Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Механизмы прекопуляционной репродуктивной изоляции у домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s. lato Амбарян Александр Викторович

Механизмы прекопуляционной репродуктивной изоляции у домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s. lato
<
Механизмы прекопуляционной репродуктивной изоляции у домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s. lato Механизмы прекопуляционной репродуктивной изоляции у домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s. lato Механизмы прекопуляционной репродуктивной изоляции у домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s. lato Механизмы прекопуляционной репродуктивной изоляции у домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s. lato Механизмы прекопуляционной репродуктивной изоляции у домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s. lato Механизмы прекопуляционной репродуктивной изоляции у домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s. lato Механизмы прекопуляционной репродуктивной изоляции у домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s. lato Механизмы прекопуляционной репродуктивной изоляции у домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s. lato Механизмы прекопуляционной репродуктивной изоляции у домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s. lato
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Амбарян Александр Викторович. Механизмы прекопуляционной репродуктивной изоляции у домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s. lato : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.08, 03.00.13.- Москва, 2006.- 190 с.: ил. РГБ ОД, 61 06-3/1256

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 10

1.1. Способы видообразования и механизмы репродуктивной изоляции.

1.1.1. Аллопатрическое видообразование. 13

1.1.2. Парапатрическое видообразование 18

1.1.3. Симпатричекое видообразование . 21

1.1.4. «Усиление» и другие последствия симпатрии. 26

1.1.5. Гибридизация и видообразование. 31

1.1.6. Половой отбор, видовое распознавание, выбор полового 36

партнера и концепции формирования этологических механизмов изоляции.

1.2. Механизмы репродуктивной изоляции у домовых мышейшдвидового комплекса Mus musculus s .l.

1.2.1. Прекопуляционные механизмы изоляции. 39

1.2.1.1. Поведенческие и гормональные реакции на 40

обонятельные сигналы как механизмы прекопуляционной изоляции, распознавание запаха особей своего и других видов.

1.2.1.3. Постзиготическая изоляции у близкородственных видов. 47

1.3. Основные хемосенсорные образования носовой полости и принципы кодирования информации в дополнительной обонятельной системе млекопитающих. 50

1.3.1. Обонятельный эпителий. 50

1.3.2. Вомероназальный орган. 52

1.3.3. Тройничный нерв. 54

1.3.4. Септальный орган. 54

1.3.5. Терминальный (конечный) нерв. 55

1.3.6. Обонятельные луковицы. 56

1.3.6.1. Основная обонятельная луковица. 56

1.3.6.2. Дополнительная обонятельная луковица. 59 ,*,> 1.3.6.3. Нейроанатомические проекции. 61

1.3.7. Трансдукция сигнала в обонятельной системе. 64

1.3.8. Виды химических сигналов. 74

1.3.9. Эволюция дополнительной обонятельной системы. 78

Глава 2. Материал и методика

2.1. Материал и методы исследований локализации нейрональной активности в обонятельной системе. 80

2.1.1. Ольфакторная стимуляция животных. 80

2.1.2. Перфузия. 82

2.1.3. Методика удаления вомероназального органа . 82

2.1.4. Покрытие стекол желатином 83

2.1.5. Приготовление серийных срезов 83

2.1.6. Иммуногистохимическое окрашивание срезов. 84

2.2 Поведенческие реакции домовых мышей в ответ на обонятельные сигналы представителей своего и близкородственных видов. 86

2.3 Сравнительный анализ поведения при ссаживании самцов и самок дикоживущих и синантропных видов домовых мышей. 89

Глава 3. Результаты исследований и обсуяадение.

3.1. Локализация нейрональной активности в ответ на стимуляцию хемосигналами эстральной самки своего и близкородственного видов на уровне рецепторной ткани. 95

3.2. Локализация нейрональной активности в ответ на стимуляцию хемосигналами эстральной самки на уровне обонятельных луковиц . 98

3.3. Изучение реакций на обонятельные сигналы у близкородственных видов домовых мышей. 102

3.3.1. Поведенческие реакции домовых мышей в ответ на обонятельные сигналы представителей своего и

близкородственных видов. 103

3.4. Поведение домовых мышей при ссаживании с половыми партнерами своего и близкородственного видов. 123

3.4.1. Сравнительный анализ поведения при ссаживании половых партнеров разных форм домовых мышей 127

3.4.1.1. Ссаживания особей одного вида 127

3.4.1.2. Гетероспецифичные ссаживания 138

Заключение 139

Выводы 148

Список литературы 150

Введение к работе

Актуальность темы. Концепция вида и видообразования была и остается основополагающей в современной синтетической теории эволюции. В основе видообразования лежит формирование репродуктивной изоляции между близкородственными видами. Именно поэтому большинство биологов-эволюционистов рассматривают изучение формирования механизмов изоляции в процессе эволюции как центральную проблему концепции вида и видообразования. Вместе с тем репродуктивная изоляция бисексуальных форм является одним из основных критериев их видовой самостоятельности.

Для объяснения эволюционных процессов, связанных с формированием механизмов репродуктивной изоляции (как пре-, так и посткопуляционной) у близкородственных видов, необходим анализ их функционирования у форм, находящихся на разных этапах дивергенции: у надежно изолированных симпатрических видов, у парапатрических форм, скрещивающихся в зонах контакта, а также у аллопатрических видов и популяций одного вида. Особое место принадлежит изучению особей из естественных зон гибридизации. Традиционно гибридизация оценивается как негативное явление, нарушающее сбалансированность коадаптированных генных комплексов таксонов, что приводит к понижению их приспособленности. При изучении этологической прекопуляционной изоляции одни исследователи оценивают гибридизацию как результат «ошибки» в коммуникации при выборе партнера своего вида, другие - как закономерное явление, объясняющееся возможностью успешной коммуникации между представителями близких таксонов (Панов, 1989).

Следует отметить, что основными модельными группами животных, при изучении которых были разработаны концепции, объясняющие формирование механизмов прекопуляционной изоляции, являются дрозофилы, саранчовые, бесхвостые амфибии и некоторые близкородственные виды рыб и птиц. Основная роль в передаче информации

у этих животных принадлежит визуальным и акустическим сигналам. Грызуны, у которых основную роль в передаче информации играют обонятельные сигналы, изучены в этом отношении гораздо хуже, как и млекопитающие в целом. Значение обонятельных сигналов в прекопуляционной изоляции близкородственных форм по сравнению с визуальными и акустическими находится на начальной фазе изучения.

Актуальность темы настоящей работы, которая в той или иной степени охватывает все перечисленные выше (в том числе, и дискуссионные) вопросы, определяется также и особенностями изучаемого объекта. Синантропные домовые мыши - наиболее частые и обычные обитатели построек человека. Домовые мыши представляют собой эволюциошю достаточно молодую группу и включают формы, находящиеся на разных стадиях дивергенции: симпатрические виды (Mus musculus - М. spicilegus; М. domesticus - М. macedonicus; M.domesticus - М. spretus); парапатрические таксоны, скрещивающиеся в зонах контакта (М. musculus - М. domesticus - М. castaneus); а также аллопатрические виды (М spicilegus - М. macedonicus - М. spretus; М. musculus - М. spretus, рис.1). Относительное морфологическое сходство и одновременно существенные экологические и этологические различия между отдельными видами и формами домовых мышей, а также наличие в природе, с одной стороны, зон гибридизации между некоторыми формами, а с другой - симпатрических видов, нескрещивающихся в естественных условиях, наряду с относительно хорошей изученностью генома делают группу домовых мышей уникальным объектом среди Myomorpha для изучения механизмов изоляции, их развития в фило- и онтогенезе.

С точки зрения систематиков группа домовых мышей - один из наиболее сложных случаев. Поэтому не удивительно, что не существует общепринятой их классификации. Все систематики сходятся во мнениях относительно дикоживущих таксонов и считают их самостоятельными видами (М. spretus, М. macedonicus, М. spicilegus). Напротив, относительно

синаптропных таксонов нет единой точки зрения. Мы рассматриваем домовых мышей как надвидовой комплекс первого порядка Mus musculus s.l. по Хафферу (Haffer, 1986), включающий в себя надвид синантропних домовых мышей (виды М. musculus Linnaeus 1758:62, М. domesticus Shwartz, Shwartz, 1943:65, M. castaneus Waterhouse, 1842:145) и три алловида дикоживущих (М. spretus Lataste, 1883:27, М. macedonicus Petrov, Ruzic, 1983:177, M. spicilegus Peteny 1882:114 -Котенкова, 2000).

Цели и задачи работы. Целью исследований было изучение роли поведенческих и физиологических механизмов прекопуляционной изоляции у близкородственных видов домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus sensu lato.

Исходя из целей работы, был поставлен ряд конкретных задач:

1) сравнительный анализ активации рецепеторных клеток
вомероназального органа самцов мышей в ответ на стимуляцию запахом
эстральной самки своего и чужого видов;

  1. сравнительный анализ прохождения обонятельных сигналов особей своего и близкородственных видов от выстилки вомероназального органа до структур центральной нервной системы;

  2. изучение поведенческих реакций на обонятельные сигналы особей своего и близкородственного видов;

  3. изучение роли поведенческих взаимодействий, выразительных поз и телодвижений в репродуктивной изоляции симпатрических и аллопатрических видов у домовых мышей.

Научная новизна. В данной работе впервые для млекопитающих проблема механизмов изоляции рассматривается на разных уровнях организации: рецепторном (обонятельный анализатор) и организменном (анализ поведенческих взаимодействий потенциальных половых партнеров, выбор полового партнера по обонятельным сигналам). При этом показано, что у нескрещивающихся в природе симпатрических видов домовых мышей изоляция обеспечивается ее многократным дублированием на разных

уровнях: от различий в поведении до разницы в рецепторном коде сигнала. Впервые проведен сравнительный детальный анализ полового поведения у близкородственных видов домовых мышей.

Практическая ценность работы. Домовые мыши наносят существенный экономический ущерб хозяйству и являются носителями опасных для человека инфекционных заболеваний, таких как чума, туляремия, лептоспироз и др. (Кулик, 1979), что приобретает особое значение в связи с синантропным образом жизни и широким распространением представителей надвидового комплекса синантропных домовых мышей. Эти грызуны заселили практически все материки и сумели проникнуть далеко на север, где постоянно обитают в жилищах человека (Романова, 1971; Прилуцкая, 1984; Кучерук, 1994). Детальное понимание процессов коммуникации домовых мышей, особенностей восприятия обонятельных сигналов, могут способствовать разработке новых нетоксичных методов регуляции их численности.

Благодарности. Автор выражает благодарность доктору биологических наук, ведущему научному сотруднику ИПЭЭ РАН Е.В. Котенковой и кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику ИПЭЭ РАН В. В. Вознесенской, под руководством которых выполнена настоящая работа.

Автор выражает благодарность кандидату биологических наук старшему научному сотруднику ИПЭЭ РАН А.В. Сурову, любезно предоставившему для проведения опытов сконструированную им экспериментальную камеру для изучения реакции мелких грызунов на обонятельные сигналы; зоологу Симферопольской санэпидстанции Н.Н. Товпинцу за помощь в отлове кургапчиковых мышей, директору фирмы РЭТ В.А. Рыльникову, предоставившему домовых мышей из г. Москвы.

В диссертацию вошли результаты исследований, выполненных автором при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований грант 04-04-48412.

\">"-1

Mus domesticus

, ... , ., -,-. -. "—-—,-. -

.

\ - .

Рис. la. Ареалы разных видов домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s. 1.

V

Рис. 16. Пути расселения синантропных таксонов домовых мышей из центра возникновения - Северной Индии (по Boursot et al, 1996).

m-M.musculus, d-M.domesticus, Ъ-M.d. bactrianus (= praetextus).

Симпатричекое видообразование

Э. Майр (1968) отвергал наличие симпатрического видообразования, он писал: « вид и эволюция», с.383). В Обсуждение симпатрического экологического видообразования позволяет нам прийти к заключению, что в этой гипотезе нет необходимости, и что она не подкреплена неопровержимыми данными. Она игнорирует тот факт, что видообразование происходит на уровне популяции, а не на уровне особи, и преуменьшает трудности, связанные с явлениями расселения и рекомбинации генов в ходе полового размножения» («Зоологический настоящее время продолжаются дискуссии между сторонниками и противниками симпатрического видообразования, однако, многие эволюционисты признают его наличие (Гриценко и др., 1983). При этом под симпатрическим видообразованием понимают «возникновение механизмов репродуктивной изоляции под действием естественного отбора в пределах первоначальной области рассеивания потомков одного дема» (Гриценко и др., 1983; с. 126). По мнению Вайа (Via, 2001), основная трудность в моделировании симпатрического видообразования связана с противопоставлением друг другу процессов, которые, с одной стороны, формируют и закрепляют межпопуляционные генетические различия, а с другой - размывают их, гомогенизируя генофонд сосуществующих популяций. Наиболее значимым с этой точки зрения является эволюционный баланс факторов рекомбинации и дизруптивного отбора. В последних моделях рассматривается эффект рекомбинаций, который ограничивает возможность фиксации специфических комбинаций локусов, отобранных дизруптивным отбором. Согласно этим моделям, влияние рекомбинаций на ассортативность скрещивания элиминируется непосредственным действием отбора на локусы, ответственные за выбор, местообитания; такой отбор должен непосредственно приводить к ассортативности скрещивания (поскольку за выбор местообитания ответственны отдельные локусы, а не их комбинации, то, следовательно, и сам факт рекомбинаций не может1 оказывать влияния на ассортативность скрещивания). Также допускается возможность влияния отбора на формирование механизмов, приводящих к ассортативности скрещивания плейеротропно - т.е. вне зависимости от рекомбинаций (Rice, 1984; Rice, 1987; Diehl, Bush, 1989). Показано, что сцепление определенных локусов, приводящих к ассортативности скрещиваний, под действием дизруптивного отбора должно облегчить видообразование, ограничивая эффект рекомбинаций (Kondrashov, Mina, 1986). Таким образом, динамика и завершение дивергенции зависят от баланса между отбором и рекомбинацией. Кроме того, в ходе проведения лабораторных исследований было обнаружено, что видообразование при симпатрии под действием однонаправленного и сильного отбора не происходит (Rice, Hostert, 1993). Это указывает на наличие множественных факторов отбора в обеспечении репродуктивной изоляции между симпатрическими популяциями. Иными словами, критический объем 9 дивергенции создается не сильным дизруптивным отбором по характеристикам одного признака, но множественным отбором, ( оказывающим кумулятивный эффект по группе признаков. В соответствии с этим, полевые исследования дивергирующих рас и видов также продемонстрировали, что они испытывают действие множественных форм отбора (Via, 1991; Feder, 1998; Via, 1999; Via et al., 2000; Filchak et al., 2000). В целом видообразование при симпатрии облегчается экологическим и генетическим смещением признаков относительно местообитания или по виду - хозяину (описано для на насекомых - фитофагов (Bush, 1975; Abrahamson, Weis,1997), но может быть продемонстрировано и для других таксонов (Theron, Combes, 1995) и экологическими факторами, j способствующими адаптативной радиации в обедненных (с большим / количеством возможных экологических ниш) и изолированных/ местообитаниях, таких как маленькие озера и острова (Schliewen et al., 1994; Schluter, 1996a; Schluter, 1996b, 1998; Wilson et al., 2000). Отсутствие непрерывности в условиях окружающей среды ограничивает поток генов между дивергирующими таксонами (Bush, 1975; 1994; Abrahamson,Weis,1997; Hatfield, Schluter, 1999; Via et al, 2000). В настоящее время стало очевидно, что действие множественных форм естественного и полового отбора необходимо для завершения видообразования при симпатрии (Rice, 1987; Rice, Hostert, 1993; Doebeli, 1996; Higashi et al., 1999).

Механизмы репродуктивной изоляции у домовых мышейшдвидового комплекса Mus musculus s

Традиционно исследователи рассматривали видовое распознавание, выбор полового партнера и половой отбор как самостоятельные проблемы коммуникации животных. С начала 90-х годов наметилась тенденция к изучению этих проблем не только в тесной взаимосвязи (Ryan, Rand, 1993), но и в связи с анализом и разработкой концепции механизмов изоляции, причем с учетом влияния экологических факторов на эволюцию характеристик сигналов и воспринимающих их систем.

Половой отбор - это результат успешного дифференциального скрещивания &ежду особями внутри популяции (Panhuis et al., 2001). v Дифференциальность в скрещивании в данном случае определяется наличием конкуренции. Конкуренция за оплодотворение выражается либо в прямом соперничестве между особями одного пола (например, конкуренция между самцами или их спермой), или в опосредованном - за аттрактивность / для особей другого пола (выбор самки). С другой стороны, предпочтения одного пола (чаще самок), направленные на выбор определенных вторично-половых признаков у другого пола (чаще самцов) могут приобретать1 значение фактора сильного полового отбора, если эти предпочтения вызывают возрастание разброса в репродуктивном успехе у особей противоположного пола. (Boake, 2002). Хотя долгое время считалось, что половой отбор важен для внутрипопуляционной эволюции, в последнее время признана его роль, как основополагающей силы процесса видообразования. Видообразование, распад одного вида на два или более, может происходить посредством полового отбора, если параллельное изменение половых предпочтений и вторичных половых признаков внутри популяции приводит к презиготической изоляции между популяциями, и это становится основной причиной репродуктивной изоляции.

Основной возникающий при этом вопрос - являются ли признаки, определяющие выбор полового партнера случайными или они непосредственно связаны с адаптацией к тем или иным условиям существования? Модель межполового отбора, предложенная Фишером, предсказывает, что как вторичные половые признаки самцов, так и предпочтения самок преимущественно произвольны (Fisher, 1930; Lande, 1981). Любой вторично-половой признак, которому самки оказывают предпочтение, может подвергаться действию отбора в том случае, если он каким-то образом коррелирует с «качеством» потомства, происходящим от данного самца. Следовательно, эти случайные особенности должны свободно варьировать между популяциями, а дивергенция по ним должна происходить достаточно свободно (Lande, 1982). Напротив, согласно теории сенсорного драйва, как вторичные половые признаки самцов, так и сенсорные системы, определяющие половые предпочтения самок, адаптированы к локальным условиям окружающей среды (West-Eberhard, 1983; Endler, 1992). Таким образом, сенсорный драйв выступает как интегрированная эволюция коммуникативных сигналов, сенсорных систем и собственно поведения, связанного с передачей информации. Такая интегрированная эволюция этих составляющих обусловлена действием ограничивающих передачу сигналов физических условий локального местообитания и особенностями нейрофизиологии, сформировавшимися в историческом развитии систем восприятия сигналов того или иного вида (Endler, 1992, 1993). Поскольку естественный отбор благоприятствует сигналам, точно соответствующим характеристикам восприятия, то становится очевидным, что дивергенция по особенностям восприятия между популяциями, занимающими различные местообитания, может быть еще одним источником дивергентного отбора по вторичным половым признакам самцов (Endler, 1993). Например, наибольшая чувствительность по частоте звукового сигнала различается между разными популяциями лягушек Acris crepitans (Wilczynski, 1992). / Доминирующая частота зова самцов из разных популяций этого вида колеблется в соответствии с колебаниями спектральных характеристик восприятия звука у самок (Ryan, 1990). Таким образом, системы воспроизведения сигналов самцами и их восприятия самками тесно взаимосвязаны (Wilczynski, 1992). А поскольку популяции занимают различные локальные местообитания, то можно предположить, что межпопуляционные вариации вперцепции и характеристики сигналов коррелируют с различиями в условиях среды обитания (Ryan, 1990).

Методика удаления вомероназального органа

Через 2-3 минуты после завершения экспозиций животным вводилась летальная доза наркоза (V-pental, 40мкг/кг). Перфузия осуществлялась 3% раствором формалина при помощи шприцов объемом 50 мл. Вскрыв грудную клетку и обнажив сердце, мы делали надрез стенки правого предсердия, одновременно вводя в желудочек противоположной стороны иглу шприца, наполненного физиологическим раствором на основе фосфатного буфера. Hak Раствор прекращали вводить тогда, когда из надрезанного предсердия начинала вытекать не кровь, а физиологический раствор. После этого, не вынимая иглы, шприц с физиологическим раствором заменяли на шприц, заполненный раствором формалина. Перфузия раствором формалина осуществлялась достаточно медленно, для хорошей фиксации требовалось около 20 мл раствора.

После окончания перфузии голову отрезали. Череп освобождали от мягких тканей и аккуратно удаляли кости черепа. ВНО извлекалася вместе с хрящевой капсулой, окружающей его. Обонятельные луковицы и ВНО помещали на 16 часов в 3% раствор формалина. Через 16 часов обонятельные луковицы и ВНО помещали в 10% раствор сахарозы (готовился на основе дистиллированной воды) на 24часа. Затем в 20%и 30% растворы сахарозы, также на сутки.

Методика удаления вомероназального органа

Удаление вомероназального органа производилось по методике предложенной C.J.Wysocki (Wysocki C.J., Wysocki L.B. 1995). Операция проводилась под нембуталовым наркозом (в дозе 0,25 мг/кг). Для обеспечения доступа к полости ВНО в мягких тканях верхнего неба непосредственно за зубами делался надрез длиной 1,5 мм, кость просверливалась при помощи зубного бора. Строение полости ВНО и его крепление у мыши позволяют легко извлечь хрящевую капсулу, в которой располагается вомероназальный эпителий, при верном выборе места

Стекла, покрытые желатином, необходимы для приготовления срезов мозга. Мы использовали стекла SuperFrost марки Menzel и Fisher Scientific. Для покрытия желатином 20 стекол необходим 1 литр дистиллированной воды, 5 грамм желатина и 0,5 грамм AlCr. Желатин, медленно помешивая, добавляют в кипящую воду, туда же добавляют AlCr и тщательно перемешивают. Раствор фильтруют. Стекла сначала помещают на 1 мин в теплый раствор (t = 45С), затем на 1-2 мин. в термостат (t= 37С). Повторяют три раза. Стекла оставляют на воздухе на ночь.

Обонятельные луковицы подвергали быстрой заморозке в криостате при -40С. Срезы были изготовлены на замораживающем микротоме Triangle Biomedical при температуре -12С, толщина срезов - 18 мкм, количество срезов через ОЛ одного животного составляло -200 шт. Рецепторная ткань вомероназального органа в хрящевой капсуле также подвергалась быстрой заморозке при -40С. Срезы рецепторной ткани также были изготовлены на замораживающем микротоме при температуре -12С, толщина срезов 18 мкм.

Приготовление растворов

1. Раствор NGS (normal goat serum-нормализованная сыворотка козы) готовился по следующему протоколу: -8 970 мкл PBS (фосфатный буфер, 0.9% NaCl, рН =7,4) -30 мкл Triton Х-100 -1 000 мкл NGS (нормализованная сыворотка козы) Не допускается энергичное встряхивание во избежание образования пены на поверхности раствора.

2. Раствор первичных антител Мы использовали поликлональные антитела c-fos лаборатории Santa Cruz Biotechnology (США) в разведении 1:5000.

3. Раствор вторичных антител -50 мкл готового раствора антител -150MONGS -9 800 мкл PBS

Были использованы биотинилированные антитела, полученные при иммунизации козы антигеном кролика (Biothynilated Anti-Rabbit IG(H+L) made in goat, Vector).

4. Комплекс ABC

Мы использовали ABC Elite kit (Vector Lab.). Набор содержит готовые растворы для приготовления комплекса пероксидаза хрена-биотин-авидин. Раствор готовился за 30 минут до использования. В 10 мл PBS растворяли 4 капли А и 4 капли В (А - раствор авидина, В -раствор пероксидазы хрена, конъюгированной с биотином).

5. Диаминобензидин (ДАБ)

Нами был использован таблетированный ДАБ. Одна таблетка рассчитана на приготовление 15 мл 0.1%-ного раствора. Все работы с диаминобензидином проводились только под тягой. Окрашивание срезов осуществлялось поэтапно в течение трех дней. 1-ый день срезы 3 раза промывали раствором PBS ,при этом стекла каждый раз оставляли в растворе на 5 минут; затем стекла на 20 минут покрывали 0,3% раствором перекиси водорода в PBS; промывка раствором PBS (3 раза по 5 минут); каждое стекло покрывали слоем раствора NGS (normal goat serum), на одно стекло наносилось 500 мкл; инкубация во влажной камере - 2 часа; через 2 часа сыворотку аккуратно сливали, а стекла 3 раза промывали раствором PBS на завершающем этапе срезы покрывали раствором первичных антител и оставляли на ночь во влажной камере.

Локализация нейрональной активности в ответ на стимуляцию хемосигналами эстральной самки на уровне обонятельных луковиц

В серии экспериментов, проведенных по методике "habituation-dishabituation" ("привыкания") предпринята попытка оценки степени сходства и различия обонятельных сигналов у близкородственных видов домовых мышей в зависимости от филогенетической близости этих таксонов. Обычно эта методика используется при оценке индивидуального распознавания особей по запаху. Суть методики состоит в том, что животному на старте предъявляют источник запаха особи своего вида. Продолжительность предъявления выбирают таким образом, что в течение заданного промежутка времени исследовательская реакция, направленная на источник запаха, угасает. Затем для особи открывается доступ к двум другим источникам запаха (или же предъявляется один запах, идентичность которого ранее предъявляемому_надо оценить), одним из которых служит запах той же особи, что был предъявлен экспериментальному животному на старте, другим - запах новой, ранее незнакомой особи. В случае возрастания исследовательской активности, направленной на источник нового запаха, одновременно с отсутствием таковой по отношению к источнику знакомого запаха, результат трактуется как узнавание животным ранее предъявленного запаха, его индивидуального различения при предъявлении в паре с незнакомым. Схема этого эксперимента была экстраполирована Г. Хет и Д. Тодранк (Heth, Todrank, 2000) на изучение сходства и различия обонятельных сигналов в зависимости от степени филогенетического родства у близкородственных видов слепышей. В этой работе сопоставлена степень сходства обонятельных сигналов и филогенетического родства таксонов внутри надвидового комплекса слепышей Spalax ehrenbergi. Авторы предположили, что метод "привыкания" применим для оценки зависимости сходства запаха особей этих видов в зависимости от степени их филогенетичекого родства междувидами. Схема эксперимента была такова На старте животным предъявляли источник запаха особи своего вида, а парными источниками запахов служила подстилка от незнакомых особей близкородственных видов, различающихся по степени родства с представителями вида-реципиента. Результаты опытов объясняли, исходя из предположения, что чем ближе состав сигнальных веществ вида-реципиента и одного из предъявляемых в паре запахов, тем меньше будет продолжительность исследования последнего при его предъявлении в паре с запахом другого близкородственного вида. Именно такая картина и наблюдалась в данных опытах. Результаты проведенных экспериментов, по мнению авторов, подтверждают предполагаемые филогенетические отношения внутри надвидового комплекса слепышей Spalax ehrenbergi, построенные на основании комплексных генетических исследований. Однако наши эксперименты (см. таблицу 4), проведенные на мышах надвидового комплекса Mus musculus s.l., позволяют усомниться в справедливости сделанных исследователями выводов. По результатам опытов в серии М. musculus (стартовый запах); популяция Закавказья - М. macedonicus (парное предъявление) выяснилось, что самцы М. musculus достоверно дольше обнюхивают источник запаха мочи самцов из Закавказья по сравнению с таковым самца М. macedonicus (р 0.01). Сходные результаты были получены в серии М. macedonicus (стартовый запах); М. spicilegus - М. musculus (парное предъявление). Самцы М. musculus обнюхивали источник запаха мочи особей своего вида достоверно дольше, чем представителей М. spicilegus (рО.001). В то же время в серии опытов с комбинацией предъявляемых запахов М. musculus (стартовый запах); популяция Закавказья - М. domesticus (парное предъявление) достоверных отличий в продолжительности реакций обнюхивания источников запаха не обнаружено.

Результаты наших опытов противоречат выдвинутой Г.Хет и Д. Тодранк (2000) экспериментальной парадигме и методика оценки степени индивидуального распознавания неприменима для оценки степени сходства запахов близкородственных видов.

Результаты опытов с применением методики «привыкания», согласуются с полученными с помощью методики парного предъявления источников запаха данными и свидетельствуют в пользу предпочтения мышами разных видов надвидового комплекса М. musculus s.l. обонятельных сигналов от представителей своего вида по сравнению близкородственными симпатрических видов (Соколов и др., 1984, 1985, 1990). При обнюхивании источников запаха двух синантропных парапатрических форм (в данном случае мышей из популяций Закавказья - М. domesticus) достоверной разницы не наблюдается, что подтверждает ранее высказанную гипотезу о сходстве обонятельных сигналов мочи всех синантропных форм и видов домовых мышей (Котенкова, 2000).

Результаты опытов, проведенных с помощью камеры с фотоэлементами, оказались сопоставимы с аналогичными результатами экспериментов по методике «habituation», и, кроме того, позволили выявить различия в характере поведенческих реакций, направленных на источники запаха у двух близкородственных видов мышей М. musculus и М. spicilegus.

Похожие диссертации на Механизмы прекопуляционной репродуктивной изоляции у домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s. lato