Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1. Волос как объект анализа 9
1.1. Отбор пробы 17
1.2. Очистка и измельчение 19
1.3. Извлечение органических ксенобиотиков из волос 26
2. Методы определения ксенобиотиков в волосах человека 31
3. Классы определяемых соединений 36
3.1. Наркотические вещества 36
3.2. Лекарственные препараты 38
3.3. Полиароматические углеводороды 40
Экспериментальная часть и обсуждение результатов 51
1. Исходные вещества, аппаратура и техника эксперимента 51
1.1. Выбор модельных соединений 51
1.2. Реактивы и материалы 57
1.3. Выбор оптимальных параметров сканирования тонкослойных пластин на денситометре «Camag» 62
1.4. Выбор метода предварительного концентрирования 70
2. Определение ПАУв волосах человека 74
2.1. Оптимизация условий хроматографического определения ПАУ в тонком слое 74
2.2. Изучение сорбции ПАУ из сигаретного дыма на волосы человека 79
2.3. Выбор условий извлечения ПАУ из матрицы волос 85
2.4. Практическое приложение: изучение защитного влияния полиэтиленгликолевых эфиров хитозана на волосы человека 89
3. Определение лекарственных препаратов в волосах человека 92
3.1. Определение параметров экстракции лекарственных препаратов в системе вода - гексан 92
3.2. Оптимизация условий хроматографического определения лекарственных препаратов в тонком слое 104
3.3. Изучение сорбции лекарственных препаратов из водных растворов на волосы человека 113
3.4. Выбор условий извлечения лекарственных препаратов из матрицы волос 122
4. Определение изученных ксенобиотиков в реальных образцах волос 130
Приложение 137
Выводы 139
Литература 141
- Очистка и измельчение
- Наркотические вещества
- Выбор оптимальных параметров сканирования тонкослойных пластин на денситометре «Camag»
- Определение параметров экстракции лекарственных препаратов в системе вода - гексан
Введение к работе
Актуальность работы. В последнее десятилетие резко возрос
интерес к анализу следовых количеств органических веществ. Вместе с тем
начал расширяться и круг объектов этого анализа - в частности, медико-
биологических, к которым относятся биологические жидкости и ткани. С
появлением высокочувствительных инструментальных методов
биомониторинг инородных органических веществ сразу же приобрел практическое значение в таких сферах жизнедеятельности людей, как медицина, токсикология, судебно-медицинская экспертиза, криминалистика и экология. Возник интерес и в социальной сфере, благодаря возможности контролировать употребление наркотических, психотропных и допинговых препаратов сотрудниками опасных областей производства или спортсменами. Остался, однако, ряд нерешенных проблем.
Классическими объектами арбитражного анализа считаются кровь и моча. Извлечение соединений из них, как правило, проводится с помощью различных методов экстракции. Однако указанные объекты имеют большой недостаток: инородные соединения метаболизируют в крови и быстро выводятся из организма человека с мочой. Первая проблема биомониторинга состоит в том, что анализ биожидкостей характеризует только текущий процесс выведения вещества. Поэтому в настоящее время многие зарубежные исследователи обратились к использованию нетрадиционных объектов анализа - таких, как волосы человека. Волосы являются естественным сорбентом, постепенно накапливающим в своей структуре те соединения, которые либо не попадают, либо малоустойчивы в крови и моче, что дает возможность получения информации об их воздействии на организм в течение длительного времени. Тем не менее, вторая проблема современного биомониторинга заключается в том, что сложность химического состава и низкое содержание ксенобиотиков в матрице ограничивают широкое использование волос как объекта анализа.
Основными методами определения ксенобиотиков в волосах человека являются иммуноферментный анализ, высокоэффективная жидкостная хроматография и газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием. Несмотря на очевидные достоинства перечисленных методов, их затруднительно применять для целей мониторинга из-за длительности анализа и высокой стоимости оборудования. Напротив, высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) удовлетворяет требованиям скрининга, но мало популярна для решения сложных аналитических задач из-за низкой чувствительности метода. Сочетание ВЭТСХ с предварительным концентрированием аналитов дает возможность избежать этого недостатка.
Третья проблема заключается в стандартизации процедуры анализа. Говоря о степени извлечения ксенобиотиков из структуры волос, исследователи оперируют такими понятиями, как «больше» или «меньше», и порой опрометчиво судят о полноте десорбции вещества из протеиновой матрицы.
Четвертая проблема связана с ограниченностью круга ксенобиотиков, которые удалось определить в волосах человека. Наиболее изученным является определение в волосах наркотических препаратов - опиатов, каннабиноидов и кокаина. Часть исследований посвящена вопросам, связанным с обнаружением лекарственных препаратов, но при этом нет данных о том, включаются ли в структуру волос неполярные канцерогенные соединения, например, полиароматические углеводороды (ПАУ). Вполне очевидно, что на данный момент возможности определения ПАУ в организме человека остаются практически неиспользованными, несмотря на увеличение числа курящих людей, неблагоприятную экологическую обстановку и прочие негативные факторы.
Цель работы заключалась в оценке возможностей и разработке скрининговой процедуры на основе сочетания высокоэффективной тонкослойной хроматографии с микрожидкостной экстракцией (МЖЭ) для
определения психотропных препаратов и полиароматических углеводородов в волосах человека. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
Изучить экстракционное поведение ряда психотропных лекарственных препаратов и некоторых представителей класса ПАУ, используемых в работе в качестве модельных соединений, и оценить возможность реализации микрожидкостной экстракции на стадии предварительного концентрирования определяемых компонентов.
Оптимизировать условия, оценить метрологические характеристики и получить количественные характеристики группового и внутригруппового определения модельных соединений методом ВЭТСХ.
Изучить закономерности сорбции модельных соединений на волосах человека из газовой фазы и из раствора с целью создания образцов сравнения для определения органических ксенобиотиков.
Изучить эффективность различных способов извлечения органических веществ из модельных образцов волос и выбрать оптимальный «матричный растворитель»1.
Разработать методики скрининга лекарственных препаратов и ПАУ в волосах человека на основе сочетания микрожидкостной экстракции и высокоэффективной тонкослойной хроматографии.
Научная новизна. Изучено экстракционное концентрирование ряда
лекарственных препаратов (фенотиазиновых производных,
антидепрессантов и дифенгидрамина) в наиболее перспективной для МЖЭ системе гексан - вода. Показана принципиальная возможность реализации микрожидкостной экстракции на стадии предварительного концентрирования определяемых компонентов. Изучено хроматографическое поведение модельных ксенобиотиков в ВЭТСХ системах с различными подвижными и неподвижными фазами. Изучена сорбция соединений класса ПАУ из сигаретного дыма и модельных лекарственных препаратов из водных
1 раствор вещества или смеси веществ, разлагающий волосы
растворов на волосы человека. На основе полученных закономерностей разработан подход, позволяющий провести оценку соотношения внутреннего (эндогенного) и внешнего (экзогенного) загрязнений волос человека. Изучена эффективность различных способов извлечения органических веществ из белковой структуры волоса и предложены принципиально новые способы извлечения полярных и неполярных органических ксенобиотиков из волос человека.
Практическая значимость работы. Доказано, что полиароматические углеводороды аккумулируются в волосах курильщиков. Предложены способы приготовления стандартных образцов волос с известным эндогенным содержанием органических ксенобиотиков на основе двух подходов: сорбции из газовой фазы и из водного раствора. Для группового определения соединений класса ПАУ предложена новая хроматографическая система с подвижной фазой состава гексан-дихлометан-нитробензол (5:5:0.1). Разработаны методики скрининга лекарственных препаратов и ПАУ в волосах человека на основе сочетания микрожидкостной экстракции и высокоэффективной тонкослойной хроматографии. Проведено определение некоторых лекарственных препаратов в волосах пациентов психиатрических клиник, а также групповое определение ПАУ в волосах курильщиков.
Автор выносит на защиту:
Результаты изучения экстракционного поведения модельных лекарственных препаратов в системе гексан - вода.
Результаты исследования поведения модельных лекарственных препаратов в тринадцати хроматографических системах с различными подвижными и неподвижными фазами.
Способ модификации подвижной фазы при групповом ВЭТСХ определении соединений класса ПАУ.
Результаты изучения сорбции соединений класса ПАУ из сигаретного дыма и модельных лекарственных препаратов из водных растворов на волосах человека.
Разработанный подход для оценки соотношения внутреннего (эндогенного) и внешнего (экзогенного) загрязнений и способы приготовления образцов сравнения для определения органических ксенобиотиков в волосах человека.
Данные по изучению эффективности различных способов извлечения органических веществ из белковой структуры человеческого волоса и предложенные в работе новые способы извлечения полярных и неполярных органических ксенобиотиков.
Методики скрининга лекарственных препаратов и ПАУ в волосах человека на основе сочетания микрожидкостной экстракции и высокоэффективной тонкослойной хроматографии.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на международных симпозиумах «Balaton Symposium'99 on high-performance separation methods» (Венгрия, 1999 г.), «Planar Chromatography-2001» (Венгрия, 2001 г.), «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Россия, Туапсе, 2002 г.) и VIII Международной научно-практической конференции «Косметические средства и сырье: безопасность и эффективность» (Россия, Москва, 2003 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ: 3 статьи и 6 тезисов докладов.
Очистка и измельчение
При очистке с волос удаляются жировые и потовые выделения, и загрязнения, попавшие из окружающей среды. К загрязнениям относят также определяемые в ходе анализа соединения, попавшие на волосы через дым (например, при курении), пыль или руки. В отличие от искомых (эндогенных) соединений их называют «слабо связанными» (экзогенными). В большинстве работ отмечается необходимость отделения в ходе очистки экзогенных соединений (якобы во избежание ложноположительных результатов).
В качестве промывных жидкостей используется вода (дистиллированная или деионизированная), водные растворы поверхностно-активных веществ (например, додецилсульфата натрия - SDS), шампуня или мыла, фосфатный буфер, разбавленный раствор соляной кислоты, метанол, этанол, изопропанол, ацетон, хлористый метилен, этиловый и петролейный эфиры.
Для удаления с волос только жировых выделений, как правило, используют спирт или ацетон [3]. Часто встречается промывание двумя жидкостями поочередно. Наиболее распространенным в этом случае является сочетание детергента и воды или ацетона и воды. Для увеличения интенсивности промывания используются теплые растворы промывных жидкостей (в том числе и органических растворителей), многократное промывание и ультразвуковые бани (УЗ). Ясно, что на эффективность промывания будет влиять и степень измельченности объекта. Однако, чем более измельчена проба, тем более вероятным становится извлечение вместе с экзогенными веществами части эндогенных, что весьма нежелательно для дальнейшего анализа. Кроме того, нужно учитывать, что при определении лекарственных препаратов условия промывки должны быть особенно мягкими: в этом случае маловероятен экзогенный способ включения веществ в волосы.
Основными путями проникновения лекарственных соединений в волосяную матрицу являются эндогенный (из крови), и псевдоэкзогенный (из потовых желез кожи) способы. Многие авторы склонны считать необходимым удаление псевдоэкзогенных соединений [2]. Но соединения такого рода не могут привести к ложноположительным результатам анализа, а их удаление повышает требования к чувствительности метода.
Контроль содержания определяемого компонента в промывных жидкостях дает различные результаты. Например, содержание морфина в промывных растворах при использовании этилового эфира и 0.01 М соляной кислоты лежит в широком диапазоне от 0 - 66 % [32] до 0 - 87 % [33] (здесь и далее дается процент от общего количества препарата, найденного в промывных растворах и волосах). Потеря кокаина и его производных при последовательном промывании волос SDS, водой и метанолом составляет от 6 до 52 % [42 - 45]. При промывании волос теплым раствором метанола содержание кокаина в растворе колеблется от 38 до 92 %, а бензоилэкгонина - от 31 до 91 % [24]. Даже при быстром промывании волос морфинистов метанолом при комнатной температуре, найденное в растворе содержание героина достигает 48 %, а 6-моноацетилморфина - 34 % [35]. Фенциклидин, который в значительной степени попадает на волосы через дым сигарет, удаляют раствором детергента на 28 - 48 % [7]. В некоторых работах авторы отмечают, что очистка не приводит к появлению определяемых соединений в промывных растворах или их концентрация находится ниже предела обнаружения метода. В работах [30, 32] морфин, героин и кокаин не были обнаружены в промывных жидкостях при использовании воды и детергентов при комнатной температуре. Такой же случай был отмечен и при использовании воды и метанола при определении психотропных препаратов [51]. Эти факты, по-видимому, связаны с довольно мягкими условиями промывания — оно проводилось быстро и при комнатной температуре.
Обоснование выбора промывной жидкости в рассмотренных работах чаще всего отсутствует или же носит чисто эмпирический характер, основанный на сравнении содержания анализируемых веществ в невымытых и вымытых различными способами волосах. Сведения о растворимости искомых соединений при выборе промывной жидкости не приводятся. Некоторые авторы в ряде работ высказывают предположение о возможности удаления на стадии очистки искомых соединений из матрицы волос, но, тем не менее, попытки связать тип промывной жидкости с природой определяемых веществ в работах не встречаются. Впрочем, большинство исследователей полагают, что эндогенные включения более прочно связаны с протеиновой матрицей волоса, чем экзогенные, поэтому последние могут быть легко удалены промыванием.
Проведенные исследования оценки эффективности промывания волос, искусственно загрязненных наркотическими препаратами, опровергли это предположение и доказали невозможность такого способа разделения соединений, попавших на волосы различным путем [24,36, 54].
Например, для имитации попадания кокаина на волосы из окружающей среды, Е. Cone вымачивал образцы волос в течение двух суток в водном растворе гидрохлорида кокаина (1 мг/мл). При очистке полученного образца использовали два эффективных способа, но его высокая загрязненность не позволила оценить степень очистки и провести последующий анализ волос. Уменьшение концентрации используемых растворов и сокращение времени вымачивания привело к получению менее загрязненных волос. Из образцов, полученных вымачиванием волос в растворе гидрохлорида кокаина с концентрацией 0.01 мг/мл, получилось удалить быстрым промыванием метанолом от 16 до 41 % препарата [24]. Подобные результаты получены при вымачивании волос в водных растворах героина, 6-ацетилморфина и метадона с концентрацией 0.05 - 0.1 мг/мл: тщательная очистка волос удалила около 90 % каждого вещества, быстрое промывание — примерно 56 — 77 % каждого опиата [36, 54].
Следует отметить, что указанный способ искусственного нанесения препаратов демонстрирует высокую сорбционную силу волоса и возможность проникновения внешних загрязнений внутрь матрицы через поверхность волос. При этом особую роль в процессе внедрения органических молекул в матрицу волоса, видимо, играют молекулы воды. Образуя водородные связи с пептидными группировками матрицы, они вызывают набухание волоса и, таким образом, облегчают внедрение других инородных молекул [3,24].
Наркотические вещества
Спектр органических веществ, для которых разработаны и продолжают разрабатываться методы анализа в волосах, достаточно специфичен. Прежде всего, в него включены наркотические препараты (легальные, т.е. медицинские, и нелегальные), психотропные препараты (снотворные, антидепрессанты, нейролептики, транквилизаторы, седативные средства), допинговые препараты и яды.
Из ряда наркотических препаратов наиболее изученными являются морфин и его производные - опиаты (табл. 1). Еще в 1979 г A. Baumgartner предложила метод РИА для определения морфина в волосах наркоманов [12]. Долгое время после этого в волосах определяли только морфин и кодеин, но было установлено, что семена мака, используемого в кондитерских изделиях, содержат достаточное количество этих веществ, чтобы дать положительный результат в ходе ГХ/МС анализа. Однако, кондитерский мак не содержит синтетических (героин) и полусинтетических (гидрокодон, гидроморфин) опиатов — основных составляющих нелегальных наркотиков [91]. Их главным метаболитом в организме человека является 6-ацетилморфин, что в 1991 г доказали В. Goldberger [37] и I. Raff [89]. До них в 1987 г F. Tagliaro [34] определил 6-моноацетилморфин и героин в волосах методом коллизионной спектроскопии. Сегодня именно 6-моноацетилморфин используется в анализе для доказательства употребления героина. Проблема выбора условий экстракции опиатов из волос до сих пор остается открытой и рассматривается во многих публикациях [22,39, 94].
Определение кокаина в волосах впервые провел D. Valente [30]. В 1987 г. S. Balabanova и J. Homoki [61] обнаружили кокаин в волосах методом ГХ/МС. В 1991 г кокаин и его метаболиты - бензоилэкгонин, метилэкгонин, норкокаин - количественно определил Е. Cone [24]. P. Kintz [91] представил метод, позволяющий отличить курителей крэка от других потребителей кокаина. В работе [25] было отмечено, что при анализе кокаина и его производных особое внимание нужно уделять очистке волос от внешних загрязнений, так как кокаиновые пары («дым крэка») сильно сорбируются поверхностью волоса. При этом легкое промывание волос метанолом удаляет около 70 % поверхностного кокаина. G. Henderson [52] в 1996 г показал, что кокаин, найденный в волосах, не связан напрямую с количеством поступившего в организм наркотика и продолжительностью его употребления.
Основным метаболитом каннабиноидов в организме человека (и, следовательно, и основным детектируемым веществом) является карбокси-ТГК. Ее уровень в волосах человека колеблется в диапазоне от 0.1 мкг/г волос и ниже до 10 мкг/г [26, 28]. В работе [93] V. Cirimele представил ГХ/МС метод прямого (без дериватизации) определения одновременно тетрагидроканнабинола, каннабидиола и каннабинола (трех наркотических составляющих травы Cannabis sativa) в волосах хронических потребителей конопли. По признанию автора, предложенный метод требует времени и дорогостоящей аппаратуры.
Наиболее тщательно идентификацию амфетамина и метамфетамина изучали и продолжают изучать японские ученые. Первые публикации на эту тему появились в 1983 г [103]. В 1984 г О. Suzuki [46] опубликовал метод определения амфетамина в одном волосе. Было проведено даже разделение оптических изомеров метамфетамина и амфетамина [47]. В волосах были найдены только d-изомеры.
В последние годы возник интерес к определению в волосах человека психотропных и лекарственных препаратов. Большая часть работ затрагивает проблемы обнаружения бензодиазепинов. Это один из наиболее многочисленных классов лекарственных препаратов. Поскольку практически все соединения этого класса легко перерабатываются организмом человека, часть из них включается в волосы в очень малых количествах, что существенно увеличивает требования к чувствительности метода анализа. Кроме того, бензодиазепины разлагаются при разрушении волос щелочью, из-за чего долгое время их анализ представлялся затруднительным. В связи с этим, для извлечения бенздиазепинов были предложены: 1) смесь 0-глюкуронидазы - арилсульфотазы, 2) мягкое кислотное разложение и 3) обработка волос метанолом в УЗ-ванне. В последнем случае полученная вытяжка содержала много посторонних примесей, что заметно уменьшило соотношение сигнал/шум хроматографического определения. Для снижения интерференции был предложен метод ГХ/МС/МС [95]. Впервые анализом волос на содержание в них бензодиазепинов занялись в начале 90-х годов — М. Scheller [96] обнаружил бромазепам в волосах пациента, принимавшего ежедневно 20 таблеток Lexotanil в течение долгого периода. Диазепам и его метаболиты также были идентифицированы в волосах различными авторами [63, 97 - 99]. Основным методом определения соединений класса бензодиазепинов остается ГХ/МС, который осуществляют, как правило, после дериватизации с триметилсилилтрифторацетамидом [98 - 100] или гептафторбутиловым ангидридом [95, 101]. Пределы обнаружения составляют 1 нг/г - 1 мкг/г волос.
Выбор оптимальных параметров сканирования тонкослойных пластин на денситометре «Camag»
Главное отличие тонкослойной хроматографии от других, более точных методов, заключается в том, что весь анализ может быть проведен без использования дорогостоящих приборов (с помощью визуального детектирования). Такой вариант применяется при работе с большими количествами веществ, которые поглощают в УФ или видимой области, и является полуколичественным. В случае, когда требуется определять сверхнизкие — до 10 9 г/мкл — концентрации веществ, детектирование в ТСХ осуществляется с помощью сканеров. Эти оптические приборы позволяют с высокой точностью определить количество вещества в хроматографической зоне. Сейчас существует немало различных типов сканирующих денситометров, некоторые из них управляются вручную, другие - с помощью программного обеспечения. Несомненно, все параметры сканирования (скорость сканирования, ширина щели монохроматора, размеры сканирующей щели) влияют на получаемые результаты. Из-за неверно выставленных первоначальных параметров может возрасти погрешность анализа и ухудшится чувствительность. Поэтому важной задачей является оценка оптимальных значений перечисленных параметров. Определение оптимальных параметров проводили на примере сканирования хроматографических зон ANF. Концентрацию ANF в зоне рассчитывали из уравнения S = 3.195с - 0.032, с коэффициентом сходимости равным г = 0.9998 (где S - площадь пика в у.е., с — количество вещества в хроматографической зоне, мкг).
На стартовую линию тонкослойной хроматографической пластинки нанесли аликвоту раствора ANF определенной концентрации. Затем, после хроматографирования в выбранной подвижной фазе, провели денситометрическое сканирование, изменяя значения параметров сканирования. Полученные данные свидетельствуют о наличии зависимости между значением площади пика (следовательно, и определяемого количества вещества) и скорости сканирования. Данная зависимость представлена на рис. 5. Из рисунка видно, что кривая имеет два максимума при минимальном и максимальном значениях скорости сканирования. Наиболее оптимальным из них является значение 100 мм/с. Однако в случае, если необходимо не только провести количественное определение, но и добиться максимального разрешения близко лежащих пиков, значение 0.5 мм/с оказывается более предпочтительным (это доказали дальнейшие исследования).
Строго говоря, существует основное правило выбора размеров сканирующей щели при точечном нанесении раствора на хроматографическую пластину. Ее длина должна быть чуть больше диаметра пятна с тем, чтобы закрывать его целиком. Таким образом, длина сканирующей щели зависит от объема пробы, степени размывания хроматографической зоны и аккуратности нанесения. Однако, это правило не помогает выбрать подходящую ширину щели. Сканирующая щель изменяется следующим образом. Существует 11 предлагаемых длин щелей: значения 12, 10 и 8 мм относятся к макро-группе, значения 6 - 1, 0.5 и 0.25 мм — к микро-группе. Для каждой длины щели имеется несколько (от одного до семи) вариантов ширины. Как видно из табл. 8, внутри каждой группы размеров происходят изменения определяемой площади пика в зависимости от ширины щели. Так, например, в группах № 1 - 3 максимальная площадь пика достигается при значениях ширины щели 0.6 и 0.2 мм. В самой большой группе - № 4 - наблюдается резкий максимум определяемой площади при щели с параметрами 6.0x0.45 мм. Щель с такими параметрами выставляется программой по умолчанию. В группах № 5 - 7 различия не столь заметны, однако увеличение определяемой площади пика наблюдается при значениях ширины щели 0.45 и 0.3 мм. В предпоследних трех группах закономерность меняется: чем уже щель, тем больше площадь пика. В группу № 11 входит только один вариант параметров сканирующей щели, равный 0.25x0.1 мм. Он и является наиболее оптимальным для определения количества вещества в хроматографической зоне. Однако, следует отметить, что при значениях в диапазоне 2.0x0.1 - 0.25x0.1 мм колебания базовой линии на денситограмме резко увеличиваются. Соответственно, перестает выполняться правило, согласно которому отношение сигнал — шум должно равняться трем. Поэтому в качестве оптимальной была принята щель с размерами 3.0x0.1 мм.
Определение оптимальных параметров сканирования для максимального разршения хроматографических пиков. Аналогичным образом, изменяя параметры сканирования, было исследовано их влияние на разрешение близколежащих хроматографических пиков. Для этого сканировали бумажный лист с нанесенными на него черными линиями различной толщины, расположенными на определенном расстоянии друг от друга: четыре линии толщиной 0.2 мм расстоянии 1 мм друг от друга, две линии толщиной 0.5 мм на расстоянии 2 мм и две линии толщиной 1 мм на расстоянии 5 мм. Внешний вид листа представлен на рис. 6. Денситометрическое сканирование проводили при различных значениях параметров прибора с использованием в качестве источника излучения ртутную лампу (А, = 400 нм). На основании проведенных экспериментов был сделан вывод, что разрешение близколежащих пиков напрямую зависит только от скорости сканирования: чем выше скорость сканирования, тем хуже разрешение. Результаты представлены на рис. 7, 8.
Определение параметров экстракции лекарственных препаратов в системе вода - гексан
Основной практической характеристикой, отражающей возможность перехода от макро- к микрожидкостному варианту экстракции, является коэффициент распределения D компонента А между органической и водной фазами: водн Значения коэффициента распределения для конкретной экстракционной системы позволяют прогнозировать условия получения желаемой степени концентрирования, которая, в свою очередь, однозначно связана с величиной степени извлечения R. Степень извлечения представляет собой долю вещества, экстрагируемого из водной фазы (Уводн) в органический растворитель (Vopr), и обычно выражается в процентах: RA = 100DA/(DA + (VB(W/Vopr)) Данные по численным значениям константы KD,A или коэффициента распределения DA для выбранных нами соединений в литературе не приводятся. Необходимо отметить, что в работах, посвященных определению медицинских препаратов в биологических матрицах, стадия экстракционного концентрирования практически не изучается. Большинство исследователей ограничиваются лишь тем, что характеризуют процесс экстракции как «количественное» или «практически полное» извлечение при выбранных условиях.
В связи с этим, представляло интерес исследовать экстракционное поведение выбранных модельных соединений. В химическом отношении все они представляют собой третичные амины (табл. 4). Они являются сильными основаниями и, следовательно, процесс их экстракции в значительной мере будет зависеть от величины рН водной фазы. Учитывая протолитические равновесия в водной фазе, для функциональных зависимостей DA и RA от рН водной фазы можно записать следующие выражения: DA = KD,A/(1+[H30]+/Ka) RA = 100/(1 + (1 + [Н30+] /Ka)(VBOW/VoprKD A)), где Ка - константа кислотности соответствующей сопряженной кислоты. На основе этих выражений по экспериментально полученным зависимостям DA=XpH) и R=y(pH) возможно определение KD,A и прогнозирование экстракционного поведения системы в различных ситуациях. В литературе удалось обнаружить константы кислотности для сопряженных кислот некоторых модельных соединений. Так, для амитриптилина рКа = 9.4, для дезипрамина рКа = 9.5, для левомепромазина и аминазина рКа составляет 9.3 [31]. Эти данные свидетельствуют о том, что выбранные препараты являются сильными основаниями. Общая картина осложняется низкой растворимостью в воде соответствующих аминов, образующихся при рН 7: КзШҐ + OK г R3N І + н2о Конечной целью при отработке стадии предварительного концентрирования являлся выбор оптимального диапазона рН, при котором наблюдается максимальная степень экстракции. Принимая во внимание значения рН точек эквивалентности на кривых титрования препаратов, можно было предположить, что в сильнощелочной области (рН 10) все они будут находиться в форме оснований и, следовательно, коэффициент распределения DA будет максимально высоким.
С целью проверки этого предположения была исследована зависимость характеристик экстракционного процесса от рН водной фазы. Концентрацию препаратов в водной фазе определяли спектрофотометрически. Первоначально были сняты спектры поглощения водных растворов гидрохлоридов амитриптилина, анафранила, левомепромазина, аминазина и димедрола (в области рН 2-3) для выбора оптимальной длины волны. Полученные спектры представлены на рис. 12 (а — д). Из рис. 12а видно, что спектр гидрохлорида амитриптилина имеет два максимума при 215 и 245 нм. Несмотря на то, что коэффициент молярного поглощения є при X = 215 нм несколько больше, чем при X = 245 нм, для дальнейших исследований была выбрана длина волны 245 нм, поскольку в дальней УФ-области возможно нежелательное поглощение растворенным кислородом. Спектр левомепромазина имеет один максимум при 255 нм (рис. 126), при этой длине волны проводили дальнейшие исследования экстракции левомепромазина. Спектр дифенгидрамина имеет два максимума при 215 и 250 нм (рис. 12в). Коэффициент молярного поглощения при X = 215 нм на полтора порядка больше є при X = 250 нм. Поэтому для дальнейшей работы была выбрана длина волны 215 нм, несмотря на возможные мешающие влияния. Хорошая растворимость дифенгидрамина в щелочной среде позволила нам снять спектр щелочного раствора дифенгидрамина (рН 10). Он существенно не отличается от спектра кислого раствора дифенгидрамина. Это, вероятно, вызвано удаленностью аминогруппы от бензольных колец, которые обусловливают наличие максимумов в УФ-области. Поэтому протолитическое равновесие не оказывает влияние на вид спектра дифенгидрамина. Спектр анафранила имеет два максимума практически одинаковой интенсивности и близкими значениями коэффициентов молярного поглощения при X = 215 и 251 нм. Таким образом, для дальнейшей работы нами была выбрана длины волны X = 251 нм. Основной максимум спектра аминазина (рис. 12д) расположен при X = 253 нм.
