Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 15
1.1 Номенклатура стероидов 15
1.2 Биосинтез и метаболизм стероидов 16
1.3 Определение стероидов в моче 19
1.3.1 Гидролиз коньюгатов стероидов 19
1.3.2 Методы определения эндогенных стероидов 20
1.3.3 Проблема количественного анализа эндогенных стероидов 22
1.4 Стероидный профиль 23
1.4.1 Исследование стероидного профиля 23
1.4.2 Стероидный профиль и основные метаболиты 26
1.4.3 Стероидный профиль и минорные метаболиты 27
1.4.4 Стероидный профиль и генетика 29
1.4.5 Стероидный профиль и разбавление мочи... 30
1.4.6 Популяционные нормы концентраций и соотношений эндогенных стероидов в моче 31
1.4.7 Переход от популяционных границ к индивидуальным 34
2 Оборудование, исходные вещества и методика эксперимента 39
2.1 Оборудование 39
2.2 Исходные вещества и материалы 39
2.3 Приготовление растворов и буферов 47
2.3.1 Приготовление раствора внутреннего стандарта метилтестостерона 47
2.3.1.1 Приготовление рабочего раствора метилтестостерона 47
2.3.2 Приготовление буферной смеси 48
2.3.3 Приготовление фосфатного буфера 48
2.3.4 Приготовление карбонатного буфера 48
2.3.5 Приготовление концентрированного раствора для дериватизации 49
2.3.6 Приготовление модельных растворов для оптимизации условий хроматографического разделения 49
2.3.7 Приготовление градуировочных растворов 49
2.3.7.1 Приготовление растворов 1 группы 50
2.3.7.2 Приготовление растворов 2 группы 51
2.3.7.3 Приготовление растворов 3 группы 52
2.3.7.4 Приготовление растворов 4 группы 52
2.3.7.5 Приготовление растворов 5 группы 53
2.3.8 Подготовка матриц для проведения градуировки 53
2.3.8.1 Подготовка матрицы мочи без стероидов, содержащихся в свободной фракции - «свободная моча» 53
2.3.8.2 Подготовка матрицы мочи, прошедшей через патрон для твердофазной экстракции - «ТФЭ моча» 54
2.4 Подготовка пробы мочи для анализа и проведения градуировки 54
2.4.1 Подготовка пробы мочи 54
2.4.2 Подготовка пробы для проведения градуировки 55
2.4.3 Препараты эндогенных стероидов, использованные в работе 55
2.5 Прием препаратов эндогенных стероидов 55
2.6 Статистические программы и математические модули, используемые в работе 56
3 Результаты и обсуждение 57
3.1 Разработка способа определения эндогенных стероидов в моче 57
3.1.1 Выбор температурной программы и хроматографической колонки 57
3.1.2 Определение времен удерживания и характеристичных ионов 57
3.1.3 Масс-спектры исследуемых соединений 60
3.1.4 Построение градуировочных зависимостей для количественного определения эндогенных стероидов 75
3.1.4.1 Выбор матрицы для построения градуировочных кривых 75
3.1.4.2 Сравнение коэффициентов чувствительности 76
3.1.4.3 Сравнение отношений эндогенных стероидов 81
3.1.5 Эффективность гидролиза и степень извлечения 85
3.1.6 Метрологическая аттестация разработанного способа анализа 86
3.1.7 Заключения об итогах исследований от лабораторий, аккредитованных ВАДА. Межлабораторная сходимость результатов 93
3.2 Статистический анализ полученных данных 99
3.2.1 Статистический анализ концентраций эндогенных стероидов 99
3.2.2 Статистический анализ данных соотношений эндогенных стероидов 105
3.2.3 Использование установленных популяционных пределов для определения приема запрещенных препаратов 107
3.2.3.1 Анализ проб после приема тестостерона 109
3.2.3.2 Анализ проб после приема дегидроэпиандростерона 113
3.3 Переход от популяционных границ к индивидуальным 115
3.3.1 Использование разработанной программы для определения приема запрещенных препаратов 116
3.3.1.1 Анализ проб после приема тестостерона 119
3.3.1.2 Анализ проб после приема дегидроэпиандростерона 126
3.4 Поиск новых значимых соотношений эндогенных стероидов 130
3.4.1 Анализ проб после приема тестостерона 132
3.4.2 Анализ проб после приема дегидроэпиандростерона 139
3.4.3 Установление популяционных границ для новых соотношений... 143
Заключение 145
Выводы 147
Список литературы
- Определение стероидов в моче
- Стероидный профиль и генетика
- Приготовление фосфатного буфера
- Заключения об итогах исследований от лабораторий, аккредитованных ВАДА. Межлабораторная сходимость результатов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Употребление анаболических стероидов распространено в спорте, и по этой причине они внесены в Запрещенный список Всемирного антидопингового агентства (ВАДА). Тестостерон относится к наиболее часто выявляемым эндогенным анаболическим стероидам, но при установлении случаев его употребления возникает ряд проблем. Тестостерон вырабатывается в организме человека в больших количествах, а любые принятые эндогенные стероиды активно метаболизируют с образованием многочисленных продуктов. С точки зрения антидопингового контроля такие препараты являются сложно определяемыми, и большинство современных методов не способно достоверно выявить факт их употребления уже через 36 часов после приема. Исключение составляет метод газовой хрома-тографии-сжигания-изотопной масс-спектрометрии (ГХ/С/ИМС), но этот анализ не распространен из-за дороговизны и сложности пробоподготовки. Для выявления приема синтетических эндогенных стероидов предложено использовать определение стероидного профиля, то есть количественное определение совокупности концентраций и соотношений стероидов. Впервые использовать стероидный профиль для выявления применения тестостерона было предложено еще около 30 лет назад, однако проблема выявления приема запрещенных эндогенных стероидов не решена и в настоящее время. Для обнаружения применения различных эндогенных стероидов существует несколько критериев, установленных ВАДА, однако наибольшее диагностическое значение имеет только один - соотношение концентраций тесто-стерона/эпитестостерона (Т/Е). Однако одного данного соотношения недостаточно, поскольку применение запрещенных в спорте прогормонов может оказывать значительное влияние на спортивную форму, оставаясь при этом «незаметным» для лабораторий допинг-контроля. Данная ситуация показывает, что используемая методика определения приема стероидов тестостеронового ряда может быть улучшена за счет мониторинга ряда других перспективных соотношений.
С 2007 года ВАДА ввело понятие «атипического» результата, то есть сейчас любая аккредитованная лаборатория при обнаружении некоторых несоответствий пробы стандартным параметрам обязана сообщить об «атипическом» результате. В таком случае будут изучены и сравнены предыдущие и последующие пробы спортсмена. Чтобы упростить решение этой проблемы, ВАДА предложило составлять индивидуальный стероидный паспорт и собирать данные по концентрациям и соотношениям эндогенных стероидных гормонов для каждого спортсмена, что впоследствии позволит установить индивидуальные нормы, составляющие часть так называемого «Биологического паспорта спортсмена». «Биологический паспорт спортсмена» состоит из трех модулей. Первый - паспорт крови - существует с 2009 года, второй - стероидный - планируется создать в 2012 году, а эндокринный - к 2014 году.
В настоящее время существуют следующие критерии ВАДА: соотношение Т/Е >4, концентрации тестостерона (Т) и эпитестостерона (Е) > 200 нг/мл, концентрации
андростерона (А) и этиохоланолона (Этио) > 10000 нг/мл и концентрация дегидро-эпиандростерона (ДГЭА) > 100 нг/мл. Проба, в которой наблюдается превышение одного или нескольких данных параметров считается атипической и подвергается дальнейшему анализу методом ГХ/С/ИМС.
Традиционно для определения эндогенных стероидов используется метод газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС), позволяющий разделять большое количество исследуемых соединений за один анализ. Для успешного определения эндогенных стероидов методом ГХ-МС необходимо проведение предварительной дериватизации для перевода исследуемых соединений в соответствующие летучие производные. Данный подход позволяет определять большинство эндогенных стероидов на уровне 10 нг/мл в реальных образцах.
В настоящее время антидопинговые лаборатории определяют не более восьми эндогенных стероидов, причем данные по условиям их определения очень противоречивы - авторы предлагают различные условия для гидролиза, проводят построение градуировочных зависимостей с использованием разных матриц, а чаще всего даже не указывая их. При определении популяционных норм для концентраций эндогенных стероидов не всегда используется нормировка на плотность мочи, что приводит к повышенной вариативности полученных данных. В последнее время в литературе появились данные, что традиционно изучаемый стероидный профиль, состоящий из восьми стероидов и их соотношений, не чувствителен к приему новых прогормонов, поэтому необходимо определять дополнительные эндогенные стероиды, которые впоследствии могут стать новыми маркерами приема запрещенных препаратов.
Цели работы заключались в:
-
разработке способа выявления факта употребления эндогенных стероидов, основанного на определении в моче ряда эндогенных стероидов, а именно андрогенов, эстрогенов и прогестинов;
-
составлении индивидуального стероидного профиля, представляющего совокупность концентраций и соотношений исследуемых стероидов, изучении его стабильности во времени;
-
определении популяционных и индивидуальных границ для соотношений и концентраций эндогенных стероидов;
-
поиске новых наиболее значимых маркеров приема эндогенных стероидов.
Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:
разработать способ анализа мочи на стероидный профиль, заключающийся в ферментативном гидролизе, жидкостно-жидкостной экстракции и дериватизации эндогенных стероидов с последующим определением этих веществ методом ГХ-МС;
провести сравнение коэффициентов чувствительности градуировочных графиков, полученных при различных условиях, и выбрать оптимальные матрицы для построения градуировочных зависимостей всех исследуемых эндогенных стероидов;
провести метрологическую аттестацию разработанного способа определения эндогенных стероидов;
провести анализ образцов, получаемых от ВАДА в рамках межлабораторного сравнения результатов, и статистически сравнить полученные данные с другими лабораториями, аккредитованными ВАДА;
провести анализ статистически значимого количества проб мочи российских спортсменов и получить значения концентраций и соотношений исследуемых стероидов для данной специфической популяции, а затем установить популя-ционные пределы для основных концентраций и соотношений эндогенных стероидов российских спортсменов с учетом пола и плотности мочи;
разработать программный модуль, позволяющий в соответствии с теоремой Байеса и на основе полученных популяционных данных рассчитывать доверительные интервалы для каждого спортсмена с учетом его собственных параметров стероидного профиля, при содействии факультета Вычислительной математики и кибернетики Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова (ВМК МГУ);
провести апробацию разработанной методики и программного модуля на реальных образцах мочи;
найти новые значимые маркеры приема эндогенных стероидов с помощью программного пакета Statistica;
установить популяционные пределы для найденных новых маркеров приема эндогенных стероидов и внести данные параметры в разработанную методику.
Научная новизна. Разработана методика определения стероидного профиля мочи, состоящая из количественного определения 43 эндогенных стероидов. Получены масс-спектры электронной ионизации триметилсилильных производных всех исследуемых соединений, причем часть спектров получена впервые. В работе показаны преимущества и недостатки построения градуировочных графиков с использованием различных матриц мочи. Показано, что основным преимуществом использования в качестве матрицы мочи, из которой предварительно удалены неконъгированные стероиды, является повышение точности определения стероидного профиля.
На основе определения стероидного профиля более 5000 проб мочи спортсменов и описательной статистики установлен вид распределения концентраций и соотношений всех исследуемых стероидов. Показано, что вид популяционного распределения соотношения ТУЕ сильно отличается в зависимости от пола.
На основании проведенных систематических исследований установлены популяционные пределы для определяемых параметров стероидного профиля. Показано,
6 что популяционные пределы для российских спортсменов заметно различаются в зависимости от пола, вследствие чего данный фактор предложено использовать при анализе. Выявлены аналитические перспективы использования данного подхода для повышения чувствительности определения стероидного профиля.
Разработан программный модуль Bayesian Biomarkers, позволяющий вычислять индивидуальные пределы для разнообразных параметров стероидного профиля, используя теорему Байеса. Использование индивидуальных границ для концентраций или соотношений эндогенных стероидов вместо популяционных при определении приема запрещенных препаратов позволяет увеличить время их детектирования в целом в 2 раза.
Применение одного из подходов хемометрики, реализованного в программе Statistica в сочетании с разработанной программой Bayesian Biomarkers, позволило найти новые значимые маркеры приема запрещенных препаратов. Использование данного подхода позволило увеличить время детектирования приема запрещенных препаратов в среднем в 3 раза, а в некоторых случаях в 5 раз по сравнению с использованием традиционных маркеров, предложенных ВАДА.
Практическая значимость. Предложенная методология позволяет решить проблему определения эндогенных стероидов в моче человека. Изученные матрицы для построения градуировочных зависимостей позволяют выбрать наиболее подходящие условия для проведения градуировки, обеспечивающие наибольшую точность при проведении количественного определения эндогенных стероидов.
Разработанный программный модуль позволяет составлять индивидуальный гормональный паспорт с учетом собственного метаболизма и особенностей стероидного профиля.
Предложенная методика определения стероидного профиля мочи человека в течение более чем трех лет используется в Федеральном государственном унитарном предприятии «Антидопинговый центр» (ФГУП АДЦ). За это время проанализировано более 5000 проб спортсменов.
Также разработанная методика используется при анализе проб добровольцев, участвующих в проекте «Марс 500» во время 105-ти и 520-ти суточной изоляции. Показана зависимость экскреции половых стероидных гормонов от солевой диеты, стресса и других факторов внешнего воздействия.
На защиту выносятся:
сравнение матриц для построения градуировочных зависимостей и выбор оптимальной;
метрологически аттестованный способ определения стероидного профиля мочи и внесение методики определения эндогенных стероидов в область аккредитации ФГУП АДЦ;
установленные референсные пределы для российских спортсменов с учетом пола и плотности мочи;
программный модуль Bayesian Biomarkers, позволяющий вычислять индивидуальные границы для параметров стероидного профиля в зависимости от пола, возраста, вида спорта и других параметров;
методология выявления приема эндогенных стероидов с использованием установленных референсных пределов, а также разработанного программного модуля, и соответствующие им времена определения приема допинговых препаратов;
новые маркеры приема запрещенных эндогенных стероидов и соответствующие им сроки определения приема допинговых препаратов.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на 28-ой рабочей встрече по проблемам антидопингового контроля (7-12 марта 2010 г., Кёльн, Германия), на московском семинаре по аналитической химии (28 октября 2009 г. Москва, Россия), на III Всероссийской конференции «Аналитика России» (27 сентября - 3 октября 2009 г., Краснодар, Россия) и на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (14 - 18 апреля, 2008 г., Клязьма, Москва, Россия).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ в виде статей и тезисов докладов. Подана заявка №2011109874 и получено положительное заключение о выдаче патента «Способ определения стероидного профиля при допинговом контроле спортсменов».
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка использованной литературы.
Определение стероидов в моче
При построении градуировочных зависимостей для количественного определения эндогенных стероидов методом ГХ-МС возникает несколько сложностей: 1) в моче присутствуют большое количество метаболитов тестостерона, поэтому для построения градуировочнои зависимости с использованием в качестве матрицы мочи необходима предварительная подготовка образца с целью удаления стероидов; 2) для некоторых типов модельных растворов (матриц), на которых проводится построение градуировочнои зависимости эта зависимость нелинейна [16]; 3) отклик определенных количеств стероидов, введенных извне, отличается от матрицы к матрице, причем отклик в моче является максимальным.
Проблема влияния матрицы на градуировочные коэффициенты все еще недостаточно изучена, однако некоторые авторы пытаются найти универсальный способ построения градуировочнои зависимости. Существует несколько способов построения градуировочных зависимостей. Так, например, для имитации биологической матрицы в работах [17, 18] предложено использовать вместо мочи смесь ]Ч,1Ч-диизопропиламиноалканов с длиной боковой цепи С -С2з- Полученная таким образом смесь не содержит мешающих эндогенных стероидов, однако авторы не указывают отклонение градуировочных коэффициентов от значений, полученных при построении градуировочнои зависимости с использованием мочи в качестве матрицы. Дополнительным недостатком такого способа построения градуировочных зависимостей является коммерческая недоступность данной смеси.
Другой метод построения градуировочнои зависимости основан на использовании смеси растворов метанольных стандартов [19]. Основным недостатком данного метода является занижение градуировочных коэффициентов по сравнению с мочой. Также предлагается использовать для построения градуировочных зависимостей детскую мочу [7], в которой практически не содержится стероидных гормонов, а также мочу, пропущенную предварительно через картридж для ТФЭ [20] для удаления как свободных, так и конъюгированных стероидов. Однако ни один из этих способов не стал единым для построения градуировочных зависимостей для количественного определения эндогенных стероидов. Каждая лаборатория, определяющая стероидный профиль, сталкивается с проблемой выбора матрицы, и лишь некоторые коллективы авторов приводят в своих статьях всю процедуру построения градуировочных зависимостей с указанием использованной матрицы [7,17-20].
Таким образом, проблема выбора наиболее подходящей и стабильной матрицы является весьма сложной задачей при определении эндогенных стероидов. Данная ситуация ведет к значимым различиям в полученных концентрациях, что в свою очередь приводит к заметной флуктуации в популяционных и индивидуальных диапазонах, используемых различными группами исследователей для установления допустимых норм и границ у спортсменов.
Впервые термин «профиль» был введен в 1971 г. в работе Хорнинга [21] и использовался для обозначения многокомпонентного анализа, охватывающего метаболически родственные соединения. Стероидный профиль, в свою очередь, включает в себя совокупность стероидов, представляющих собой различные классы (андрогены, эстрогены, прогестины). Первоначально исследование стероидного профиля было направлено на установление границ нормы и патологии для выявления заболеваний различной природы. Обзор, включающий в себя описание всех существовавших к тому моменту методик для анализа стероидного профиля как мочи, так и других биологических жидкостей, написан еще в 1986 году [22]. Однако, исследования профессора Донике показали [23, 24], что колебания не только концентраций, но и соотношений различных стероидов могут быть вызваны как различными заболеваниями, так и применением многочисленных запрещенных препаратов. В то время как распространение получили экзогенные стероиды [25], многие спортсмены стали искать альтернативные препараты, оказывающие схожий эффект, но не включенные на тот момент в Запрещенный список. В качестве таких субстанций спортсмены стали употреблять эндогенные стероиды, такие как тестостерон (Т), дегидроэпиандростерон (ДГЭА), дигидротестостерон (ДГТ) и другие [26]. Первым эндогенным стероидом, который начали использовать в качестве допинга, был тестостерон. Поиск метода для определения приема тестостерона стал началом использования стероидного профиля в допинговом анализе. Первоначально было установлено [27], что его применение увеличивает скорость выведения глюкуронида тестостерона больше, чем других его метаболитов. При исследовании выведения дейтерированного тестостерона было показано, что степень выведения эпитестостерона (Е) не изменяется [28]. Так как эпитестостерон не является метаболитом тестостерона, соотношение тестостерона к эпитестостерону (Т/Е) может быть использовано как маркер употребления тестостерона [29].
В 1982 году Международный олимпийский комитет запретил применение тестостерона и определил соотношение концентраций глюкуронидов тестостерона к эпитестостерону выше 6 как положительную пробу. Выбор соотношения Т/Е = 6 в качестве границы был основан на популяционных данных, полученных в работе [28]. Однако к 2005 году появились новые формы тестостерона в виде гелей и пластырей, применение которых не привело к увеличению соотношения Т/Е до 6. В связи с этим, разрешенное соотношение Т/Е было понижено до 4 с целью увеличения чувствительности определения тестостерона. Более того, было показано, что продолжительный прием тестостерона также угнетает выработку собственного эпитестостерона [30], и соотношение Т/Е повышается.
Уменьшение количества выводимых эндогенных стероидов, вызванное применением андрогенных анаболических стероидов, было впервые изучено авторами [31] на пробах мочи тяжелоатлетов. В дальнейшем [32] показано, что длительное применение анаболических стероидов оказывает влияние на эндо кринную систему, угнетая выработку собственных гормонов, в связи с чем было решено проводить мониторинг стероидного профиля спортсменов.
Многие коллективы авторов тщательно изучали влияние приема различных видов запрещенных препаратов, таких как экзогенные анаболические стероиды [31-36], диуретики [37] и кортикостероиды [38] на стероидный профиль. Однако основополагающее значение для допинг-контроля получили работы Манфреда Донике и его коллег [23, 28, 39-45], направленные на изучение влияния приема стероидов, идентичных натуральным и присутствующим в организме человека как в виде исходных соединений, так и в виде многочисленных метаболитов. Такие стероиды лишь условно являются «эндогенными», поскольку препараты, содержащие данные соединения и производимые различными фармацевтическими компаниями - прогормоны - широко распространены и коммерчески доступны.
Как видно из рис. 2, изменение концентраций одного или нескольких из этих соединений приводит к изменениям в соотношениях или концентрациях в естественно сбалансированной системе. Основная идея стероидного профиля -в измерении соотношений эндогенных стероидов вместо их концентраций. Концентрации для допинг-анализа не столь надежны вследствие суточных флуктуации выведения стероидов и различной плотности мочи.
Стероидный профиль и генетика
Для построения градуировочной зависимости первоначально добавляли приготовленные заранее градуировочные растворы в количестве 30 мкл и рабочий раствор (50 мкл) внутреннего стандарта в пробирку с закручивающейся крышкой на 15 мл. Растворы упаривали досуха под вакуумом и затем добавляли по 3 мл одной из исследуемых калибровочных матриц.
Добавляли 1 мл карбонатного буфера, тщательно перемешивали и охлаждали до комнатной температуры. Добавляли 5 мл диэтилового эфира и 1 г сульфата натрия, после чего все тщательно перемешивали в течение 5 мин.
Центрифугировали 5 мин при 2500 об/мин, если после центрифугирования слои не разделялись, аккуратно встряхивали пробирку, постукивая по ней до разрушения геля, и снова центрифугировали 5 мин при 3200 об/мин.
Замораживали водный слой примерно 5 минут, аккуратно переливали эфирный слой в пробирку для дериватизации. Упаривали досуха при 70С, после чего выдерживали дополнительно 20 мин при этой же температуре.
После охлаждения в пробирку добавляли 50 мкл рабочего дериватизиру-ющего реактива, плотно закрывали крышкой, омывали стенки пробирки реактивом и нагревали 20 мин при 70С.
Реакционную смесь охлаждали, переносили в виалу и анализировали методом ГХ-МС. Обработка данных и построение градуировочных кривых проводились в программе ChemStation.
Препараты эндогенных стероидов, использованные в работе Препарат тестостерона - Андриол ТК (Н.В. Органон, Нидерланды), 1 кап сула содержит 40 мг действующего вещества - тестостерона ундеканоата. Препарат дегидроэпиандростерона - DHEA (Ultimate nutrition, США), 1 капсула содержит 50 мг действующего вещества — дегидроэпиандростерона.
Прием препаратов эндогенных стероидов Три добровольца участвовали в эксперименте после подписания разрешения этической комиссии. Предварительно перед приемом препаратов собирали по 5 заведомо отрицательных проб у каждого добровольца. Пробы замораживали при -20С и использовали для дальнейших экспериментов.
Каждый из трех добровольцев принимал 100 мг ДГЭА и 80 мг тестостерона однократно с разницей в 2 недели. Мочу собирали в течение 7 дней после приема, по следующей схеме: 1-ый день — 4 пробы, 2-ой - 3 пробы, 3-ий — 2 пробы, 4, 5 и 7-ой дни по одной пробе. Собранные после приема каждого препарата пробы были заморожены при -20С и использовали для дальнейших экспериментов.
Статистические программы и математические модули, используемые в работе Для вычисления индивидуальных референсных интервалов использовали программный модуль Baiesian Biomarkers, разработанный совместно с факультетом Вычислительной математики и кибернетики Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.
Для статистической обработки данных, вычисления популяционных референсных интервалов и поиск новых маркеров приема эндогенных препаратов проводили в программе Statistica 10.
Для оптимального разделения 43 эндогенных стероида выбрана колонка Restek Rxi - 1ms, 12 м длина, 0.20 мм внутренний диаметр, 0.33 мкм толщина неподвижной фазы. Исходя из летучести триметилсилильных производных стероидов и температур кипения используемых реагентов и растворителей нами выбрана следующая температурная программа: начальная температура 188С, далее подъем со скоростью 2С/мин до 232С, далее подъем со скоростью 12С/мин до 300С, изотерма 5.33 мин. Выбор данной температурной программы с низкой скоростью подъема в начальной стадии, обусловлен большим количеством эндогенных стероидов, имеющих аналогичные масс-спектры и примерно одинаковые хроматографические свойства. Объем вводимой пробы 2 мкл в режиме деления потока (1:10), температура инжектора - 280С. Газ-носитель - гелий (0.6 мл/мин). Температура источника ионов - 230С, температура переходной линии - 290С, квадруполя - 150С, скорость сканирования -1.69 циклов/сек, диапазон масс в режиме полного сканирования - 50-600 а.е.м.
Для определения относительных времен удерживания использовали времена удерживания определяемых веществ и внутреннего стандарта. Для определения времен удерживания каждого соединения, а также для выбора характеристичных ионов было проанализировано ТМС-производное каждого стандартного образца в режиме полного сканирования. Были получены масс-спектры электронной ионизации для каждого соединения и выбраны характеристичные ионы для последующего анализа в режиме селективной регистрации ионов. При выборе характеристичных ионов для каждого соединения руководствовались следующими принципами: 1 - наибольшая интенсивность, 2 - лучшая форма хроматографического пика. Времена удерживания определяемых соединений и характеристичные ионы приведены в табл. 10. Количественное определение стероидов основывается на соотношении площадей выбранного целевого иона и внутреннего стандарта, в то время как второй ион используется для подтверждения или идентификации соединения.
Приготовление фосфатного буфера
В связи с тем, что в моче одни и те же стероиды выводятся в концентрациях, которые могут различаться на 2-3 порядка в зависимости от пробы, возникает необходимость одновременно определять как высокие, так и низкие концентрации. При этом использование кривой первого порядка в качестве градуиро-вочного графика приводит к увеличению ошибки в области высоких концентраций при повышении точности в области низких концентраций и наоборот. Это связано, по всей видимости, с тем, что построенные прямые, несмотря на достаточно высокий коэффициент корреляции, представляют собой не идеальную прямую. В связи с этим, для повышения точности анализа на всем диапазоне определяемых концентраций для некоторых соединений были выбраны градуировочные кривые второй степени, что заметно повысило точность определения для всех уровней концентрации.
У некоторых соединений построенные, с помощью данной матрицы, градуировочные зависимости проходили через начало координат, хотя у большинства соединений свободный член в уравнении оказался значимым. 3.1.5 Эффективность гидролиза и степень извлечения
Использование для гидролиза р-глюкуронидазы E.coli позволяет определять стероиды в свободной и глюкуронидной фракциях. Хотя сульфатную фракцию можно проанализировать после гидролиза смесью ферментов из Helix Pomatia, данная смесь приводит к многочисленным побочным эффектам. В связи с этим, лаборатории антидопингового контроля не используют данный фермент для анализа стероидов. По этой же причине в официальном техническом документе ВАДА [72] предписывается использовать для гидролиза 0-глюкуронидазу Е.соН, с целью расщепления только глюкуронидов стероидов.
Для проверки эффективности гидролиза к различным образцам мочи добавляли Б4-андростерона глюкуронид и 05-этиохоланолон в соотношении 1:1 (в пересчете на свободный андростерон). После проведения гидролиза в течение 1.5 часов при 57С рассчитывали степень гидролиза (СГ) по следующей формуле: cr=cD4-A/cD5.E-ioo%, где CD4-A - концентрация В4-андростерона, a CD5-E - концентрация D5-этиохоланолона. Полученные таким образом значения для различной мочи не показали значительных отклонений от 100%, что свидетельствует о полном гидролизе.
Для установления степени извлечения к 6-ти различным образцам «свободной мочи», добавляли исследуемые соединения на уровне 3-его калибратора, после чего проводили экстракцию, как описано выше. Одновременно те же 6 образцов были проэкстрагированы и в органический слой были добавлены калибраторы в тех же концентрациях - полученные таким способом значения были приняты за 100% экстракции. Степень извлечения для каждого соединения рассчитывали как отношение концентраций, полученных в первом эксперименте, к концентрациям со 100% степенью извлечения. Процедура экстракции выполняется с помощью диэтилового эфира, который является более эффективным, чем менее полярные растворители, например н-пентан. Степень извлечения для каждого исследуемого соединения приведена в табл. 15. Как и ожидалось, наиболее полярные соединения, содержащие в своей структуре большее число атомов кислорода, извлекаются диэтиловым эфиром хуже, чем менее полярные соединения.
При проведении метрологической аттестации разработанного способа определения стероидного профиля в моче человека использовали руководство Eurachem [108]. Правильность (п=18) была определена как процентная разница между средним и теоретическим значением (метод «введено - найдено»). Повторяемость (п=6 в течение одного дня) и воспроизводимость (п=18 в течение нескольких дней) рассчитывали как относительное стандартное отклонение, выраженное в процентах.
Каждая градуировочная кривая построена на 5 уровнях концентрации. Данные уровни концентрации различаются в зависимости от соединения. Уравнения и коэффициенты корреляции представлены в табл. 14. Для большинства стероидов градуировочные кривые имеют коэффициент корреляции не хуже 0.99, что говорит о хорошей сходимости определяемых соединений в изученном диапазоне концентраций.
В табл. 15 представлены значения правильности, повторяемости, воспроизводимости и степени извлечения для наименьшей, средней и наибольшей точек градуировочного графика. Значение точности, согласно руководству Eurachem [109] должно быть в пределах ±20% для нижней точки концентрации. В случае с наибольшей концентрацией были установлены следующие пределы ±15%.
Заключения об итогах исследований от лабораторий, аккредитованных ВАДА. Межлабораторная сходимость результатов
Как было показано, переход от популяционных к индивидуальным доверительным интервалам гораздо более значим для определения приема запрещенных эндогенных стероидов. Данный подход позволяет не только установить индивидуальные границы для каждого спортсмена, но и при длительном мониторинге людей с повышенным соотношением Т/Е выяснить, является ли такое значение соотношения особенностью метаболизма или результатом приема допинга.
Однако существующий на сегодняшний день традиционный стероидный профиль охватывает небольшое количество эндогенных стероидов и их соотношений, при этом лишь некоторые из них значимо изменяются после приема запрещенных препаратов. Эти изменения сильно зависят от индивидуальных особенностей метаболизма, таким образом, для некоторых людей данные соотношения являются наиболее значимыми, а для других - абсолютно не изменяются после приема запрещенных препаратов.
В итоге, составление индивидуального стероидного профиля и мониторинг данных во времени позволяет заметно повысить чувствительность определения приема эндогенных стероидов по сравнению с традиционными популяционны-ми границами и критериями, установленными ВАДА.
Индивидуальный стероидный паспорт является мощным инструментов в борьбе с допингом, поскольку показывает не только индивидуальные нормы, но зависящие только от собственного метаболизма флуктуации соотношений и особенно концентраций эндогенных стероидов. Однако набор параметров, тра 130 диционно определяемых для составления стероидного профиля, достаточно ограничен и охватывает далеко не все возможно значимые маркеры.
Для расширения возможностей анализа методом стероидного профиля и увеличения чувствительности определения приема прогормонов эндогенных стероидов было принято решение провести поиск новых соотношений с помощью модуля «Добыча данных» программы Statistica. Для этого предварительно получили все возможные соотношения из исследуемых концентраций, причем в расчет принимали только значения более 5 нг во всех исследуемых пробах (как до, так и после приема изучаемых прогормонов). В связи с особенностями индивидуального метаболизма некоторые стероиды могли присутствовать или отсутствовать у разных добровольцев, поэтому окончательное количество исследуемых соотношений было разным для каждого добровольца.
Для поиска новых, наиболее значимых соотношений эндогенных стероидов использовали «деревья классификации». Деревья классификации - это метод, позволяющий предсказывать и искать зависимость между наблюдениями и результатом анализа. Таким образом, имея набор соотношений, данный метод может показать, насколько значимо результат анализа (положительная или отрицательная проба) зависит от каждого соотношения. Широкая сфера применимости деревьев классификации делает их весьма привлекательным инструментом анализа данных, однако не следует полагать, что его рекомендуется использовать вместо традиционных методов статистики. Напротив, если выполнены более строгие теоретические предположения, налагаемые традиционными методами, и выборочное распределение обладает некоторыми специальными свойствами, то более результативным будет использование именно традиционных методов. Однако, как метод разведочного анализа или как последнее средство, когда отказывают все традиционные методы, деревья классификации, по мнению многих исследователей, не знают себе равных [111].
Деревья классификации идеально приспособлены для графического представления, и поэтому сделанные на их основе выводы гораздо легче интерпретировать, чем если бы они были представлены только в числовой форме.
Первоначально использовали способ анализа, при котором все пробы, собранные после приема тестостерона, принимали за положительные, а все пробы, которые собрали до приема препарата - отрицательные. Однако после поиска установили, что выбранные программой в качестве значимых соотношения не представляют интереса для дальнейшего анализа либо из-за незначительного различия для проб до и после приема препарата, либо из-за отсутствия связи выбранных соотношений с возможными путями метаболизма тестостерона. В связи с этим мы предположили, что тестостерон действительно выводится из организма достаточно быстро, и через неделю невозможно определить факт его приема.
После этого мы решили принять одну или несколько последних точек за отрицательные и продолжить поиск новых значимых соотношений. В результа те для первого добровольца наиболее показательными оказались соотношения Т/ДГЭА, Этио/ДГЭА, 5сс-андростан-За,17р-диол/ДГЭА, 5р-андростан-За,17р диол/ДГЭА, 5Р-андростан-За,17Р-диол/прегнандиол и 5Р-андростан-За,17Р диол/ПР-гидрокси-Этио, которые заметно повышаются сразу после приема те стостерона. ,
На рис. 67 в качестве примера изображено дерево классификации, по которому однозначно можно определить прием тестостерона, если значение соотношения 5р-андростан-За,17р-диол/11Р-гидроксиЭтио превышает 2.14. При таком значении соотношения отрицательными оказались последние 4 точки после приема тестостерона.
