Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 12
1.1. Классификация пестицидов 12
1.2. Современные методы определения пестицидов 16
1.2.1. Инструментальные методы определения пестицидов
1.2.2. Иммунохимические методы определения пестицидов 25
II. Экспериментальная часть 31
II. 1. Проведение измерений с применением пьезокварцевого иммуносенсора
II.2. Проведение измерений методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа
II.3. Исследование влияния органического растворителя 44
II.4. Пробоподготовка образцов для анализа 46
III. Изучение закономерностей гетерогенной иммунохимической реакции на поверхности пьезокварцевого иммуносенсора
III. 1. Влияние способа иммобилизации на свойства биорецепторного покрытия сенсора
Ш.2. Кинетические исследования иммунохимических реакций антиген-антитело
Ш.З. Влияние концентрации иммунореагентов на полноту протекания иммунохимических реакций
Ш.4. Исследование специфичности иммунореагентов 61
Ш.5. Сравнительная характеристика конкурентного и сэндвич-форматов анализа
IV. Изучение закономерностей гомогенной иммунохимической реакции 75
IV. 1. Влияние структуры иммунореагентов на характеристики ПФИА пестицидов
IV.2. Исследование кинетических закономерностей ПФИА пестицидов
V. Исследование влияния органического растворителя на полноту протекания иммунохимической реакции
VI. Применение иммунохимических методов анализа для определения пестицидов
VI. 1. Оптимизация условий определения пестицидов методом "dip and dry"
VI.2. Определение пестицидов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора
VI.3. Сравнение методик определения пестицидов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа
Выводы
Список использованной литературы 112
- Современные методы определения пестицидов
- Проведение измерений методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа
- Кинетические исследования иммунохимических реакций антиген-антитело
- Исследование кинетических закономерностей ПФИА пестицидов
Введение к работе
Актуальность. Проблема безопасности пищевых продуктов и сельскохозяйственного сырья является основным фактором, определяющим здоровье людей и сохранение генофонда. Поэтому обостряются вопросы, связанные с объективностью контроля качества пищевых продуктов, кормов, продукции растениеводства и животноводства, в частности, с определением пестицидов, способных аккумулироваться в почве, воде, сырье и продуктах его переработки. Наибольшей токсичностью характеризуются хлорорганические пестициды и продукты их метаболизма, отнесенные к стойким органическим загрязнителям из-за трудности деградации. Некоторые представители этого класса запрещены к применению, но продолжают использоваться (алдрин и др.). Проблема контроля содержания пестицидов в объектах окружающей среды и пищевой продукции является сложной аналитической задачей, связанной с низкими концентрациями токсикантов и сложными процессами взаимодействия их с компонентами пробы. Среди инструментальных методов контроля хлорорганических пестицидов наибольшее распространение находят хроматографические методы, обязательно включающие сложные способы пробоподготовки методами твердофазной, жидкостной или сверхкритической флюидной экстракции. К недостаткам известных хроматографических методик определения пестицидов следует отнести длительность анализа, необходимость тщательной очистки экстракта, не всегда удовлетворительную селективность и чувствительность, высокую стоимость оборудования.
Постоянное обновление перечня применяемых пестицидов требует разработки новых альтернативных методик определения токсикантов. Иммунохимические методы анализа, характеризующиеся высокой селективностью и чувствительностью, положительно зарекомендовали себя при определении следовых концентраций ряда пестицидов и других биологически активных соединений (БАС). Они основаны на гомогенном и гетерогенном связывании определяемого антигена с антителами, что обуславливает высокоспецифичное определение аналита в сложных матрицах. Так, метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа позволяет детектировать протекание иммунохимического взаимодействия непосредственно в пробе, а с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров возможна регистрация образования гетерогенного иммунокомплекса практически в режиме реального времени. Однако для определения изопротурона, алдрина, имидаклоприда, ряда хлорацетанилидных пестицидов такие методы ранее практически не применялись.
Поэтому проведение исследований, направленных на создание высокочувствительных, экспрессных и селективных методик определения ряда хлорорганических пестицидов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и растительном сырье методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа и с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров актуально с научной и практической точки зрения.
Настоящая работа является плановой научно-исследовательской работой кафедры химии ЛГТУ и поддержана грантом РФФИ № 06-03-96339_р__центр_а «Новые методы определения биологически активных соединений, основанные на иммунохимических реакциях на поверхности пьезокварцевых сенсоров»; грантом 05-03-39024-ГФЕН_а «Иммуноаналитические системы на основе тест-полосок и коллоидного золота для определения пестицидов»; темпланом Минобрнауки РФ «Физико-химические основы формирования и функционирования биосенсорных систем для определения физиологически активных веществ»; государственным контрактом № 02.444.11.7345 «Способ определения бутахлора с помощью пъезокварцевого иммуносенсора».
Цель исследования - изучение возможности применения гомогенного и гетерогенного иммунохимических методов анализа (поляризационный флуоресцентный иммуноанализ и пьезокварцевый иммуносенсор) и разработка методик определения ряда хлорорганических пестицидов (ацетохлор, бутахлор, алахлор, алдрин, имидаклоприд, изопротурон) в объектах окружающей среды и пищевых продуктах. Для достижения поставленной цели было необходимо: изучить методы иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов и аналитов на поверхности электродов пьезокварцевого сенсора;
исследовать аффинность и специфичность иммунореагентов, применяемых для поляризационного флуоресцентного иммуноанализа и при разработке пьезокварцевого иммуносенсора;
синтезировать меченные флуоресцеином производные пестицидов (трейсеры) и изучить влияние структуры трейсера на аналитический сигнал в ПФИА;
исследовать кинетику гомогенной и гетерогенной иммунохимической реакции антиген-антитело;
изучить влияние органического растворителя на полноту протекания иммунохимической реакции;
оценить различные форматы иммуноанализа (конкурентный и сэндвич-анализ);
разработать методики определения ряда хлорорганических пестицидов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах с применением пьезокварцевого иммуносенсора и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа. Научная новизна работы:
разработан общий подход и показаны возможности конкурентного определения с помощью пьезокварцевого иммуносенсора и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа хлорорганических пестицидов (ацетохлор, алахлор, бутахлор, алдрин, имидаклоприд); определены условия формирования многослойных биорецепторных покрытий сенсоров, предназначенных для детектирования ацетохлора, бутахлора, алахлора, алдрина, имидаклоприда, характеризующихся высокой доступностью активных сайтов связывания, устойчивостью и невысокой массой; показано влияние состава рецепторных покрытий на величину аналитического сигнала иммуносенсора при определении ряда хлорорганических пестицидов;
обоснованы условия применения сэндвич-анализа для высокочувствительного определения алдрина с помощью пьезокварцевого иммуносенсора;
изучены особенности протекания гетерогенной иммунохимической реакции в присутствии органических растворителей и возможность применения экстракционных систем на основе гидрофильных растворителей для снижения предела обнаружения алдрина; исследовано влияние структуры и природы трейсеров, применяемых при разработке методики ПФИА для определения алахлора, алдрина, изопротурона, на аналитический сигнал и ширину линейного диапазона. Практическая значимость: разработаны новые методики определения ряда хлорорганических
пестицидов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора и методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа; установлены константы аффинности, позволившие выбрать иммунореагенты для высокочувствительного и селективного определения пестицидов (ацетохлор, бутахлор, алахлор, алдрин, имидаклоприд, изопротурон); предложены способы получения биорецепторного покрытия сенсора для высокочувствительного и селективного определения хлорорганических пестицидов; предложена экстракционная система на основе ДМФА, позволившая существенно снизить предел обнаружения алдрина; оптимизирован алгоритм определения пестицидов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора в режиме "dip and dry"; показано влияние структуры и природы трейсера на возможность определения пестицидов методом ПФИА. Научная новизна способа определения ацетохлора, бутахлора, алахлора с помощью пьезокварцевого иммуносенсора подтверждена положительным решением о выдаче патента (заявка № 2007112327/04(013387)). На защиту выносятся:
- результаты исследования влияния способов иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов и аналитов на чувствительность определения пестицидов;
- результаты кинетических и аффинных исследований гетерогенной иммунохимической реакции антиген-антитело, протекающей на поверхности иммуносенсора и гомогенной иммунохимической реакции в растворе;
- зависимость аналитического сигнала и интервала определяемых содержаний алахлора, изопротурона, алдрина от структуры синтезированных флуоресцентных производных пестицидов при проведении поляризационного флуоресцентного иммуноанализа;
- сравнительная характеристика конкурентного и сэндвич-форматов анализа при определении алдрина;
- результаты исследования влияния органического растворителя на полноту протекания иммунохимической реакции на поверхности пьезокварцевого иммуносенсора;
- экстракционные системы для эффективного извлечения и концентрирования алдрина из водной фазы;
- методики определения ряда хлорорганических пестицидов в режиме "dip and dry";
методики определения пестицидов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах с помощью пьезокварцевого иммуносенсора (ацетохлор, бутахлор, алахлор, имидаклоприд, алдрин) и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (алахлор, алдрин, изопротурон). Апробация работы. Отдельные разделы диссертации изложены на V
Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы
теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2005); III
Международной конференции «Экстракция органических соединений»
(Воронеж, 2005); Региональной конференции «Внедрение в производство
«чистых» технологий» (Липецк, 2005); Международных конференциях
молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2006» (Москва,
2006), «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), «Ломоносов-2008» (Москва, 2008);
Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология:
современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пушино,
2006); International Congress ICAS (Moscow, 2006); Всероссийской студенческой
научно-технической конференции «Инженерные науки - защите окружающей
среды» (Тула, 2006); VI Всероссийской конференции по анализу объектов
окружающей среды «Экоаналитика-2006» (Самара, 2006); XV Областной
научно-технической конференции «Повышение эффективности
металлургического производства (Липецк, 2006); IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006); XVII Российской Молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2007); II Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России» (Краснодар, 2007); XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 2 статьях, 17 тезисах докладов.
Структура работы. Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста, включает 35 рисунков и 21 таблицу. Состоит из введения, 6 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 201 ссылку.
Современные методы определения пестицидов
Наибольшее распространение для определения пестицидов различных классов получили хроматографические методы. Они незаменимы не только для количественного определения пестицидов, но и для идентификации определяемых индивидуальных веществ в многокомпонентных пробах. Селективность и чувствительность определения зависит от применяемого детектора, но практически любая методика включает достаточно сложную стадию пробоподготовки. Это может приводить к дополнительным потерям и, следовательно, ошибке анализа. Газовая хроматография остается наиболее распространенным методом определения летучих пестицидов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах [12-24]. Наиболее часто при определении пестицидов методом ГХ используется универсальный пламенно-ионизационный детектор, характеризующийся широким линейным диапазоном определяемых содержаний. Однако для определения токсикантов на уровне ПДК и ниже требуется предварительное концентрирование. Например, извлечение двенадцати фосфорорганических пестицидов (дихлорвос, мевинфос, форат, диметоат, диазинон, дисульфотон, паратион-метил, мелатион, фентион, хлорпирифос, хлорфенилфос, этион) из образцов молока [12] осуществляется этилацетатом в присутствии высаливателя (Na2S04). Такая процедура позволяет отделить пестициды от нерастворимых белковых компонентов пробы, а в сочетании с двухстадийным экстракционным концентрированием снижает предел обнаружения до 0,0051 - 0,019%, что составляет 0,1-1,0 ПДК.
Использование детектора электронного захвата [13-16] повышает селективность и чувствительность (до уровня пг) определения хлорорганических пестицидов. Однако, вследствие низких значений ПДК токсикантов методики газохроматографического анализа так же включают стадию концентрирования, наиболее часто осуществляемую жидкость-жидкостной и твердофазной экстракцией или методом тонкослойной хроматографии. Для разделения близких по свойствам веществ используют капиллярные колонки с различной полярностью (на основе борорганических НТ8 и силоксановых CPSil 19 фаз) [14]. Однако даже в этих случаях не удается осуществлять детектирование ХОП на уровне ПДК. И если предел обнаружения ХОП описанным способом составляет 0,03 - 50 мкг/мл [16], ПДК токсикантов в поверхностных водах существенно ниже — 2-10" ; 10-10" ; 2-10" , 30-10"3 мкг/мл для алахлора, метолахлора, атразина и 2,4-Д соответственно.
Несмотря на то, что пламенно-фотометрический детектор по чувствительности уступает другим детекторам, он существенно превосходит их по селективности при определении фосфор- и серосодержащих пестицидов в воде [14] и овощах [17]. Однако его применение ограничено частичным сгоранием в водородно-воздушном пламени матричных компонентов пробы, которые так же могут содержать атомы серы и фосфора, что приводит к ошибкам при установлении низких концентраций пестицидов. В тоже время, методика определения фосфорорганических пестицидов в овощах, описанная в [17], дополненная концентрированием на дисковом накопителе со стеклянным фильтром средней пористости (G4), позволяет детектировать диметоат, паратион-метил, малатион и хлорпирифос на уровне 1,2; 2,8; 1,8; 3,5 мкг/кг соответственно. Селективность пламенно-фотометрического детектора к серосодержащим соединениям относительно фосфорсодержащих и углеводородов настолько велика (до 10 - 10 ), что не требуется использование дополнительных приемов разделения и идентификации. Повышение селективности обеспечивает так же комбинация нескольких детекторов. Например, при хроматографировании сложных по составу проб с ПИД и ПФД возможна надежная идентификация и определение целевых компонентов [22].
В настоящее время для определения пестицидов, особенно имеющих низкие значения ПДК, наиболее перспективно использование сочетания хроматографических методов анализа с масс-спектрометрическим детектированием [25-36]. Такие хромато-масс-спектрометры объединяют один из наиболее мощных методов разделения (хроматография) с методом, обеспечивающим высокую степень структурной информации (масс-спектрометрия). При применении ГХ-МС для ионизации пробы наиболее часто применяют электронный удар [25, 26] или химическую ионизацию [27-29]. Преимуществом электронного удара по сравнению с химической ионизацией, обеспечивающей информацию о молекулярной массе, является получение богатых фрагментами масс-спектров, представляющих данные о структуре соединения. Извлечение пестицидов из проб воздуха, воды, почвы и пищевых продуктов в методе хромато-масс-спектрометрии обычно осуществляют на картридж или мембранный диск с сорбентом [23, 29], а так же гель-фильтрацией [19, 26, 31]. Например, для определения следовых концентраций хлорорганических пестицидов их концентрировали на активированном угле, модифицированном хлоридом цинка [30]. Сконцентрированные на угле пестициды десорбировали нагреванием и разделяли на колонке (30 м х 0,25 мм) с неподвижной фазой на основе полидифенил/полидиметилсилоксана с программированием температуры. Предел обнаружения пестицидов составляет 0,08-0,20 мкг/л (в то время, как при газохроматографическом определении с пламенно-фотометрическим детектором Cmjn = 500 мкг/л) [14, 30].
Количественное выделение пестицидов группы ДДЕ и токсафена из мяса диких животных [31] включало отделение от липидов с помощью гель-проникающей хроматографии, последующее разделение структурных аналогов на колонках, заполненных силикагелем, и изократическое элюирование растворами диэтилового эфира в гексане с возрастающей полярностью. Описана методика хромато-масс-спектрометрического определения метаболита пестицида - имидаклоприд - 6-хлорникотиновой кислоты в урине с пределом обнаружения 16 пг/мл [37], включающая экстракцию целевого компонента ацетоном, твердофазную экстракцию на амберлитовом картридже XAD-4 и элюирование диэтиловым эфиром. Описанные подходы (двойное концентрирование пробы - при извлечении из матрицы и концентрирование целевых компонентов на сорбентах) обеспечивают определение токсикантов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах на уровне ПДК и ниже.
Метод ВЭЖХ позволяет осуществлять раздельное определение пестицидов и их метаболитов на уровне 0,6 - 2,0 нг/мл [38, 39]. Проведение анализа возможно в нормально-фазовом и обращенно-фазовом вариантах. Так, сравнительная оценка чувствительности определения 3-цифлутрина в присутствии пестицидов других классов [40] показала сопоставимость результатов. Несмотря на это, в последнее время наиболее часто используется вариант обращенно-фазовой хроматографии.
Проведение измерений методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа
Синтез трейсеров проводили на кафедре химической энзимологии МГУ под руководством д.х.н., проф. Еремина С.А. При синтезе трейсеров (аналит, меченый флуоресцентной меткой) к раствору, содержащему 6 мг (20 мкмоль) карбоксильного производного пестицида или его структурного аналога в 0,2 мл диметилформамида, добавляли 8 мг (80 мкмоль) N-гидроксисукцинимида и 8 мг (40 мкмоль) дициклогексилкарбодиимида (рис. 6). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. К полученному раствору добавляли 5 мг (10 мкмоль) этилендиаминфлуоресцеина. Далее очищали реакционную смесь с помощью тонкослойной хроматографии.
Очистка трейсеров методом тонкослойной хроматографии. Реакционную смесь, содержащую трейсер, исходные компоненты, побочные продукты реакции и разложения трейсера, а также вспомогательные реагенты, наносили на пластину "Silufol" (Чехия), размером 20 х 20 см: проявитель - смесь метанол:хлороформ 1:4 (по объему). Полосы, окрашенные в желтый свет и проявляющиеся в ультрафиолетовом свете, то есть содержащие флуоресцентные соединения с различными значениями Rf, собирали с пластинки и элюировали в 1 мл метанола. Степень очистки флуоресцентных соединений контролировали хроматографически по значениям Rf и в дальнейшей работе использовали только те трейсеры, которые связывались со специфическими антителами. Метанольный раствор трейсера хранили при 4С, при работе растворы трейсеров дополнительно разбавляли боратным буферным раствором до рабочей концентрации.
Для измерения поляризации флуоресценции использовали TDx-анализатор фирмы "Abbott", США, снабженный термостатической ячейкой и программным обеспечением. Концентрацию трейсера определяли спектрофотометрическим методом (спектрофотометр "Shimadzu UV-1602", Shimadzu, Япония) при длине волны 498 нм в 50 мМ карбонатном буферном растворе по молярному коэффициенту поглощения 8,78хЮ4 М"1 см флуоресцентных соединений, установленному заранее. Для измерений использовали боросиликатные стеклянные кюветы 10 75мм.
Процедура измерений методом поляризационного флуоресцентного анализа. Предварительно определяли оптимальное разведение антител. В 10 кюветах последовательно двукратно разбавляли антитела в 500 мкл боратного буферного раствора, начиная с разведения 1:20. Затем во все кюветы добавляли по 450 мкл рабочего раствора трейсера и измеряли поляризацию флуоресценции. Концентрация рабочего раствора соответствовала 50%-ному связыванию антител и аналита.
При построении градуировочного графика в кювету с 50 мкл образца или раствора пестицида с известной концентрацией добавляли 400 мкл рабочего раствора трейсера и 50 мкл антител с рабочим разведением. Смесь перемешивали и измеряли поляризацию флуоресценции. При определении констант аффинности использовали метод Скэтчарда, описанный ранее [173, 174]. Уравнение для расчета констант аффинности высоко- и низкомолекулярных фракций антител к = Ш АФ [AT]-[B][F] (где [Am] - концентрация антител, вводимых в систему; [В] — концентрация связанной фракции трейсера; [F] — концентрация свободной фракции трейсера) преобразовывали к линейному виду [Б]/г]=КАф[Ат]-КАф[В]. На линейных участках графика в координатах [BJ/fFJ от IgfBJ определяли значения констант аффинности высоко- ( КАФ ) и низкоаффинных ( К"Аф ) фракций антител. Отношение [B]/[FJ вычисляли по формуле ([B]/[FJ)=(mPr mPmir)/(ynPmax-mPi), где mPmax и mPmin - максимальное и минимальное значение поляризации флуоресценции, определенное по градуировочной зависимости mP от разбавления антител. Концентрацию свободной фракции трейсера [F] находили спектрофотометрически с учетом разведения.
Для снижения предела обнаружения пестицидов при пробоподготовке использован метод жидкостной экстракции гидрофильными растворителями, образующими самостоятельную фазу при введении высаливателя.
Оптическую плотность водно-солевых растворов измеряли в ультрафиолетовой области спектра на фотометре «Эксперт-003» (ООО «Эконикс-Эксперт», г. Москва) при длине волны 375 нм. Концентрацию аналита в органической фазе определяли с помощью пьезокварцевого иммуносенсора. Плотность водно-солевых растворов устанавливали пикнометрическим методом. Перемешивание растворов осуществляли на вибромесителе "Kavalier" (Чехословакия).
Для изучения расслаивания экстракционных систем на основе неограниченно смешивающихся с водой органических растворителей, использовали методику построения тройных концентрационных диаграмм. В градуированную пробирку помещали 2,0; 1,0; 0,5 мл органического растворителя и титровали раствором соли известной концентрации, фиксируя точку исчезновения твердой фазы и точку гомогенности. В пределах двухфазной области одновременно измеряли соотношение равновесных фаз. По полученным данным строили диаграммы вода-высаливатель-гидрофильный растворитель. Для построения тройных концентрационных диаграмм применяли метод Розебума [175, 176].
Процедура экстракции. Для расчета коэффициента концентрирования проводили последовательное измерение объема водной пробы, вводимого в систему органического растворителя и, так же, равновесные объемы водной и органической фаз. Органическая фаза представляла собой раствор воды в органическом растворителе, содержащем высаливатель в зависимости от его природы. При проведении эксперимента к фиксированному объему органического раствора аналита добавляли органический растворитель и после перемешивания вводили высаливатель и встряхивали в течение 40 мин на вибромесителе. Концентрат использовали для анализа с помощью пьезокварцевого иммуносенсора.
Для ускорения процесса экстракции и снижения расхода реагентов применяли технику микроэкстракции. К 3 мл анализируемой пробы, содержащей пестицид, добавляли органический растворитель и высаливатель и перемешивали в пробирке в течение 1 мин до выделения органического растворителя в самостоятельную фазу. Органическую фазу отбирали микрошприцем и использовали для анализа.
Для изучения влияния органического растворителя на аналитический сигнал пьезокварцевого иммуносенсора в раствор PBS добавляли 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80% органического растворителя, проведенного через все стадии жидкость-жидкостной экстракции и осуществляли измерение в проточно-инжекционном режиме по методике, описанной ранее.
Кинетические исследования иммунохимических реакций антиген-антитело
Изучение закономерностей иммунохимической реакции, протекающей на поверхности электродов пьезокварцевого сенсора, включает выполнение кинетических исследований. Проведение измерений в проточно-инжекционном режиме позволяет оказывать влияние на отдельных стадиях анализа как на полноту протекания прямой реакции между антигеном и антителом с образованием поверхностного иммунокомплекса, определяющей величину аналитического сигнала сенсора, так и на реакцию разрушения иммунокомплекса на стадии регенерации биочувствительного слоя, приводящую к восстановлению активных сайтов распознавания на поверхности электрода. Следовательно, установление значений констант скорости прямой и обратной реакций, а так же величин констант аффинности иммунореагентов имеет важнейшее значение, позволяющее управлять аналитическим процессом, влиять на чувствительность и селективность определения пестицидов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора.
Применение методики Скэтчарда, включающей определение скорости иммунохимической реакции по тангенсу угла наклона кинетической зависимости аналитического сигнала сенсора, позволило рассчитать скорость взаимодействия всех исследуемых пестицидов с соответствующими антителами. Далее графическое представление зависимости скорости реакции от частоты колебаний сенсора позволило установить константы скорости прямой и обратной реакции и константы аффинности иммунореагентов (рис. 9 а, б).
Рассчитанные значения константы скорости образования и разрушения иммунокомплекса, константы аффинности иммунореагентов, представлены в табл. 3. Максимальные значения к0 наблюдаются при взаимодействии ацетохлора и имидаклоприда с соответствующими поликлональными антителами Anti-Ac Lot6 и Anti-5A2-Cpy-GA-STI (4,1-109 и 2,1-109 л/моль-с). Следовательно, при использовании этих антител можно существенно сократить время достижения равновесия при образовании комплекса, а так же продолжительность этой стадии анализа. Для пар иммунореагентов AMPA-BSA + Anti-Ac Lot6 и 5A2-Cpy-CC-BSA + Anti-5A2-Cpy-GA-STI константы скорости разрушения иммунокомплекса различаются на два порядка (2,3-10"2 и 3,9-10"5 с" ), что сказывается на значениях констант аффинности, которые так же различаются на два порядка. Низкое значение кр для реакции диссоциации комплекса на основе имидаклоприда свидетельствует об его устойчивости, поэтому для восстановления биослоя сенсора необходимо применять более жесткие регенерирующие растворы (например, 0,05 М раствор KCNS, 0,01 М раствор NaOH и др.), а более высокое кр для диссоциации комплекса на основе ацетохлора - указывает на возможность использования более мягких реагентов (0,04 мМ раствор KCNS, Н20 и др.). Можно так же отметить, что для реакций хлорацетанилидных соединений и алдрина происходит параллельное увеличение к0 и кр, поэтому значения констант аффинности таких иммунореагентов близки.
Следовательно, КАФ В большей степени зависит не от к0, а от кр. Так, самое эффективное аффинное взаимодействие отмечено для следующих пар иммунореагентов: 5A2-Cpy-CC-BSA + Anti-5A2-Cpy-GA-STI и 5А2-Сру-СС-OVA + Anti-5A2-Cpy-GA-STI, для которых вместе с высоким значением к0 характерно и самое низкое значение кр. Такая закономерность характерна для пар иммунореагентов, при синтезе которых использованы кросс-реагенты СС и GA. Белковая же молекула в составе конъюгата практически не влияет на величину КАФ При применении поликлональных антител против алдрина и прямая, и обратная иммунохимические реакции замедляются {к0 и кр — величины порядка 10 -10 и 10" соответственно). Использование моноклональных антител к алдрину способствует повышению эффективности иммунохимического взаимодействия, что подтверждается увеличением к0 и кр до 10 - 10 и 10" -10 4 соответственно. Значение КАф так же возрастает (с 107 - 109 до 1010 - 10й).
На величину КЛф оказывают влияние так же природа линкера, с помощью которого присоединяются молекулы гаптена к белковой молекуле, и природа белка в конъюгате (табл. 6). Применение хлорацетанилид-белкового конъюгата без линкера, содержащего молекулу STI, приводит к более высокому значению КАФ ПО сравнению конъюгатом на основе BSA, что вероятно, зависит от большей молекулярной массы и более объемной структуры BSA по сравнению с STI. В тоже время присоединение BSA к гаптену через линкер, способствует возрастанию КАф, в то время как, пришивка STI через линкер снижает КАФ. Следует также отметить, что для реакций между гомологичными реагентами КАф на 1-2 порядка выше по сравнению с аналогичными величинами для гетерологичных реагентов.
Исследование кинетических закономерностей ПФИА пестицидов
Для достижения наибольшей чувствительности анализа необходимо иметь антитела с наилучшей аффинностью и специфичностью. При взаимодействии антитело-трейсер-аналит важным условием является оптимальное соотношение констант связывания аналита с антителами и антител с трейсером.
В работе использовали поликлональные (алахлор, изопротурон) и моноклональные (циклодиеновые пестициды) антитела. Кинетическая зависимость, построенная в координатах Скэтчарда для поликлональных антител имеет вид гиперболы (рис. 26), что позволило рассчитать константу аффинности высоко- ( клф) и низко- ( клф ) аффинной фракций антител как тангенс угла наклона прямолинейных участков зависимости отношения концентрации связанной в комплекс формы антигена к концентрации свободной ([B]/[F]) от концентрации связанной формы [В]. Все сыворотки (LIB-CCD2.4 MAb, LIB-CCD2.2 MAb, LIB-CCD2.5 МАЬ) протестированы на связывание с гомологичными (CCD1-EDF, CCD2-EDF) треисерами. Для каждой пары антитело-трейсер получали кривую титрования и находили середину линейного участка, отвечающую 50%-му связыванию трейсер-антитело.
Для возможности индивидуального определения алдрина проанализированы поликлональные антитела Anti-Aldrin Rabbit с теми же треисерами. Однако связывания не наблюдалось, поэтому можно предположить, что КАф К і, и не происходит разрушения комплекса трейсер антитело при введении анализируемого соединения.
Таким образом, было показано, что наилучшие параметры анализа обеспечивает использование гомологичных пар иммунореагентов для циклодиеновых пестицидов и-изопротурона и гетерологичных для алахлора. Гомологичные антитела обладают более высокой аффинностью по отношению как к трейсерам, так и к аналиту. Выигрыш в чувствительности анализа с гомологичными антителами по сравнению с гетерологичными - в 5-10 раз.
Проведена сравнительная оценка средневесовой константы аффинности, полученной методом ПФИА и константы аффинности, полученной методом пьезокварцевого микровзвешивания. Например, для алдрина гетерогенные константы аффинности не совпадают с полученными методом ПФИА: в первом случае КЛф - 2,0-1011 М"1, а во втором - 6,1-108 М"1. Это может быть связано как с влиянием формы и конфигурации молекулы в растворе и на поверхности электрода сенсора, так и с вкладом структуры участвующего в иммунохимической реакции трейсера. Для алахлора же, напротив, величины констант аффинности близки, что может быть объяснено близкой (Ala-МРА) или одинаковой (С4) структурой гаптена, использованного цри синтезе гаптен-белкового конъюгата и трейсера.
Определение оптимальных концентраций иммунореагентов. Для определения оптимальных условий изучения систем ПФИА и разработки иммуноанализа необходимой стадией является подбор концентраций иммунореагентов. Концентрацию трейсеров в ПФИА выбирают исходя из возможностей прибора: ее значение должно обеспечивать интенсивность флуоресценции, превышающую фон (интенсивность буферного физиологического раствора) в 10 и более раз. С другой стороны, чувствительность анализа будет тем ниже, чем меньшие концентрации иммунореагентов используются. В качестве рабочих были выбраны концентрации трейсеров, соответствующие 15-тикратному превышению сигнала фона. Соответствующие рабочие концентрации трейсеров определены спектрофотометрически (при длине волны 492 нм) и составили 1-4 нМ.
Более сложной задачей является определение концентрации антител по градуировочной зависимости интенсивности поляризации флуоресценции от степени разбавления. В работе использованы антитела различной природы: для циклодиеновых - моноклональные, для изопротурона и алахлора — поликлональные кроличьи и овечьи антисыворотки соответственно. Определение оптимальной концентрации антител осуществляли построением градуировочных зависимостей при разной степени разбавления антител в линейном диапазоне связывания. В каждом случае оценку осуществляли для нескольких трейсеров (рис. 27).
Традиционно в иммунохимических методах анализа в качестве рабочей выбирают концентрацию, отвечающую 50%-му связыванию. Однако в ПФИА при этом наблюдается невысокая разница между максимальным и минимальным значением сигнала, что не позволяет в дальнейшем проводить высокочувствительное определение низкомолекулярных соединений. Поэтому более перспективно использование концентрации, соответствующей 70%-му связыванию. Это позволяет нивелировать вклад неспецифических взаимодействий трейсера с присутствующими белками и компонентами сыворотки на начальном участке кривой.
Для оценки селективности определения пестицидов методом ПФИА в присутствии родственных соединений рассчитан коэффициент перекрестного реагирования (ПР, %). Для определения коэффициентов перекрестного реагирования к пробе, содержащей структурный аналог аналита, добавляли фиксированное количество антител на него, трейсер и измеряли поляризацию флуоресценции. Низкие-, коэффициенты перекрестного реагирования для структурных аналогов свидетельствуют о возможности высокоспецифичного определения индивидуального соединения в присутствии структурных аналогов. Эндосульфан диол Атразин 0 Эндосульфан сульфат 81 Следует отметить1 корреляцию коэффициентов перекрестного реагирования, полученных методом ПФИА и с помощью пьезокварцевого иммуносенсора. Например, при использовании пары иммунореагентов C4-EDF + Anti-Alachlor, предназначенных для определения алахлора, коэффициент перекрестного реагирования на бутахлор и ацетохлор составляет 5,0 и 0,01% (при применении пьезокварцевого иммуносенсора - 4,0 и 2,0% соответственно). Это свидетельствует о возможности предварительной оценки селективности иммунореагентов более экспрессным методом ПФИА.
Исследованы закономерности протекания гомогенной иммунохимической реакции методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа. Обоснованы требования к иммунореагентам и показана зависимость константы аффинности гомогенной иммунохимической реакции от структуры флуоресцеин-меченого антигена. Синтезированы трейсеры, характеризующиеся высокой степенью аффинности и специфичности к хлорорганическим соединениям. Дана сравнительная оценка коэффициентов перекрестного реагирования методом ПФИА и с помощью пьезокварцевого иммуносенсора. Показана взаимозаменяемость этих двух методов и возможность определения селективности более экспрессным методом ПФИА.
