Содержание к диссертации
Введение
I Введение 5
1.1. Актуальность работы .5
1.2. Цель работы 6
1.3. Задачи работы 6
II Обзор литературы .8
2.1. Общая характеристика и система семейства Talpidae 8
2.2. Общая характеристика трибы Talpini
2.2.1. Род Talpa .9
2.2.2. Род Mogera 28
2.2.3. Род Euroscaptor .39
2.2.4. Род Parascaptor .46
2.2.5. Род Scaptochirus
2.3. Особенности биологии кротов трибы Talpini как высокоспециализированных землероев 48
2.4. Нерешенные проблемы современной систематики и филогенетики трибы Talpini 50
III Материал и методы 53
3.1. Объем материала и характеристика образцов .53
3.2. Выделение ДНК 75
3.3. Амплификация и секвенирование индивидуальных генов .76
3.4. Обработка и анализ данных по cytb, COI, RAG 1, BRCA1, BRCA2, ApoB, A2ab .79
3.5. Морфологический анализ данных 84
IV Результаты 86
4.1. Филогенетические отношение родов в составе трибы Talpini 86
- Выравнивание и разбиение на партиции 86
- Филогенетический анализ митохондриального гена cytb 86
- Комбинированный анализ ядерных генов и митохондриального гена cytb 88
4.2. Филогения и таксономическое разнообразие рода Talpa 89
4.2.1. Филогенетические отношения видов в составе рода .89
- Филогенетический анализ митохондриального гена cytb .
- Филогенетический анализ индивидуальных генов яДНК 95
- Филогенетический анализ объединенных данных по пяти генам яДНК 100
- Видовое дерево 102
- Сравнение результатов филогенетического анализа митохондриального гена cytb, объединенной последовательности ядерных генов и видового дерева 103
- Анализ видовых границ в роде Talpa 103
- Морфологический анализ кротов Т. caucasica 106
4.2.2. Таксономическое разнообразие рода Talpa 107
4.2.2.1. Криптическое разнообразие и проблемы систематики кротов Кавказа 107
- Т. tatycshensis Vereschagin, 1945 109
- Т. caucasica Satunin, 1908 и Т. ognevi Stroganov, 1948 110
- Группа видов Т. levantis 110
4.2.2.2. Криптическое разнообразие кротов Западной Европы 111
- Т. caeca и Т. stankovici 111
- Испанская ветвь Т. europaea 111
4.2.2.3. Т. altaica и возможная подродовая система рода Talpa 112
4.3. Филогения и таксономическое разнообразие рода Mogera 113
4.3.1 Филогенетические отношения видов рода Mogera 113
- Анализ митохондриального гена cytb 113
- Филогенетический анализ последовательности из объединенных генов яДНК 1 4.3.2. Доказательство видового статусаМ latouchei 116
4.3.3. Континентальные могеры группы M. wogura/М. robusta 1 - Результаты анализа молекулярных данных 117
- Результаты морфологического анализа континентальных форм М. robusta 120
- Проблема таксономического статуса континентальных могер группы М. wogura/М.
robusta 122
4.4. Филогения и таксономическое разнообразие рода Euroscaptor 124
4.4.1. Филогенетические отношения видов в составе рода 124
- Филогенетический анализ митохондриального гена cytb 124
- Филогенетический анализ индивидуальных генов яДНК 127
- Филогенетический анализ объединенных генов яДНК 133
- Видовое дерево 135
- Сравнение результатов филогенетического анализа митохондриального гена cytb, объединенной последовательности ядерных генов и видового дерева 136
- Анализ видовых границ в роде Euroscaptor
Морфологический анализа кротов рода Euroscaptor 139
4.4.2. Криптическое разнообразие кротов Юго-Восточной Азии 141
- Парафилия рода Euroscaptor 141
- E. parvidens .142
- E. longirostris и Euroscaptor sp. 143
- E. subanura 144
4.5. Филогеография ключевых видов трибы Talpini .145
4.5.1. Филогеография видов кротов рода Talpa 145
- T. europaea 145
- T. altaica 157
- T. romana .161
- T. stankov ici 166
4.5.2.Филогеография континентильных форм могер .169
V Обсуждение 173
5.1. Сравнение молекулярных и морфологических гипотез о филогенетических связях в трибе Talpini 173
5.2. Сравнение уровня генетической изменчивости в родах Talpa, Mogera и Euroscaptor. 176
5.3. Связь биологии, филогеографии и криптического разнообразия кротов .177
5.4. Проблемы распознавания видовых границ кротов 179
5.5. Предполагаемый исторический сценарий радиации основных родов в трибе Talpini 1 - Talpa .181
- Mogera .182
- Euroscaptor 184
5.6. Таксономическая интерпретация генетического разнообразия кротов трибы
Talpini .185
VI Выводы 187
VII Благодарности 189
VIII Список работ, опубликованных по теме диссертации 190
IX Список литературы
- Общая характеристика трибы Talpini
- Амплификация и секвенирование индивидуальных генов
- Филогенетический анализ индивидуальных генов яДНК
- Сравнение результатов филогенетического анализа митохондриального гена cytb, объединенной последовательности ядерных генов и видового дерева
Общая характеристика трибы Talpini
Семейство кротовых (Talpidae) вместе с ежами, землеройками и щелезубами входит в состав отряда истинных насекомоядных (Eulipotyphla) (Murphy et al., 2001; Douady, Douzery, 2003).
В современных обзорах по таксономии кротовых приводится от 12 до 17 родов (Гуреев, 1979; Corbet, Hill, 1992; Motokawa, 2004; Hutterer, 2005), взаимоотношения которых противоречивы - причем это касается как систем, основанных на морфологических признаках черепа и зубов (Motokawa, 2004), остеологических характеристиках (Sanchez-Villagra et al., 2006), так и на результатах сравнения последовательностей митохондриальной ДНК (Shinohara et al., 2003, 2004б, 2014; He et al., 2014). Томас (Thomas,1912, цит. по Никольскому, 2002) и Кабрера (Cabrera, 1925, цит. по Никольскому, 2002) выделяли пять подсемейств Talpidae, основываясь на строении черепа и зубов: Uropsilinae, Desmaninae, Condylurinae, Scalopinae, Talpinae. Никольский (2002) придерживается систематики Кемпбелла (Campbell, 1939), в которой семейство Talpidae разделено на шесть подсемейств: Uropsilinae (землеройковые кроты), Desmaninae (выхухоли), Condylurinae (звездорылы), Urotrichinae (низшие настоящие кроты), Scalopinae (высшие настоящие кроты Северной Америки), Talpinae (высшие настоящие кроты Евразии). Согласно последнему изданию «Mammal Species of The World» (Wilson and Reeder, 2005, далее MSW3), семейство включает в себя 3 подсемейства: Talpinae (подземные кроты), Scalopinae (высшие настоящие кроты Северной Америки) и Uropsilinae (землеройковые кроты). Наиболее многочисленно по числу родов и видов подсемейство Talpinae, которое включает в себя виды, принадлежащие к пяти трибам: Desmanini, Neurotrichini, Scaptonychini, Urotrichini и Talpini (Hutterer, 2005).
Впервые триба Tаlpini была выделена Фишером в 1817 г. (Fischer von Waldheim, 1817, цит. по Гурееву, 1979). Представления о филогении и систематике трибы Talpini были основаны в основном на морфологии черепа, зубов и посткраниального скелета. Строганов (1948) по морфологическим и одонтологическим признакам выделял в ее составе 6 родов: Talpa, Mogera, Scaptochirus, Euroscaptor, Eoscalops и Parascaptor. Шварц (Schwarz, 1948), основываясь на зубной формуле и считая, что это лишь вариации одного рода, свел роды Asioscalops, Mogera, Scaptochirus, Euroscaptor, Eoscalops и Parascaptor в синонимы рода Talpa. Штейн (Stein, 1960), применив аллометрический метод исследования структур черепа, выделял такие рода как: Mogera, Talpa, Parascaptor, Scaptochiru s. Согласно данным Хуттерера (Hutterer, 2005) триба Talpini включает в себя пять родов: Euroscaptor, Mogera, Talpa, Parascaptor, Scaptochirus. При этом род Talpa распространен от Западной Европы до Западной Сибири, в то время как оставшиеся четыре рода – в Восточной и Юго-Восточной Азии.
Взаимоотношения между родами по морфологическим данным дискуссионны. Мотокава (Motokawa, 2004), основываясь на морфологии черепов, показал, что представители рода Talpa занимают базальное положение по отношению к остальным родам трибы Talpini; в этой же работе была выявлена парафилия рода Euroscaptor. Однако анализ остеологических данных (Sanchez-Villagra et al., 2006) выявил базальное положение рода Parascaptor и сестринские взаимоотношения родов Mogera и Scaptochirus, В дальнейшем молекулярные данные японских и китайских исследователей (Shinohara et al., 2008; He et al., 2014), а также результаты нашей работы (Землемерова и др., 2013), развернуто представленные здесь в разделах «Результаты» и «Обсуждение», подтвердили морфологическую точку зрения Мотокавы (Motokawa, 2004) о базальном положении рода Talpa и о парафилии рода Euroscaptor.
История изучения рода обыкновенных кротов Talpa Центральный род трибы Talpini – это наиболее широко распространенный род Talpa. Его ареал охватывает весь Палеарктический регион, от Пиренейского полуострова до Сибири. Некоторые авторы включают в него в качестве подродов азиатских Euro scaptor Miller, 1940 (Corbet, 1978; Гуреев, 1979; Corbet, Hill, 1992) и Mogera (Corbet, 1978). Число видов, распознаваемых в составе рода Talpa, менялось с течением времени по мере привлечения новых признаков и методов исследования. Многие современные виды изначально были описаны в качестве подвидов T. europaea, T. romana, T. cаeca (Filippucci et al., 1987).
Строганов (1948) по качественным морфологическим, а также по морфометрическим признакам (наличие век, открытые глаза, длина тела, ширина М2, высота I1,ширина когтя третьего пальца кисти и др.) выделял в роде Talpa шесть видов: T. europaea, T. caucasica, T. orientalis (в настоящее время этот вид относят к подвиду T. caucasica), T. romana (в качестве подвида которого Строганов рассматривал T. stankovici, который в настоящее время выделяют как отдельный вид), T. cаeca (в качестве подвида которого он рассматривал T. occidentalis и T. levantis, которые в настоящее время выделяют в отдельные виды) и Т. altaica.
Гуреев (1979) различал 12 видов: T. minuta, T. europaea, T. altaica, T. cаeca, T. caucasica, T. romana, T. streeti (=Talpa davidiana), T. k lossi, T. grandis, T. parv idens, T. longirostris, T. micrura. В настоящее время последние пять видов относят к роду Euro scaptor.
В настоящее время, с учетом морфологических, кариологических и молекулярных данных, выделяется девять видов рода Talpа: четыре распространены от ближнего востока до Сибири и Алтая: T. altaica Nikolasky, 1883, T. levantis Thomas, 1906, T. caucasica Satunin, 1908, T. davidiana Milne-Edwards, 1884 , четыре из западной Европы: T. caeca Savi, 1882, T. romana Thomas, 1902, T. occidentalis Cabrera, 1907, T. stankov ici Martino и Martino, 1931 и распространенный по всей Европе T. europaea Linnaeus, 1758 (Павлинов, 2003; Hutterer, 2005; Павлинов, Лисовский, 2012).
Амплификация и секвенирование индивидуальных генов
Talpini - одна из наиболее однообразных, как по внешнему виду, так и по характеру адаптаций, группа кротов (Гуреев, 1979). В отличие от полуподземных и наземных кротовых из триб Urotrichini, Neurotrichini, Scaptonychini, представители трибы Talpini в связи с подземным образом жизни имеют ряд морфологических особенностей: голова не отделена от тела шейным перехватом, ушные раковины не развиты, глаза рудиментарны или часто совсем закрыты кожей (Гуреев, 1979). Развитие локомоторной системы шло в направлении увеличения эффективности копания, что позволяло отрывать туннели не только в легком, но и в тяжелом грунте. Происходило возникновение ключично-плечевого сочленения и последующие преобразования локомоторного аппарата. Появлялась прямая связь плеча с осевым скелетом (помимо лопатки), позволяющая практически неограниченно наращивать латерильные усилия, прилагаемые к субстрату (Никольский, 1978). Кроме того, происходила гипертрофия мускулатуры передней конечности, расширение плечевой кости и кисти, укорочение ключицы, удлинение рукоядки грудины, укорочение голени и стопы (Никольский, 2002).
Интересная особенность была обнаружена в строении половой системы у T. romana, T. europaea, T. occidentalis и T. stankov ici, вероятно, связанная с особенностями поздемного образа жизни и поведения. Самки этих видов имеют так называемые овотестикулы – гонады, содержащие ткани и яйцеклеток и тестикулов (Jimnez et al., 1993; Sanchez et al., 1996; Whitworth et al., 1999).
При этом самки остаются фертильными, в то время как семенниковые клетки стерильны и функционируют только для выработки тестостеронов. Среди других представителей семейства Talpidae такая особенность была обаружен у M. wogura (Carmona et al., 2008), Galemys pyrenaicus (Peyre, 1961, цит. по Carmona et al., 2008), Condilu ra cristata (Rubenstein et al., 2003), однако у Urotrichus talpoides (Carmona et al., 2008), Sca lopus aquaticus, Scapanulus latimanus и Scapanulus orariu s (Rubenstein et al., 2003) такой особенности обнаружено не было. Беолчини с соавторами (Beolchini et al., 2000) предполагают, что существует связь между присутствием в организме самок андрогенов и отсутствием ярко выраженного полового поведенческого деморфизма у кротов. Кроме того, ранее была показана чувствительность мышечной ткани к наличию андрогенов в огранизме как самцов, так и самок (Krieg, 1976, цит. по Beolchini et al., 2000) и, верояно, это связано с тем, что самкам, так же как я самцам, требуется наличие сильной мускулатуры для оптимизации процессов копания (Beolchini et al., 2000). Однако Рубенштейн с соавторами (Rubenstein et al., 2003) опроверг это предположение, так как у самок с нормальными яичниками также наблюдалось развитие мускулатуры. Джименецом с соавторами (Jimnez et al., 1993) была показана сезонная зависимость уровня тестостерона как у самцов, так и у самок, при этом самки показывали низкий уровень гормона в период размножения, в то время как у самцов наблюдалась противоположная ситуация. Вингфилдом (Wingfield, 2005) была предложена связь уровня тестостерона с агрессивностью и территориальностью. Вероятно, сезонные изменения уровня тестостерона обуславливают изменения поведения самок в период размножения (Carmona, 2006, цит. по Carmona et al., 2008). Для подтвержения этой гипотезы требуются данные по уровню гормона у североамериканских видов. Факт высокой территориальности кроты многократно подтвержден разными авторами (Огнев, 1928; Строганов, 1948), а границы территорий отдельных особей не перекрываются, области перекрытия наблюдается только между животными разного пола (Loy et al., 1992). Огнев (1928) писал: «этот хищный, неуживчивый зверек, по мнению большинства авторов, живет отшельником в своих охотничьих владениях, враждебно относясь к своему собрату или всякому живому существу, которое повстречается ему в подземной галерее. Если ему на пути попадается землеройка, мышь, жаба или даже уж, - крот беспощадно убивает и съедает свою жертву. Говорят, что два крота, особенно если они одного пола, вступают в смертельную борьбу: победитель убивает побежденного и съедает его». Однако прямой связи особенности строения женской половой системы кротовых с другими морфологическими и молекулярными признаками обнаружено не было (Carmon et al., 2008).
Развитие кротов, связанных с рытьем, происходило в направлении освоения определенного пищевого ресурса – дождевых червей. Создание систем ходов в толще почвы, иногда на большой глубине, а не просто перемещение в растительной подстилке обеспечило кротам ряд преимуществ. Увеличилась их защищенность от хищников и неблагоприятных абиотических условий, снизилась острота конкурентных отношений. Создаваемые ходы служат еще своеобразными ловушками для многих беспозвоночных, а для обездвиженных дождевых червей еще и местом длительного складирования (Гуреев, 1979). Общей экологической особенностью кротовых является их привязанность к древесно-кустарниковой растительности и близко к ним расположенным территориям (Гуреев, 1979). Одним из важных факторов, влияющих на распространение кротов, является тип почвы, ее физические и химические параметры. Кроты предпочитают плодородную почву: луга, пастбища и сельскохозяйственные угодья, а также сады, лиственные и смешанные леса. В хвойных лесах встречаются довольно редко. Избегают песчаных, каменистых почв, где рытье затруднено или невозможно. Помимо этого, для кротов важна степень влажности почвы. Они выбирают влажную, но не заболоченную среду. Встречаются в периодически затопляемых областях, но отсутствуют в районах с постоянным высоким уровнем грунтовых вод (для обзора см. Zurawska-Seta, 2010;
urawska-Seta, Barczak, 2012). Существенным фактором для кротов является наличие и доступность пищи. В основном кроты питаются дождевыми червями Lumbricidae и личинками насекомых. Также в их рацион могут входить куколоки и взрослые насекомые, пауки, многоножки, улитки, иногда более крупные животные, такие как лягушки, ящерицы, змеи, мыши и другие мелкие грызуны, и даже представители своего вида (для обзора см. Beolchini, Loy, 2004; urawska-Seta, 2010). Соотношение между дождевыми червями и другими беспозвоночными в рационе крота является довольно постоянным и зависит от времени года и окружающей среды. Важным фактором является и рН почвы. Дождевые черви многочислены в почвах с рН выше 4.0, и оптимальные условия для кротов - почвы с рН близким по значению к нейтральному, поэтому кроты избегают кислых почв. Также была установлена связь между распространением кротов и местами выпаса домашних животных (для обзора см. urawska-Seta, 2010 и urawska-Seta, Barczak, 2012).
Подытожив все выше сказанное, можно сказать, что своебразный образ жизни и занимаемая экологическая ниша не могли не сказаться на морфологии и разнообразии кротов.
Как было показано, современные представления о филогении и систематике трибы Talpini основаны на морфологии черепа, зубов, посткраниального скелета. Привлечение к систематике кротов данных секвенирования началось относительно недавно. Трудность определения, субъективность в оценке значимости различных морфологических диагностических признаков и неустойчивость основного диагностического признака – зубов -предопределили существенные расхождения во взглядах на объем, состав и взаимоотношения таксонов кротов не только видового, но родового ранга.
Зубная система (строение резцов и моляров) – основа современной диагностики видов кротов. Самые первые классификации основывались исключительно на одонтологических и краниологических признаках. Не только кроты Talpa, но и азиатские роды классифицируются преимущественно по зубной формуле. Первая таксономия кротов, основанная на этом признаке, была сделана Гиллом (Gill, 1875). Впоследствии этой идеи последовали Добсон (Dobson, 1883) и Аллен (Allen, 1938):
Филогенетический анализ индивидуальных генов яДНК
Анализировали последовательности митохондриального гена cytb (цитохром b) и COI (I субъединица цитохром оксидазы ) и фрагменты пяти экзонов : RAG1 - ген рекомбинационной активности (recombination activating gene 1), BRCA1 – ген рака молочной железы 1 (exon 11 of the breast cancer type 1 susceptibility protein), BRCA2 - ген рака молочной железы 2 (exon 11 of the breast cancer type 2 susceptibility protein), ApoB – ген аполипротеина Б (apolipoprotein B), A2ab – ген -2 Б адренергического рецептора (-2 b adrenergic receptor).
Полимеразную цепную реакцию амплификации (ПЦР) для шести генов проводили в объеме 20 мкл. Для реакции готовили смесь на нужное число проб, состоящую из двух праймеров, Taq-buff, 25 мM MgCl2, dNTP 2.5 мМ, Тaq-полимеразы и воды. Использовали Taq-полимеразу фирмы Sileks (5 ед./мкл) в концентрации 0.2 мкл на пробу.
Последовательности праймеров приведены в таблице 9. Полную последовательность митохондриального гена цитохрома b (1140 п.н.) амплифицировали с комбинациями праймеров L14734/H15906, L_talpa_glu/H_talpa_pro. Для чтения внутренних участков были использованы дополнительные праймеры L393 и H525. Участок последовательности ядерного гена RAG1 (1010 п.н.) амплифицировали с комбинациями праймеров F1851/R2951, для чтения внутренних участков были использованы праймеры F2401/R2486, F319/R745, R320/F730. Участок последовательности ядерного гена BRCA1 (1263 п.н.) амплифицировали с комбинациями праймеров F120/R1020/R1330, для чтения внутренних участков были использованы дополнительные праймеры F437/R700. Участки последовательностей ядерных генов BRCA2 (1113 п.н.), ApoB (975 п.н.) и A2ab (852 п.н.) амплифицировали c различными комбинациями ниже представленных праймеров.
ДНК, выделенная из шести музейных образцов T. caucasica ognev i, восьми образцов T. levantis minima, а также двух образцов M. robusta, была сильно деградирована, поэтому для таких экземпляров рода Talpa удалось получить только короткие фрагменты cytb, используя комбинацию внутренних праймеров L393/H525. Чтобы гарантировать достоверность полученного продукта, было разработано четыре дополнительных внутренних праймера для амплификации фрагментов длиной 260 – 400 п.н., с использованием комбинации праймеров: L148/H510, L148/H330a и L50/H330a. Для амплификации музейных образцов M. wogura были использованы комбинации праймеров: L48/ R270A, F97/R176 и F172/R270A.
Амплификацию осуществляли на приборах My Cycler (Bio-Rad, США) и Mastercycler Gradient (Eppendorf, Германия). Контроль амплификации проводили в 1 % агарозном геле. Очистку продуктов ПЦР для секвенирования проводили осаждением смесью ацетата аммония с 70% этанолом или готовым набором реагентов «Diatom DNA Elution» (OOO «Лаборатория Изоген»).
Основная часть экспериментальной работы выполнена в кабинете «Молекулярных методов в зоологии» кафедры зоологии позвоночных МГУ им. М.В. Ломоносова.
Автоматическое секвенирование проведено на секвенаторе ABI 3100-Avant с использованием ABI PRISMBigDyeTM Terminator v. 3.1 в лаборатории ЦКП ГЕНОМ.
Выравнивание последовательностей проводили вручную с помощью программ DNAStar Lasergene SeqMan Pro v. 7.1.0 (Burland, 1999) и BioEdit v. 7.0.9.0 (Hall, 1999).
Для разбиения на партиции конкатенированной последовательности яДНК была использована программа PartitionFinder v1.0.1 (Lanfear et al., 2012). Изначально было предложено пять теоретически возможных схем: (1) разбиение по генам, (2) разбиение по позициям кодона, (3) разбиение по генам и позициям кодона (три подгруппы для гена), (4) как в варианте 3, но 1-я и 2-я позиции кодонов объединены (две подгруппы для гена), (5) без разбиения. Оптимальным вариантом для родов Talpa и Euroscaptor и для определения положения родов в трибе Talpini оказался четвертый тип разбиения. Для рода Mogera оптимальным оказался второй тип разбиения. Для данных по cytb всегда использовали разбиение по трем позициям кодона.
Известно, что нуклеотидные основания в 1-м и особенно в 3-м положениях в наибольшей степени подвергаются множественным прямым и обратным заменам (Hassanin et al., 1998), что приводит к насыщению последовательности и искажению филогенетического сигнала (Банникова, 2004). Это особенно относится к быстро эволюционирующим последовательностям, в нашем исследовании таким геном является cytb. Поэтому в анализе филогенетического отношения родов в составе трибы Talpini для гена cytb для 1-го и 2-го положения были учтены все замены, но для 3-го положения - только трансверсии, а при анализе конкатенированной последовательности из 5ти ядерных генов и cytb для ядерных генов были учтены все замены во всех положениях кодонов, а для cytb - трансверсии 1-го и все замены 2-го положения кодонов.
Реконструкция филогенетических деревьев Реконструкция филогенетических деревьев была выполнена с помощью нескольких широко используемых алгоритмов: максимальная парсимония (maximum parsimony, MP), максимальное правдоподобие (maximum likelihood, ML) и байесовский анализ (MrBayes, BI). Филогенетический анализ методом максимальной экономии (MP) проведен в программе PAUP, version 4.0b10 (Swofford, 2003). Построение деревьев по методу максимального правдоподобия (ML) выполнено с помощью программы пакета Treefinder, version October 2008 (Jobb, 2008). Реконструкции ML-деревьев предварялись определением оптимальной модели эволюции последовательности с помощью программы PartitionFinder v.1.0.1 (Lanfear et al., 2012) на основе критерия BIC (Bayesian information criteria). Оптимальные модели для каждого рода и гена представлены в таблице 10.
Для проверки устойчивости клад использовалась процедура бутстрэп с 1000 псевдорепликами для MP, NJ и ML алгоритмов.
Байесов анализ (BI) проводили в программе MrBayes 3.1.2 (Ronquist, Huelsenbeck, 2003). Для данного анализа использовали MCMC алгоритм и следующие параметры: число независимых анализов 2, число генераций по 20 млн., в псевдовыборку отбиралась каждая 5000-я генерация, число марковских цепей 8. Сходимость оценивали с помощью статистики ESS (эффективный размер выборки) в Tracer 1.4 (Rambaut, Drummond, 2007).
Видовое дерево было построено в программе BEAST (Heled, Drummond, 2010). При этом использовали следующий набор априорных допущений и параметров: относительная скорость образования новых линий считалась постоянной (Yule prior); для разных позиций кодона применялись модели нуклеотидной эволюции в соответствии с таблицей 10. Разбиение на группы осуществлялось в соответствие с делением, полученным с помощью ABGD (Automatic Barcode Gap Discovery method) (Puillandre et al., 2012) (параметры см. ниже). Скорость молекулярной эволюции была проанализирована в программе PAML 4.7 (Yang, 2007). В соответствии с полученными данными, для рода Talpa для ядерных генов использовали строгие часы (strict clock models), а для cytb – модель нестрогих часов, при этом распределение скоростей по ветвям дерева соответствует лог-нормальному (uncorrelated lognormal relaxed clock model); для рода Euroscaptor - модель нестрогих часов использовалась для генов cytb и BRCA1, для остальных ядерных генов – строгие часы. Средняя скорость эволюции считалась равной единице; число независимых анализов равнялось четырем, длина цепи составляла 20 млн. генераций, в псевдовыборку отбиралась каждая 5000-я генерация. Сходимость оценивали с помощью статистики ESS (эффективный размер выборки) в Tracer 1.4. (Rambaut, Drummond, 2007).
Сравнение результатов филогенетического анализа митохондриального гена cytb, объединенной последовательности ядерных генов и видового дерева
Конечное выравнивание cytb для 26 образцов, включая 5 внешней группы, составило 1140 п.н. Применение PartitionFinder (Lanfear et al., 2012) к набору из пяти ядерных генов показало, что лучшая схема в соответствии с BIC критерием соответствует 10 партициям (партиции по генам и позициями кодонов при объединении 1-й и 2-й позиций). Лучшие модели для каждой из 10 партиций ядерных генов и трех позиций cytb приведены в таблице 10 (раздел «материал и методы»).
В комбинированном анализе митохондриального гена cytb и пяти ядерных генов конечное выравнивание состояло из 5812 нуклеотидных позиций, в т.ч. 760 п.н. cytb, 960 п.н. ApoB, 1245 п.н. BRCA1, 807 п.н. A2ab, 1032 п.н. BRCA2 и 1008 п.н. RAG1. Общий набор данных включил 15 последовательностей, в том числе 4 из внешней группы. Филогенетический анализ митохондриального гена cytb Принципиальная топология деревьев, полученных на основе филогенетических алгоритмов ML и BI, совпадает. На рис. 25 представлено ML-дерево со значимыми бутстрэп-поддержками в анализах BI/ML.
На представленном дереве в составе трибы Talpini обнаруживается четкая монофилия группировок, соответствующих родам Talpa и Mogera, в то время как род Euroscaptor оказывается парафилетичен в связи с положением Scaptochirus и Parascaptor внутри его радиации. Вся группа, включающая азиатские роды кротов (Mogera, Euroscaptor, Scaptochirus и Parascaptor), монофилетична. Рис. 25. Результаты ML анализа 1140 п.н. cytb. Числа вблизи узлов дерева – показатели бутстрэп-поддержек в анализах BI/ML соответственно. Звездочка обозначает абсолютную поддержку в обоих анализах. Комбинированный анализ ядерных генов и митохондриального гена cytb
На рис. 26 представлено ML дерево, построенное по результатам комбинированного анализа суммарной последовательности ядерных генов (ApoB+BRCA1+BRCA2+RAG1+A2ab) и митохондриального гена cyt b со значимыми бутстрэп-поддержками в анализах BI/ML. Результаты воспроизводят выявленную в митохондриальном анализе монофилию родов Talpa и Mogera, а также группы, состоящей из азиатских видов (Mogera+Euroscaptor+Parascaptor +Scaptochirus). Род Euroscaptor по-прежнему парафилетичен вследствие обособленного положения E. mizura вне кластера остальных видов рода.
ML дерево комбинированной последовательности генов ApoB+BRCA1+BRCA2+RAG1+A2ab+cytb. Числа вблизи узлов дерева – показатели бутстрэп-поддержек в анализах BI/ML соответственно. Звездочка обозначает абсолютную поддержку в обоих анализах. Рассмотрим взаимоотношения видов в каждом роде отдельно. Филогенетический анализ митохондриального гена cytb
В анализе митохондриального гена cytb (1140 п.н.) использована расширенная по сравнению с ядерными генами выборка рода Talpa - 114 образцов и 27 - для внешней группы.
На полученном ML-дереве (рис. 27) с высокими поддержками подтверждается монофилия практически всех видов рода Talpa, за исключением двух случаев: (1) T. europaea, который оказался парафилетичным относительно T. occidentalis, (2) T. levantis, талышская популяция которого, известная как подвид T. levantis talyschensis Vereschagin, 1945, оказалась далеко отстоящей от остальных представителей малого крота. В этой связи далее в работе будем обозначать эту группировку как Talpa sp.
T. europaea парафилетичен из-за обособленного положения семи образцов из четырех локалитетов Северной Испании – Харо, Фогас-де-Монклус, Монтсени, Сант-Пере-де-Виламахор. К2Р-дистанции между испанской группировкой и другими группами T. europaea составляют 8% (табл. 11). Высокие генетические дистанции, отделяющие ее от других группа и периферическое географическое положение указывают на то, что таксономический статус этой северо-испанской популяции требует дальнейшего пристального изучения. С большой вероятностью она не относится к виду T. europaea (Feuda et al., 2015).
Остальные образцы T. europaea составляют монофилетическую группу сестринскую с T. occidentalis. Другая поддерживаемая сестринская группа - T. caeca + T. romana. Клады T. europaea/T. occidentalis и T. caeca/T. romana в свою очередь являются сестринскими. Положение T. stankov ici и T. levantis не разрешено.
T. altaica занимает базальное положение, однако бутстрэп-поддержки невысокие (0.96/64/- в BI, ML и MP - анализах, соответственно), и AU-тест отвергает гипотезу о положении T. altaica внутри радиации рода (р=0.033).
Генетические дистанции (K2P) между видами варьируют в пределах от 9.1 до 15.6% (табл. 11): минимальная дистанция наблюдается между T. europaea и T. occidentalis (9.1±0,9) и между T. stankov ici и T. levantis (9.1±0,8), максимальная - между T. davidiana и T. altaica (17.0±1.4). ДНК T. davidiana проанализирована впервые. T. dav idiana образует монофилетическую группу с Talpa sp. из Талыша, генетическая дистанция между ними составляет 13.2 %.
Внутри большинства видов можно выделить глубокие внутривидовые группировки, соответствующие определенным географическим локалитетам. Генетические дистанции (табл. 12) между которыми варьируют от 2% между итальянской и европейской группировками T. europaea до 10% между группировками T. caucasica. Внутри T. caucasica – это образцы с Северного Кавказа и северо-восточной Турции. Внутри T. levantis – это группа, включающая образцы с Северного Кавказа, Закавказья, северо-восточной Турции и северной Турции. T. caeca разделяется на итальянскую и балканскую группировки, T. romana – на группировки из центральной и южной Италии, T. occidentalis – на группировку из Португалии и юго-восточной Испании. Внутри T. stankovici выделяются три группировки: Пелопоннес, Македония + западная и северо-западной Греция и группировка из центральной Греции. Внутри T. europaea (без учета испанской линии) можно выделить две внутривидовые группировки: итальянскую и центрально-западно-европейскую, хотя они имеют умеренные бутстрэп-поддержки. Внутри T. altaica с умеренными бутстрэп-поддержками выделяются группировки с побережья Енисея (пос. Мирное) и с побережья оз. Телецкое.
Помимо образцов из Турции и Кавказа, мы проанализировали кавказских кротов из Грузии - T. caucasica ognevi, которые не были включены в филогенетический анализ из-за короткой длины отсеквенированных нуклеотидных последовательностей. Для T. c. оgnevi была получена длина только в 380 п.н. Полученные фрагменты T. c. ognevi были очень схожи ( 1.5%) с соответствующими фрагментами для полной нуклеотидной последовательности образцов из Турции, включая все диагностические замены, которые отличают популяции кротов Северного Кавказа от кротов Турции (рис. 28 А).
Генетические дистанции между T. levantis minima из поселка Никитино и образцами из Кабардино-Балкарии, Армении или северо-восточной Турции (Ардахан) составляют 2.5%. Кроме того, мы проанализировали музейные образцы T. levantis minima из Адыгеи, которые также не были включены в филогенетический анализ из-за короткой длины отсеквенированных нуклеотидных последовательностей – 253 п.н. Генетическая дистанция между последовательностями образцов из Адыгеи и соответствующими участками сиквенсов малого крота из Кабардино-Балкарии, Армении или северо-восточной Турции (Ардахан) (рис. 28 В) составляет 3%.