Введение к работе
Актуальность проблемы. Актин существует в клетке в фибриллярном (Ф-) и глобулярном (Г-) состояниях и составляет 5-15% от ее сухого веса (Страйер, 1984). Актин участвует в построении актинового цитоскелета и, тем самым, играет важную роль в выполнении ряда важнейших функций: организации пространственного расположения внутриклеточных структур, взаимодействии клетки с внешней средой, генерации силы, обеспечивающей движение клетки и ее формообразование (Fletcher, Mullins, 2010). Кроме этого, актин служит основой внутриклеточного и межклеточного транспорта и сигнализации, формирования и хранения структурных следов адаптации и памяти (Крутецкая и др., 2003; Павлик, 2004; Корее et al, 2006; Тирас, 2007; Bestman, Cline 2008; Bressloff, Earnshaw 2009). Изменение соотношения Г- и Ф-актина вызывает изменение всех выше приведенных клеточных функций, в том числе и внутриклеточного транспорта (Weisswange et al, 2006). Состояние актина в клетке может изменяться под влиянием эндогенных процессов, сопряженных с действием внешних факторов (Браун, Моженок 1987), поэтому крайне важно выявлять такие изменения. Существенный вклад в исследованиях роли актина в жизнедеятельности клеток занимает микроскопия. Существующие методы, использующие белки и пептиды, меченные флуо-рофорами, пероксидазой, флуоресцирующими белками или коллоидным золотом, оптическую регистрацию двухфотонной микроскопией флуоресценции резонансного переноса энергии между актиновыми мономерами, позволяют избирательно и раздельно визуализировать Г- и Ф-актин внутри живых и фиксированных клеток и изучать динамику актинового цитоскелета (Moshkov et al, 1980; Tiras et al, 1992; Cao et al, 1993; Shaffer et al, 1998; Hodgson et al, 2000; Reddy 2001; Okamoto, Hayashi, 2006; Anderi, Schmid, 2007; Koestler et al, 2009; Uttamapinant et al, 2010; Riedl et al, 2010; Kiuchi et al, 2011; Du, Ren, 2011; Dovas et al, 2011; Fan et al, 2012; Gunewardene et al, 2012; Thon, Italiano, 2012). К сожалению, из-за непроницаемости плазматической мембраны для меченых конъюгатов, как правило, их приходится инъецировать в клетку или пермеабилизировать ее, нарушая интактность. Неконтролируемость степени связывания меток с Г-актином не позволяет провести его количественную оценку. Атомно-силовая и электронная микроскопия выявляют субклеточную локализацию только микрофиламентов, но не Г-актина (Jung et al, 2010; Pavlik, Moshkov, 1992; Павлик и др., 2003). Прямая оценка последнего как субстрата для формирования Ф-актина при функционировании клеток является актуальной нерешенной задачей. Для визуализации и количественной оценки Г-актина, по-видимому, можно использовать дофамин, который, как недавно установлено, прямо проникает в клетку (Павлик и др., 2004; Безгина и др., 2006; Павлик и др., 2008), стехиометрически связывается с Г-актином и превращает его в фила-менты, визуализируемые флуоресцентной и электронной микроскопией (Мошков и др., 2010).
Цель и основные задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование возможности использования дофамина для визуализации и количественной оценки содержания Г-актина в клетках различной природы. Были поставлены следующие задачи:
1. Изучить на примере трансформированных клеток BALB/3T3 и 3T3B-SV40 примени
мость дофамина для цитохимической визуализации и оценки содержания Г-актина и
выявления его на ультраструктурном уровне.
Используя те же подходы:
-
Изучить, влияние дофамина и его производного пиримидинтиона in vitro на прикрепляющиеся культуры, на примере рака гортани человека (Нер-2).
-
Изучить действие дофамина in vitro на суспензионные культуры, на примере острой моноцитарной лейкемии человека (ТНР-1).
-
Изучить взаимодействие дофамина с клетками в условиях in vivo, на примере асцит-ной карциномы Эрлиха мышей.
Научная новизна. Впервые показано, что флуоресцирующим субстратом в цитозоле клеток, подвергнутых воздействию дофамина в процессе инкубации и затем обработанных по методу Фалька для выявления катехоламинов (изохинолинов), является филаментозный актодо-фаминовый комплекс, наблюдаемый при исследовании в электронном микроскопе в виде
сформированных нитей в локусах, где ранее выявлялись лишь глобулярные структуры. Такие же нити формируются при взаимодействии Г-актина с дофамином в модельных экспериментах in vitro, причем их диаметр почти на 30% больше, чем у Ф-актина, что соответствует представлению о встраивании дофамина как ингредиента в филаментозный актодофамино-вый комплекс. Об этом же говорят данные по интенсивности флуоресценции таких препаратов, пропорциональной концентрации Г-актина. Впервые установлена закономерная взаимосвязь между дофамин-индуцированной интенсивностью флуоресценции определенных локу-сов цитозоля живых клеток и концентрацией в них Г-актина. Показано, что по интенсивности люминесценции можно прямо судить о количестве Г-актина в них. Показано, что сам по себе Г-актин является слабым звеном в поддержании функционального состояния клетки. Определена концентрация дофамина, практически безвредная для нормальных клеток, но губительная для трансформированных клеток с разной степенью малигнизации или злокачественности. Это может способствовать разработке нового фундаментального подхода к онко-терапии, основанного на использовании в качестве терапевтической мишени цитозольного Г-актина, стойко повышенная концентрация которого характерна для опухолевых клеток, а в качестве терапевтического средства - проникающее в клетки вещество, например, дофамин или пиримидинтион, полимеризующие Г-актин.
Научно-практическая значимость работы. Проведенное исследование кроме своего фундаментального значения - расшифровки механизма взаимодействия дофамина с клетками-мишенями - имеет ярко выраженный прикладной аспект. В пользу научно-прикладной значимости работы свидетельствует то, что ее результаты расширяют представления об использовании дофамина как проникающего в клетку вещества, полимеризующего актин, как молекулярного инструмента для исследования роли этого цитоскелетного белка в морфофунк-циональной организации живых клеток различной природы. Флуоресцентная визуализация актодофаминового комплекса внутри клеток имеет практическое значение для количественной оценки Г-актина внутри клеток, но также, что немаловажно, может служить диагностическим признаком злокачественности клеток. Дофамин может быть рекомендован для использования в терапевтических целях в медицинской практике как цитостатик для раковых клеток человека, и как средство для лечения злокачественных асцитных опухолей, на что получены соответствующие патенты. Применение препаратов природного происхождения открывает перспективу в медицине не только благодаря их высокой биологической активности и низкой токсичности, но также позволяет видеть в них прототип для создания нового класса веществ схожего механизма действия, но стойких к биодеградации, следовательно, имеющих пролонгированное действие и больший эффект на патологически измененные клетки. Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы были представлены на XIII-ой Всероссийской научно-технической конференции «Нейроинформатика - 2011» (Москва, 24-28 января 2011г), 15-й и 16-й Международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2011г и 16-21 апреля 2012г); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 24-26 мая 2011г); на конкурсе У.М.Н.И.К. (1-2 июня 2011), на 7-м международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 3-13 июня 2011г); на IV Международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чте-ния-2011" (Санкт-Петербург, 7-9 декабря 2011); на International Symposium "Biological Motility: Fundamental and Applied Science" (Пущино, 11-15 мая 2012); Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика», 22-24 октября 2012, Пущино. Публикации
По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 6 статей в рецензируемых журналах, входящих в регламентированный список ВАК, 3 статьи в сборниках работ, 2 патента. Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка
литературы. Диссертация изложена на страницах, содержит рисунков. Список лите
ратуры включает наименования отечественной и зарубежной литературы.
Похожие диссертации на Исследование дофамина как молекулярного инструмента для визуализации и количественной оценки содержания Г-актина в клетках
