяжелой наследственной болезни. И хотя набор нуклеотидов в ДНК невелик (всего четыре варианта), совокупная "запись" из миллиардов букв содержит очень большую информацию (в шенноновском смысле). Эта информация в ДНК не меньше той, что содержится в наследственно определенном фенотипе особи (в строении, в инстинктах), а, принимая существование "эгоистичной" ДНК (не оказывающей влияния на фенотип) [41, 72] - эт& информация ещё больше.
Рассматриваемые последовательности нуклеотидов каждого вида возникли не "вдруг", а из последовательностей в ДНК вида-предка. Таким образом в ДНК каждого вида не только содержится очень большая информация, по которой его можно от других видов отличить, но также - в скрытш виде - очень большая информация о предках. Кажется поэтому заманчивым использовать ДШС для выяснения родства видов или же для построения филогенетической системы TV 2] » особенно в случаях, трудных для геккелевской "триады" методов, используемой обычно в филогенетических реконструкциях. В конечном итоге это могло бы представить интерес не только для кладис-тики. Независимый от "триады" хороший метод оценки родства был бы полезен для изучения закономерностей эволюции, например, касающихся параллелизмов в различных филогенетических ветвях.
Хотя конкретное место в участке ДНК может занимать только один из четырех нуклеотидов, но если нуклеотидов --уже три десятка, то их можно преобразовать таким числом способов, сколько зерен пшеницы потребовал в награду изобретатель шахматной доски. Расчеты показывают, что случайно две последовательности (если они стать похожими, несмотря на то, что в геноме миллиарды нукле-отдцов. Насколько случайно последовательности преобразуются в эволюции - не известно, но мы пока не знаем способа, по которому они изменялись бы конвергентно. По крайней мере естественный отбор, важный фактор конвергентных изменений морфологии организмов, строгсрледя за фенотипом, довольно безразлично относится к самой наследственной основе. Оценки говорят, что примерно 25 % замен нуклеотидов в кодирующей части генов не приведут к заменам ами-нокислот в соответсзующем белке из-за вырожденности кода [61] , а \/ эксперименты показывают, что по крайней мере половина из этих возможных синонимных мутаций в эволюции фиксируется [16] . Вместе с тем, поскольку информация о предках содержится в ДНК в "скрытой", видоизмененной форме, пока ее трудно использовать для нужд / филогенетики. Трудности можно разделить на три группы.
Во-первых, все гомологии в ДНК, хотя они истинные гомофилии, а не гомоплазии, они также суть плезиоморфии по хенниговскои терминологии. Следовательно, мы принципиально не можем воспользоваться методикой обычного филогенетического анализа, пытаясь на их основе строить филогенетическое древо. Обнаружение гомологичных последовательностей, действительно в данном случае говорит о родстве, о том, что у видов был когда-то общий предок, однако -без дополнительных постулатов - не позволяет оценить степень родства. Факт, что общего предка имели ленточный червь и человек, коза и капуста, достаточно очевиден. Задача состоит в установлении именно степени родства. И если процедура классического филогенетического анализа осложняется трудностью отличить: а) прод- ;!! tдвинутое состояние (синапоморфии) от примитивного, б) гомофилию "° от конвергенции, то попытка построения древа по плезиоморфиям (в том числе по гомологиям в ДНК) требует принять особые, необя - 6 зательные для хенниговского анализа постулаты, например допустить, что эволюционная скорость изменения (потери) предковых последовательностей в разных филогенетических ветвях приблизительно одинакова (теория "молекулярных часов").
Во-вторых, принимая сильные постулаты, мы пока только интуитивно можем полагать, хороши они или нет: о закономерностях изменений ДНК в эволюции известно относительно мало. Например, гипотезу, что гены могут удваиваться и после этого дивергировать по функциям, обсуждал уже А.С.Серебровский, а о том, что после удвоения они могут изменять друг у друга первичную структуру, эволюционировать согласованно, стало известно очень недавно(71, 80,8 , а распространенность и значение согласующего их "молекулярного привода" (тяги, "drive") только сейчас начинаем в полной мере осознавать благодаря Г.Доуэру 2,43 . Видимо, корректные допущения могут быть сделаны, когда мы больше узнаем о сходствах и различиях в ДНК групп разного возраста и морфологического разнообразия, когда допущения будут обосновываться или опровергаться не из общих соображений или нескольких примеров, а на большом фактическом материале.
В третьих, не вполне разрешены методические трудности. Например, молекулярная ДНК-ДНК гибридизация в обычных условиях позволяет сравнивать только очень похожие последовательности, различающиеся не более чем на 20-30 %, тогда как нередко необходшло сравнить сильно удалившиеся друг от друга последовательности [53] .
Все это вместе говорит об актуальности сравнительного изучения ДНК. Таьфэго рода сравнения одобряют известные отечественные эволюционисты-зоологи [6, 13].
Один из методов сравнения геномов заключается в изучении реассоциации фрагментов ДНК. С его помощью можно получить све перестройкахдения о крупных изменениях содержания ДНК на клетку, крупных "
- Y генома. Прямые измерения доли гомологичных последовательностей у двух сравниваемых видов позволяет провести другой метод - молекулярная ДНК-ДНК гибридизация [5, 54, 65] . В сочетании с изучением кинетики реассоциапии и препаративным выделением отдельных кинетических компонентов она позволяет установить абсолютное содержание гомологичных последовательностей в интересующих фракциях, генома. Подвергая гибридные молекулы тепловой денатурации, можно дополнительно измерить в пределах гомологичных последовательностей процент совпадающих нуклеотидов (способ расчета см. [зї]). Перечисленные методы были использованы в данной работе.
Проведенное исследование охватывает 29 видов из 10 семейств
ОТрЯДа Odonata (Odonata, Insects). До возрасту И СКОРОСТИ Морфологической эволюции семейства стрекоз, в целом, типичны для насекомых и являются мезо-кайнозойскими. Древнейшие из современных СемеЙСТВ (Gomphidas, Petaluridae, Aeschnidae)n3BeCTIffl ИЗ Юры. Libellulidae и Современные СЄМЄЙСТШ Zygoptera ВСТречаЮТСЯ С
верхнего мела или с палеогена, причем эти относительно молодые группы дали широкую радиацию и доминируют в современной фауне; легко видеть, что их дифференцировка заняла примерно столько же времени, сколько - дифференцировка отрядов плацентарных млекопитающих. ЭВОЛЮЦИОННО КОНСерваТИВНЫе ЖЄ Gomphidae, Petaluridae,
Aeschnidae - ровесники археоптерикса. Поэтому казалось интересным определить, какая доля ДНК отдаленных видов стрекоз сохраняет заметное сходство, и сравнить этот уровень с тем, что известно для таксонов позвоночных такого же ранга. Это было поставлено как первая задача работы.
Второй задачей было - попытаться оценить вклад, вносимый в дивергенцию геномов крупными перестройками ДНК. Кариологически стрекозы хорошо изучены [59] , это достаточно однородная группа. Поэтому возможные отличия видов по содержанию ДНК и ее фракций свидетельствовали бы о деятельности механизмов, независимых от изменений кариотипа.
В третьих, нам хотелось получить информацию, которую можно было бы использовать для спекуляций о родственных отношениях изучаемых стрекоз.
Ввиду отсутствия исследований геномов стрекоз и не многочисленности таковых для насекомых в целом, мы не сочли целесообразным составлять специальную главу с обсуждением литературы. Систематическая ревизия отряда со списком всех современных и ископаемых родов и обсуждением возможных путей эволюции и филогении семейств проведена относительно недавно Ф.Фрэзером [45] . Современные знания о палеонтологии отряда сведены Л.Н.Притыкиной [21] . Анализ эволюции кариотипа стрекоз дан Б.Киаутой [59] со списком хромосомных чисел почти четырех сотен видов.
Выделение ДНК
Фрагменты ДНК получали посредством высокоскоростной гомогенизации растворов нативных препаратов в 0,15 М ацетате натрия с добавлением 67 % глицерина с помощью "viris бок" в режиме 45000 об/мин, 30 мин, 0 С, либо посредством ультразвуковой обработки ДНК в буфере, содержащем 0,3 М ацетата натрия и 0,001 М ЭДТА, рН 7,0, на дезинтеграторе УЗДН-2Т в режиме 22кГц - 0,2 мА, в объёме 20 мл, при 0 С, трижды по 5 мин. Б последнем случае раствор перед обработкой дезаэрировали и насыщали азотом. Продувание азотом производили также в перерывах между сеансами ультразвуковой обработки.
Длину немеченых фрагментов ДНК определяли аналитическим центрифугированием в щелочном растворе (0,9 М NaC1 + 0,1 М NaQH рН 12,5 - 13,0) на ультрацентрифуге, снабженной УФ оптической системой регистрации. Длину фрагментов рассчитывали по известной формуле [84].
Длину меченых фрагментов ДНК определяли гель-фильтрацией на колонке с сефарозой CL-4B в щелочном растворе (0,3 М NaCi и \] 0,1 М NaOH » рН 12,5). В качестве маркеров использовали нефрагмен-тированную ДНК и фрагменты ДНК длиной 200 нуклеотидов, предварительно охарактеризованные помощью аналитического ультрацентрифугирования.
Мечение ДНК in vitro осуществляли посредством ДНК-полиме-разной реакцией по способу "ник-трансляции". Реакционные смеси содержали 0,5 - 1,5 мкг ДНК, 0,05 М TrisHCi , рН 7,2 (или же 0,07 М фосфат калия, рН 7,5), 10 мМ ИдСіг , 10 мМ 2-меркапто-этанол, по 80 мкМ немеченых дезоксинуклеотидтрифосфатов ("Boebxinger", ФРГ), по 4 мкМ 3Н-дезоксинуклеотидтрифосфатов, I - 5 ЄД. ДНК-ПОЛИМеразЫ I ("Boehringer", ФРГ) В КОНЄЧНОМ Объёме 50 мкл. Реакцию ввли при 13 С в течение 14 - 16 часов и останавливали нагреванием при 70 С в течение 10 мин. Очистку от продуктов реакции проводили на колонке с ГАП в фосфатно-мочевинном буфере (8 М мочевины + 0,2 М фосфата натрия, рН $,8). Меченую ДНК снимали с колонки 0,5 М ФБ, рН 6,8. Удельная активность в на с с. ших условиях счета составляла для разных препаратов 10 - 10и имп/мин на I мкг ДНК.
Продуцируемые ДНК-полимеразой I инвертированные повторы отделяли хроматографией меченной ДНК на колонке с ГАП, урановешен-ной 0,12 М ФБ, рН 6,8 при 45 С непосредственно после тепловой диссоциации в том же буфере (103 С, 10 мин). Такие последовательности составляли 10 - 30 % меченной ДНК.
Кинетические характеристики полученной 3Н-ДНК свидетельствовали о равномерном включении метки во все классы последовательностей. Длина меченых фрагментов по результатам гель-флльтрации в щелочном буфере составляла около 150 нуклеотидов.
Короткие фрагменты ДНК (200 - 400 нуклеотидов), растворен-вые в 0,12 М ФБ или в 0,5 М ФБ, запаивали в ампулы или капилляры, денатурировали нагреванием (ГОЗ С, 10 мин) и инкубировали при .: температуре соответственно 60 иди 70 С в течение различного времени. Эти условия соответствуй стандартному критерию или эквивалентны ему [28, 29, ЗІІ . Ход процесса выражали в проценте реас-социировавшей ДЖ в зависимости от C0t (с0 - начальная концентрация ДНК в молях нуклеотидов на литр, - время инкубации в секундах) [28]. При расчете cQt учитквали влияние растворителя на скорость реакции [З І.
Разделение одно- и двунитчатых фрагментов проводили на колонках с ГАП (объем 0,4 см3), снабженных водяной рубашкой и термостатированных на 60 С. Образцы в 0,12 М ФБ наносили на колонки, уравновешенные буфером такой же концентрации. Однонитчатую ДЖ элюировали 5 объёмами (по отошению к объёму ГАП) 0,12 М ФБ. Затем; темшратуру повышали до 95 С, прогревали колонки 5 мин и промывали 5 объёмами того же буфера. Количество ДНК во фракциях определяли спектрофотометрически.
В некоторых опытах вместе с немеченой инкубировали небольшие количества гомологичной радиоактивной ДНК. В этих случаях, после измерения оптической плотности, измеряли радиоактивность фракций.
Разбивку кривых на кинетические кошюненты проводили, представляя их как сумму идеальных кривых второго порядка, затем выбирали вариант, в котором экспериментальные значения лучше совпадают с теоретической кривой. Была использована также компьютерная обработка данных [9І . При расчете кинетической сложности вносили поправку на длину фрагментов [91 .
Молекулярная ДНК-ДНК гибридизация и изучение термостабильности дуплексов
Гибридизацию ДНК проводили в растворе как гетерологичную реассоциацию при соотношении меченой и немеченой ДНК около I: :2000, инкубируя образцы в запаянных капиллярах до нужных значений cQt. Отделение однонитчатых фрагментов проводили на колонках с ГАП при температуре, подобранной в соответствии с критерием инкубации. Для учёта самореассоцияции и неспецифической сорбции на колонках в каждую серию включали контрольные пробы, содержащие 3Н-ДНК и, обычно, фрагменты ДНК быка или бактерии в тех же соотношениях, как в остальных реакциях.
Ступенчато повышая температуру в колонках с сорбированной гибридной ДНК от температуры фракционирования до 95 С с интервалом в 5 С и элюируя диссоциирующие гибриды, можно получить гистограмму, отражающую общее количество гибридных молекул и распределение их по термостабильности (для простоты гистограмму можно заменить графиком хода термоэлюции) (рис. I).
Результат дивергенции геномов заключается в том, что либо в перекрестной реакции образуются в среднем менее стабильные молекулы за счет точковых мутаций (рис. 1,6), чем в гомологичной (рис. 1,а) (удобная мера этих различий - AT Q - Разница температур, при которых диссоциирует половина гомологичных и гетероло-гичных гибридов); либо в перекрестной реакции образуется меньше гибридных молекул (например, часть последовательностей выпала в результате делеций) (рис. 1,в). Обычно имеют место оба результата одновременно (напр., рис. 20).
Накопление большого числа различий в последовательностях ведет к тому, что они теряют способность образовывать гибриды в стандартных условиях (рис. 2). Из идеального распределения потенциально возможных гибридов двойной штриховкой выделены молекулы, отмечаемые как гомологичные при стандартном критерии гибридизации и фракционирования (0,12 М ФБ, 60 С); простой штриховкой выделены молекулы, добавляющиеся к ним при определенном смягчении условий.
Смягчение условий, однако, снижает специфичность комплементарных взаимодействий нитей ДЖ и специфичность хроматографии на ГАПе: во фракцию "двунитчатых" молекул всё больше попадает фрагментов 3Н-ДБК, не образовавших действительных комплементарных структур (рис. 2, прерывистая линия). Очевидно, что баланс между выгодами и невыгодами от смягчения критерия зависит от идеального распределения потенциальных гибридов и от количественного эффекта факторов, снижающих неспецифические взаимодействия.
В данной работе был испытан широкий спектр критериев гибридизации и фракционирования в диапазоне 8 - 20 мягче стандартно-го. Реакции вели в 0,4 - 0,5 М Ш при температурах 50 - 60 С, либо в 0,35 - 0,5 М ФБ в присутствии 30 % формамида (ФА) при 28 -36 С (30 % ФА по нашему определению снижает Т50 на 20,0 С). Ддя фракционирования и термоэлюции испытывали 0,08 - 0,16 М ФБ, а также 0,12 М ФБ в присутствии либо анионного детергента sos (от 0,02 до 0,4 %), либо 30 % ФА, либо NaCi от 0,5 до 1,0 М (для повышения температуры фракционирования). Эти варианты фракционирования не обеспечивали снижения неспецифической сорбции 3Н-ДНК ГАПом по сравнению с 0,12 М ФБ. Состав гибридизапдонных смесей оказывал большее влияние: специфичность повышалась при снижении ионной силы и при добавлении ФА (53] f компенсируемых соответствующим понижением температуры. При использовании критериев на 10 мягче стандартного, в неспецифическую аггрегацию вовлекалось около 5 % МЄЧЄНІІНХ фрагментов, на 15 мягче стандартного 10 - 15 %.
В отдельных опытах продукты гибридизации перед фракционированием обрабатывали нуклеазой s1 ("воеЬгіпдег, ФРГ). Для этого реакционную смесь разбавляли в 500 раз буфером, содержащим 25 мМ ацетата натрия, рН 4,4, I мМ Zn2SQ4 , 5 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,15 М (или 0,25 М) NaCi и инкубировали при 37 С нужное для полноты переваривания время. При таких условиях однонитевая 3Н-ДНК, не вступившая в реакцию, ферментом разрушается, а несовершенно спаренные структуры, образованные сильно дивергировавшими последовательностями, сохраняются [14, 75] . Нуклеазная обработка снижает неспецифическую сорбцию 3Н-ДЖ при гибридизации.
Кинетика реассоциации ДНК стрекоз
Нами получены данные о реассоциации коротких фрагментов ДНК СТреКОЗ ИЗ 5 СемеЙСТВ Anisoptera И 4 СЄМЄЙСТВ Zygoptera (табл. І). У всех видов отмечены фракции быстро реассоциирующей ДНК, представленные повторяющимися последовательностями нуклеотидов, и медленно реассоцйирующая фракция ДНК, последовательности которой мы принимаем за уникальные, то есть представленные одной копией на гаплоидный набор хромосом. В то же время для отряда в целом свойственно большое разнообразие кинетических характеристик. Так, повторяющиеся последовательности могут составлять разную часть генома (от 20 до 75 %) и, в свою очередь, состоять из компонентов, различающихся по скорости реассоциации и по доле в геноме разных видов. Скорость реассоциации "медленной" фракции ДНК разных видов тожіеодинакова, что говорит об отличиях в содержании ДНК на клетку, если эта фракция действительно представлена уникальными последовательностями. Поскольку полиплоидия в отряде не обнаруживалась, а кариологически группа хорошо изучена, сомневаться в том, что "медленный" компонент - действительно уникальные последовательности, нет оснований. Это позволяет оценить размер генома, который, как оказывается, в пределах отряда может отличаться примерно вчетверо (ОТ 0,4 ПГ у G; flavipes И U tetraphylla до 1,7 ПГ у с, coronatus. При всех различиях виды, принадлежащие к одному семейству, проявляют заметные черты сходства.
Семейство Gomphidae . Кривые реассоциации коротких (200 -250 нуклеотидов) фрагментов ДНК трех видов приведены на рис. 6, . Они заметно отличаются малым размером генома от ближайших родствен НИКОВ - Aeschnidae и Cordulegastexidas . СТОЛЬ МЭЛЫЙ размер ГЄ нома, как у GomphidaB , отмечался прежде из насекомых ТОЛЬКО для некоторых двукрылых [58, 62] , перепончатокрылых [38, 57] и жуков (?]. Это позволяло противопоставлять эти относительно продвинутые отряды таким, как прямокрылые и таракановые[І27] . Стрекозы должны быть отнесены к насекомым примитивным, несмотря на черты специализации. Gomphidae среди разнокрылых стрекоз также не могут считаться продвинутым семейством. В морфологическом отношении они примитивнее Libeiiuiidaa, а ранние их находки датируются нижней юрой [21, 48].
Семейство AsschHTdae . Четыре вида из двух подсемейств имеют определенное сходство структуры генома. Его размеры, оцененные по кинетической сложности (около 1,0 - 1,5 пг) могут считаться средними для насекомых. По сравнению с Gomphidaa в этом семействе больше абсолютное количество как повторяющихся, так и уникальных последовательностей. Примеры кривых кинетики реассоциации ДНК этих стрекоз приведены на рис. 7.
СемеЙСТВО Corduleqasteridae. РеаССОЦИЭЦИЯ КОРОТКИХ фраГМен тов ДНК (220 нуклеотидов) единственного имевшегося у нас вида с. coronatus протекает весьма своеобразно (рис. 3, б). Значительная часть ДНК реассоциирует быстро, поэтому уникальный компонент вычленить на общей кривой технически сложно. 1 2 его, оцененная может быть менее точно, чем для других видов, составляет 5,0x10 , что соответствует размеру 1С = 1,7 пг.
Семейства Corduliidae И LibellulidaB . ЭТИ 0ЄМЄЙСТВа 60ЛЄЄ МОЛОДЫе..В КаЙНОЗОе Среди НИХ (В ОСОбенНОСТЙ.СреДИ Libellulidae) проходили процессы активного видообразования. В строении их геномов заметны отличия, но они вряд ли больше, чем между крайними
Вариантами ВНУТРИ Gomphidaa ИЛИ Aeschnidae. В ГЄНОМЄ С. аепва повторяющихся последовательностей больше, чем у любого из семи видов LibellulidaB (правда, это до некоторой степени может быть Кривые реассоциации коротких фрагментов ДНК s, meridio-naie. 1 _ фрагменты нативной ДНК; 2 - нефракцтонирова-ваная 3Н-ДНК. результатом большей длины фрагментов ДНК). Кривые кинетики реас СОЦИаЦИИ ДНК Libellulidae,B целОМ, ВЫГЛЯДЯТ КЭК Промежуточные МЄВДУ ТаКОВЫМИ GoraphidaeH Aeschnidae (рис. 8, рИС. 9).
Zygoptera . Внутри ЭТОЙ ОбШИрНОЙ ГРУППЫ СТреКОЗ ТЭКЖе ЄСТЬ различия в строении геномов, хотя вместо четырех типов, которые можно условно выделить у Anisoptera из почти что непрерывного ряда (и совпадающих с семействами), здесь можно выделить две группы: Caiop/terygidae-c одной стороны (со структурой генома, напоминаю ЩЄЙ таковую Aaschna ) и Platycnemididae, Coenagrionidaa, Lestidae - С ДРУГОЙ (структура ГеНОМа НаПОМИНаеТ ТаКОВуЮ Libellulidae ).
Типичные кривые хода реассоциации ДНК приведены на рис. 10. На основании приводимых оригинальных данных и анализа литературы кажется, что крупные перестройки, включающие множественные амплификации или делеции, отражающиеся на кинетике реассоциации коротких фрагментов ДНК, закреплялись не с равной вероятностью на разных этапах истории видов. В эволюции стрекоз они, видимо, закреплялись более активно в то же время, когда происходило формирование современных семейетв.
Кинетика реассоциации коротких фрагментов ДНК пары G.fiavipes И G.vulgatissimus ИЛИ S.flaveolum И S meridionale ЯСНО рвЗЛИЧЭ ются, следовательно наблюдаемое единообразие (эволюционная консервативность) обеспечивается не запретом изменения содержания ДНК в клетке, а каким-то контролем, запрещающим переходить определенные границы в этих изменениях.
Гибридизация повторяющейся ДНК стрекоз
Мечвнше тритием фрагменты тотальной ДНК S, Meridionale гибридизовали с короткшж фрагментами тотальной ДНК разных видов стрекоз до cot = 200. Длина меченных фрагментов была оценена приблизительно в 150 нуклеотидов. Мечение и удаление мгновенно реас-социирующей ДНК мало сказалось на кинетике их реассоциации (рис. 8), что говорит о равномерности мечения всех классов последовательностей. На основании этого меченые фрагменты признаны годными для использования в описываемых ниже опытах.
В первой серии опытов смеси ДНК в 0,45 М ФБ отжигали при 60 С. Как следует из данных по кинетике реассоциации (глава II), до значений CQt = 200гибридизоваться должны в основном повторяющиеся последовательности ДНК. Контроль самореассоциации мече: -ных фрагментов проводили, инкубируя 3Н-ДНК в контрольных пробах при таких же условиях. Перед фракционированием контрольных образцов добавляли гетерологичную балластную ДНК.
Несмотря на то, что использованный критерий гибридизации мягче стандартного, в реакцию гибридизации даже с представителями семейства Libeiiuiidae вступила только неболыпая часть фрагментов 3Н-ДНК (табл. 3), между тем как реассопдация (гомологичная гибридизация), регистрируемая сшстрофотометрически, протекала в хорошем соответствии с полученными прежде данными по кинетике реассоциации. Это говорит об отсутствии изъянов в гиб-ридизационной системе, следовательно, низкий уровень гибридизации есть результат далеко зашедших изменений геномов стрекоз, произошедших после дивергенции, сильно контрастирующих с теми различиями, которые наблюдаются при сравнении видов внутри семейств позвоночных.
В связи с, этим была проведена вторая серия опытов при еще более мягком критерии. Отжиг проводили в 0,45 М ФБ при 55 С до cQt=2oo, как и ожидалось, процент гибридизации повысился, а термостабильность дуплексов снизилась (табл. 3). С представителями других семейств стрекоз реперный вид обнаруживает при использованном критерии 16 ± 5 % общих повторяющихся последовательностей, накопивших большое число замен нуклеотидов. Считая, что понижению Т д на I С соответствует I % неспаренных оснований [ЗЇ], их долю можно оценить количественно. В среднем для повторов ДНК он оказывается 20 - 25 %, что не исключает наличия семейств последовательностей, члены которых дивергировали в меньшей или в большей степени. При нашем числе параллёльныхопреде- лений нельзя достоверно определить, являются ли гетеродуплексы, образуемые Ш ДНК s, meridionaie с представителями одних семейств стрекоз более термостабильными, нежели гетеродуплексы, образуемые с ДНК видов из других семейств. Точно так же сходная степень гибридизации и термостабильности гибридных молекул ДНК наблюдается И При ГИбрИДИЗапДИ С ДНК Е, cyathigerum (Zygoptera), НЄСМОТря На ТО, ЧТО Anisoptera И Zygoptera раЗДеЛИЛИСЬ НЭМНО-ГО раНЬШе, ЧЄМ ОТДеЛЬНЫе СемеЙСТВа Anisoptexa,
Анализ термоэлюнии гомологичных дуплексов трех ВИДОВ Li-beiiuiidae (регистрируемый оптически по нерадиоактивной ДНК) показывает, что их повторяющиеся последовательности обладают внутригеномной гетерогенностью. Это проявляется в образовании при реассоциации двух классов дуплексов, термолабильного и термостабильного. Их можно разграничить по минимуму термоэлюции и отнести к термолабильным дуплексы, денатурирующие до 70 С, а еще сохраняющиеся при этой температуре - к термостабильным (рис. 13 (I)
