Введение к работе
Актуальность темы. Мембранные белки (МБ) составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Эти белки играют основную роль в процессах передачи сигналов, как на уровне отдельной клетки, так и на уровне целого организма. МБ обуславливают функционирование нервной, иммунной и эндокринной систем в качестве различных рецепторов, передающих сигналы через клеточную мембрану, а также в качестве ионных каналов, ответственных за распространение импульсов вдоль нервных волокон. С прикладной точки зрения МБ представляют огромный интерес как мишени для создания новых фармакологических препаратов и в качестве объектов для биотехнологических разработок. В отличие от глобулярных водорастворимых белков, МБ остаются малоизученными, а примеры их удачного использования в области фармакологии и биотехнологии чрезвычайно редки. Основные трудности в исследовании и применении МБ обусловлены особенностями их пространственной организации. Большинство МБ представляют собой связки из нескольких трансмембранных (ТМ) спиралей. Так как ТМ спирали гидрофобны, МБ может иметь нативную структуру только в присутствии биологической мембраны или подходящей мембраномоделирующей среды. Это значительно затрудняет как получение достаточных количеств препаратов МБ в функционально-активной форме, так и их дальнейшие структурно-функциональные исследования и биотехнологическое применение.
В последнее время для продукции мембранных белков все большую популярность приобретают сопряженные бесклеточные системы синтеза (СБСС). На сегодняшний день выходы целевых белков в этих системах достигают нескольких миллиграммов с миллилитра трансляционной смеси (ТС), что дает возможность получать белковые препараты в количествах, необходимых для биологических, биохимических и биофизических исследований. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции. Во-первых, в такой системе синтезируется в основном целевой продукт, во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также агентов, позволяющих удерживать синтезируемый полипептид в нативной конформации. Для продукции МБ в ТС добавляют мембраномоделирующие компоненты, поддерживающие МБ в растворимой форме, такие как мицеллы детергентов, липосомы или липопротеиновые частицы (липид-белковые нанодиски, ЛБН). Кроме того, СБСС позволяют легко получать белковые препараты, селективно меченные стабильными изотопами, что в ряде случаев облегчает проведение структурных исследований белков методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
Таким образом, разработка новых методов эффективной бесклеточной продукции МБ является актуальной задачей молекулярной биологии, биотехнологии и биофизики и открывает широкие перспективы для структурно-функциональных исследований и практического применения этих белков.
Цели и задачи исследования. Целью работы являлось исследование возможности применения СБСС на основе экстракта S30 из Е. coli для продукции МБ и их доменов в нативной конформации для дальнейшего изучения их структурных и функциональных свойств. В качестве объектов исследования были выбраны: внеклеточный домен никотинового ацетилхолинового рецептора человека а! типа (а7ВД), р-структурный белок, содержащий лиганд-связывающий участок; бактериородопсин из Exigitobacteriam sibiricum (БР-ES), - фотоактивируемый протонный насос психротолерантных бактерий, состоящий из семи ТМ спиралей, структурный прообраз мембранных рецепторов, сопряженных с G-белками (рецепторов семейства GPCR); и вольт-сенсорный домен потенциалозависимого К+-канала KvAP из археи Aeropynim pernix (ВСД-KvAP), - структурный гомолог вольтсенсорных доменов потенциалозависимых Na+-, К+-, Са - и Н -каналов млекопитающих, состоящий из четырех ТМ спиралей.
Данная цель подразумевает решение следующих задач:
-
Оптимизация бесклеточной системы синтеза на основе клеточного экстракта S3 0 из Е. coli для максимального увеличения выхода целевых белков;
-
Разработка эффективной системы бесклеточной продукции а7ВД, подбор условий выделения и очистки рекомбинантного белка в нативной конформации в количествах, достаточных для физико-химических и биологических исследований;
-
Исследование физико-химических свойств и биологической активности полученного препарата а7ВД;
-
Разработка эффективной системы бесклеточной продукции БР-ES, подбор условий получения белка в функционально-активной форме в количествах, достаточных для физико-химических и биологических исследований;
-
Разработка эффективной системы бесклеточной продукции ВСД-KvAP в нативной конформации в количествах, достаточных для физико-химических и биологических исследований;
-
Исследование возможности получения селективно меченых мембранных белков в бактериальной бесклеточной системе для структурных исследований методом ЯМР-спектроскопии на примере ВСД-KvAP.
Научная новизна и значимость работы. Все результаты, изложенные в данной диссертационной работе, получены впервые.
-
Впервые разработана эффективная система бесклеточного синтеза а7ВД в виде осадка ТС. Подобраны условия ренатурации этого белка из осадка ТС.
-
Проведен анализ физико-химических и биологических свойств а7ВД. Методами ЯМР-спектроскопии показано, что белок, ренатурированный из осадка ТС, демонстрирует селективность по отношению к а-нейротоксинам яда змей длинного и короткого типов, что свидетельствует о наличии у домена структуры, близкой к нативной.
-
Впервые разработана эффективная система бесклеточного синтеза БР-ES в растворимой форме с использованием липид-белковых нанодисков в качестве мембраномоделирующего компонента ТС. Наличие функциональной активности у МБ, встроенного в ЛБН, свидетельствует о наличии структуры БР-ES, близкой к нативной.
4. Впервые разработана эффективная система бесклеточного синтеза ВСД-KvAP в виде осадка ТС. Подобраны условия синтеза селективно меченого белка, а также условия его ренатурации из осадка ТС. Методами ЯМР-спектроскопии показано, что ренатурированный |5М-А1а-ВСД-КуАР имеет пространственную структуру, близкую к нативной.
В ходе данного исследования были разработаны и успешно применены эффективные методы бесклеточного синтеза для продукции ряда мембранных белков и их доменов. Методами ЯМР-спектроскопии и с помощью функциональных тестов для всех исследуемых белков было показано наличие пространственной структуры, близкой к нативной, что указывает на универсальность выбранного подхода. Таким образом, разработка систем бесклеточного синтеза открывает новые возможности для структурно-функциональных исследований не только никотинового ацетилхолинового рецептора, потенциалозависимого К канала KvAP и бактериородопсина из Exiguobacterium sibiricum, но может найти широкое применение в исследованиях и других мембранных белков.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 33-м Конгрессе европейских биохимических сообществ (Афины, Греция, 2008), XVI Международном симпозиуме «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Украина, 2008), XX Зимней международной молодежной научной школе «Перспективы направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2008), 4-ой Международной конференции европейского нейрохимического общества «Успехи в изучении молекулярных механизмов неврологических заболеваний» (Лейпциг, Германия, 2009), Заочной электронной конференции Российской академии естествознания «Технологии живых систем» (2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва, Россия, 2009), Международной конференции «Евромар-2010» (Флоренция, Италия, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 2 статьи в отечественных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на ПО страницах машинописного текста, состоит из Введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение), а также Заключения и Выводов. Работа проиллюстрирована 24 рисунками. Библиографический указатель содержит 166 источников.
