Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Модели низкотемпературных релаксационных процессов в стеклах, полимерах и белках 12
Модель двухуровневых систем (ДУС) 12
Модель диффузионного движения 20
Основные выводы 24
Глава 2. Экспериментальная установка и спектроскопические методики исследования низкотемпературных релаксационных процессов в белках: метод выжигания провалов 25
Метод выжигания провалов 26
Исследование спектральной диффузии во временной шкале 30
Термические циклы 33
Исследование временной и температурной стабильности спектрального провала 34
Глава 3. Исследование флуктуационных и релаксационных процессов в белках при низких температурах 37
Объекты исследования и их свойства 37
Неоднородное уширение в белках 46
Равновесная и неравновесная спектральная диффузия в белках. 49
Тепловые циклы 64
Форма провала 74
Исследование стабильности фотопродукта на основе измерения стабильности спектрального провала 81
Заключение 90
Список рисунков 91
Список таблиц 92
Список литературы
- Модель диффузионного движения
- Исследование спектральной диффузии во временной шкале
- Исследование временной и температурной стабильности спектрального провала
- Равновесная и неравновесная спектральная диффузия в белках.
Введение к работе
«Одной из основных задач исследования белка является
выявление связи между структурой, энергетическим ландшафтом, динамикой и его биологической функцией».
Г.Фрауенфельдер
В последние десятилетия интерес к биологическим объектам возрос не только в связи с развитием и потребностями медицины и биотехнологии, но и потому, что эти объекты обладают уникальными физическими и химическими свойствами. Физическая структура белков отличается от структуры классических объектов исследования физики конденсированных сред: кристаллов, жидкостей, стекол, и потому представляет специальный интерес для физических исследований.
Белки представляют собой биополимерные цепочки, состоящие из ограниченного набора аминокислот, последовательность которых задает первичную структуру белка. Число аминокислот в белках может насчитывать более сотни, а характерный размер и вес белков может варьировать в широких пределах. Одной из главных особенностей белков является компактная трехмерная структура, приобретаемая в процессе „схлопывания" биополимерной цепочки. Расположение атомов в такой структуре характеризуется упорядоченностью, которая может быть классифицирована как вторичная, третичная и четвертичная структура [1]. Одним из наглядных примеров вторичной структуры является спиралевидная форма белковой молекулы. Трехмерная атомная структура многих белков хорошо известна. Однако в масштабе меньше 0.2 А структура белка характеризуется беспорядком [2,3]. Упорядоченная структура белков ответственна за их биологическую функциональность, тем не менее, наличие беспорядка также имеет огромное значение и играет
важную роль, к примеру, в процессе сворачивания биополимерной цепочки [4]. Именно такая специфичность: наличие порядка и беспорядка в белках выделяет их как отдельные объекты исследования, свойства которых лежат между кристаллическим и аморфным состоянием.
Изучение структуры биологических кристаллов выявило ряд
особенностей, отличающих их от «обычных» кристаллов. Так,
среднеквадратичное отклонение от равновесного положения <х2>,
усредненное по одному и тому же классу атомов для разных аминокислот,
сильно отличается [2,3]. С понижением температуры амплитуда колебаний
<х2> уменьшается, однако даже при гелиевых температурах <х2>
значительно больше величины, соответствующей квантовомеханическим
колебаниям решетки. В пионерских работах по рентгеноструктурному
анализу белковых кристаллов было высказано предположение, что при
низких температурах среднеквадратичное отклонение <х2> определяется
неупорядоченностью, вызванной существованием различных
конформационных состояний белка [2,3]. Концепция конформационных состояний в белке также подтвердилась в кинетических исследованиях методом фотолиза [5]. Различные конформационные состояния отличаются друг от друга небольшой реорганизацией структуры белка за счет изменения взаимного расположения атомов. В каждом из таких состояний белок способен выполнять биологическую функцию, скорость которой может варьировать. Конформационные состояния в белках образуют иерархическую структуру. Состояния, имеющие значительные структурные отличия, относят к уровню низкого (нулевого) порядка. К примеру, в СО - миоглобине такие состояния связаны с положением связи СО по отношению к плоскости гем - группы белка [6]. Число таких конформационных состояний невелико, конформеры разделены высокими энергетическими барьерами. Уровни высокого порядка характеризуются большим набором конформационных состояний, которые разделены более
мелкими энергетическими барьерами [7]. На многомерной потенциальной поверхности (энергетический ландшафт) конформационные состояния белка образуют энергетические минимумы. Белок неотделимо связан с окружением, в котором он находится, поэтому энергетический ландшафт зависит не только от положения атомов в самом белке, но в него дает вклад и гидратационный слой, образованный за счет взаимодействия аминокислот белка с молекулами растворителя. Классификация конформационных состояний является важным шагом в понимании структуры энергетического ландшафта белка.
При физиологических температурах переходы между
конформационными состояниями необходимы для протекания биологических процессов. По температурной зависимости среднеквадратичного отклонения <х2> можно анализировать конформационные движения в белке на временной шкале эксперимента. Методами мессбауэровской спектроскопии и нейтронного рассеяния был обнаружен динамический переход между гармоническим и ангармоническим поведением <х > колебаний атомов белка [8,9] . Резкое возрастание <х > в области температуры Т«200 К связано с конформационным движением боковых групп в биополимерной цепочке и подвижностью молекул воды в гидратационном слое белковой молекулы. В исследованиях кинетических процессов в белках спектроскопическими методами при физиологических температурах была обнаружена широкая дисперсия скоростей релаксаций, характерная для стеклообразного состояния [10]. В ходе исследования фотоиндуцированных релаксационных процессов и релаксационных процессов, вызванных воздействием давления, в белках была обнаружена неэкспоненциальная временная зависимость конформационной динамики [11,12]. Детальные исследования релаксационных процессов в белках выявили также влияние свойств растворителя на динамику белка [13,14].
Понижение температуры приводит к замедлению релаксационных процессов в белках и „замораживанию" конформационной динамики. Такое „замораживание" релаксационных процессов служит весьма эффективным средством исследования сложных систем, каковыми являются белки, и широко используется в их изучении. Температурная зависимость релаксационных процессов в замороженных белках может быть, аналогично
( Е }
стеклам, описана функцией &(Г)~ехр [11]. При криогенных
\ Т-Т0)
температурах белки также проявляют аномальные свойства, аналогичные свойствам стекол. Например, в кристалле миоглобина была обнаружена линейная зависимость теплоемкости от температуры [15]. В оптических спектрах белков было обнаружено явление спектральной диффузии, которое является также и одним из характерных свойств низкотемпературных примесных стекол.
Спектральная диффузия (СД) - это проявление в оптических спектрах примесей (хромофоров) процессов структурных релаксаций, идущих в стеклообразных матрицах. Эффективные исследования СД, а с нею и низкотемпературных релаксаций в стеклах, полимерах, а также и в биологических объектах, стали возможны в результате появления методов селективной спектроскопии, в первую очередь метода выжигания провалов [16-21]. Метод выжигания провалов в неоднородно уширенных спектрах поглощения хромофоров получил широкое распространение и интенсивно используется, в частности, для изучения явления спектральной диффузии в неупорядоченных и частично упорядоченных примесных молекулярных системах [22,23]. Он весьма эффективен при изучении медленных релаксационных процессов во временной шкале, покрывающей интервал от секунд до нескольких дней или недель.
СД, как и другие аномальные низкотемпературные свойства стекол,
весьма успешно описывается моделью двухуровневых систем (ДУС)
[24 - 26]. Но это описание, несмотря на его успешность, не является вполне
удовлетворительным по ряду причин. Во-первых, оно - чисто феноменологическое и ничего не говорит о микроскопической природе ДУС. Во-вторых, оно пригодно только для описания неупорядоченных систем при низких температурах (как правило, ниже 4 К). В этой связи интерес к созданию более общих теорий, описывающих поведение неупорядоченных систем в более широком диапазоне температур и учитывающих их микроскопическую структуру, сохраняется и реализуется время от времени в создании моделей, альтернативных модели ДУС. Одним из факторов, усложняющих создание теоретических моделей аморфных систем, является универсальность поведения стекол при низких температурах. Упрощая, можно сказать, что органические и неорганические стекла и полимеры при совершенно разной химической и даже физической структурах демонстрируют существенно схожие свойства, сильно отличающиеся от свойств кристаллов, как органических, так и неорганических.
В этом отношении белки являются интересным объектом, как бы находящимся между стеклами и кристаллами. С одной стороны, белок имеет хорошо определенную структуру, с другой стороны, в нем проявляются динамические свойства неупорядоченных систем. Наличие порядка в белках делает их отличными от низкотемпературных стекол. Можно ожидать, что исследование низкотемпературных релаксаций в белках, их сравнительный анализ по отношению к стеклам могут помочь понять связь между микроскопической структурой объекта и его низкотемпературными свойствами, как для белков, так и для стекол. Весьма важным свойством белков является также влияние растворителя на их низкотемпературную динамику [27-29]. Исследование этого влияния может помочь в понимании микроскопических механизмов низкотемпературных релаксаций в белках, находящихся во взаимодействии с матрицей. В этой связи была поставлена первая задача диссертации, а именно: исследование
влияния матрицы на спектральную диффузию в белках при низких температурах и анализ данных в рамках известных моделей.
В настоящее время существует несколько альтернативных моделей СД. Их экспериментально проверяемые предсказания во многом совпадают, что затрудняет сравнение этих моделей. Одним из экспериментально проверяемых предсказаний является «форма диффузионного ядра», которая отличается в разных моделях. Исследование формы спектральных провалов может дать важную информацию как о механизмах взаимодействия хромофора с белком и растворителем, так и помочь в выборе адекватной модели. В этой связи была поставлена вторая задача диссертационной работы - исследование формы провала, уширенного за счет спектральной диффузии.
Очень важную информацию о структуре и конформационных превращениях в белке можно получить из исследований его энергетического ландшафта. Низкотемпературные данные, дающие наиболее важную информацию об этой структуре вблизи энергетического минимума, весьма скудны на сегодняшний день. Третьей' задачей диссертации было: исследование с помощью спектральной диффузии, индуцированной термическими циклами, энергетического ландшафта некоторых белков.
Исследование низкотемпературных флуктуационных и
релаксационных процессов в белках позволяет глубже понять низкотемпературную динамику в биологических объектах и ее связь с энергетическим ландшафтом. Выбранное направление исследований определяет актуальность диссертационной работы.
Научная новизна работы
Установлено, что спектральная диффузия в твердых белковых растворах в значительной степени определяется релаксационными процессами в стеклообразной матрице. Обнаружена связь между температурой стеклования растворителя и пространственной структурой белка с одной стороны и характеристиками СД с другой стороны.
Обнаружена и интерпретирована корреляция между величиной неоднородного уширения в оптических спектрах хромофора в белке и скоростью диффузионного уширения провала. Предложена модель неоднородного уширения в оптических спектрах хромофора, отражающая структурное состояние белка.
В исследуемых белках экспериментально обнаружены специфические энергетические барьеры, предположительно связанные с участием водородных связей в движении аминокислот между конформационными состояниями.
Обнаружены изменения формы спектрального провала в ходе тепловых циклов. В качестве возможной причины наблюдаемого эффекта предложена гипотеза, связывающая эти изменения с дисперсией скорости спектральной диффузии в образце.
Практическая значимость
Обнаруженное влияние релаксационных процессов в стеклообразной матрице на спектральную диффузию в твердых белковых растворах существенно меняет представление о низкотемпературной динамике в белках.
Установленная корреляция между спектральной диффузией и структурным состоянием белка дает важную информацию для построения более совершенной теории релаксационных процессов в белках и других неупорядоченных и частично упорядоченных системах.
Характеристики обнаруженных в исследованных белках специфических энергетических барьеров являются исключительно важным источником информации при анализе структуры этих белков и конформационных движений в них.
Структура и краткое содержание работы
Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, списка рисунков, таблиц, литературы и раздела благодарностей.
Модель диффузионного движения
Существует еще одна модель СД в белках, альтернативная модели ДУС, в которой спектральная диффузия связывается со структурными релаксациями [45,46]. Эта модель также предсказывает степенную временную зависимость СД.
В белке существует множество конформационных состояний, которые отличаются небольшим изменением в положении атомов. Частота перехода хромофора в белке чувствительна к окружению и будет изменяться при смене конформационного состояния. Флуктуационные процессы, ответственные за движение в конформационном пространстве, зависят от температуры Т и средней величины энергетических барьеров между конфигурационными состояниями V0. При определенных условиях на к Т величину -2— движение по потенциальной поверхности с множеством энергетических минимумов может быть описано диффузионным уравнением Фоккера-Планка [47]. В рамках диффузионной модели полагается, что смещение частоты поглощения хромофора описывается гауссовым процессом. Следствием данного предположения является гауссов контур диффузионного ядра, который определяется относительной вероятностью Р(у, 11 Vo) найти частоту в положении v в момент времени /, если в начальный момент времени частота была в положении v0, и описывается формулой: где а(/)2 =ag(l-C(/)2), среднеквадратичное отклонение от начального положения, зависящее от корреляционной функции C(t) и от параметра оь. Данная формула получена при ряде условий на корреляционную функцию C(t) и справедлива на временном участке где t Q - определяет момент времени установления стационарного диффузионного процесса.
Увеличение времени наблюдения приводит к возрастанию среднеквадратичного отклонения частоты поглощения хромофора от начального положения (C(t) —» 0 при / - со). Поскольку смещение частоты поглощения не может превышать ширину неоднородного уширения Г, то можно предположить, что предельное значение среднеквадратичного отклонения Go определяется неоднородным уширением Г. Неоднородное уширение в неупорядоченных матрицах, как правило, имеет функцию распределения, близкую к гауссовой. В таком случае величина неоднородного уширения Г связана с параметром сто выражением r = V21n2cr0. Для объяснения степенной зависимости спектральной диффузии в белках была выбрана корреляционная функция вида: где т0 - характерное корреляционное время движения. Функция такого вида (функция Кольрауша) хорошо описывает релаксационные процессы в системах с иерархическим типом движения [48]. На экспериментальной временной шкале, значительно меньшей времени корреляции t« то, временная зависимость ширины диффузионного ядра у = 2 /21n2 а(0 выражается формулой: где а и То - параметры модели. В данном виде диффузионная модель является феноменологической, температурные и временные зависимости а и т0 не могут быть получены без дополнительных предположений о характере движения в фазовом пространстве конформационных состояний. Для объяснения показателя степени 0.25 временной зависимости СД была предложена модель на основе классического представления о свободном блуждании по одномерной траектории в фазовом пространстве конформационных состояний белка, основные идеи которой будут изложены в следующем параграфе. Модель свободного блуждания по траектории
Диффузионное движение в частотной области может быть следствием диффузионного движения в фазовом пространстве конформационных состояний белка. При криогенных температурах движение между конформационными состояниями будет определяться процессами туннелирования. Чем ниже температура, тем меньше состояний, переход в которые имеет равную вероятность. В простейшем случае при смене положения будут учитываться только два состояния „вперед" и „назад". Таким образом, можно ожидать, что система будет двигаться по квазиодномерному пространству доступных состояний (см. Рис.2). Предположим, что движение в ID пространстве описывается свободным блужданием (random walk), где каждый переход в новую точку траектории происходит за время т.
Исследование спектральной диффузии во временной шкале
Релаксационные процессы в белках являются следствием конформационного движения и неразрывно связаны с энергетическим ландшафтом. Концепция энергетического ландшафта оказалась весьма плодотворной при моделировании процессов схлопывания биополимерных цепей в компактную трехмерную структуру, в которой белок биологически функционален [4]. В функциональном состоянии белок занимает наиболее энергетически выгодное положение на потенциальной поверхности [49]. Энергетический ландшафт в белках определяется их пространственной структурой, поэтому разрушение компактной структуры белка будет приводить к его изменению. В природе белки встречаются в растворе, свойства которого оказывают значительное влияние на биологическую функциональность белка. Для выполнения биологических функций белок может изменять пространственную структуру, переходя из одного конформационного состояния в другое. Конформационная динамика белков при физиологических температурах исследуется различными методами, среди которых оптические методы широко распространены. Например, широко применяется измерение температурной зависимости спектров поглощения и люминесценции пигмента в хромопротеинах, поскольку данные спектры содержат информацию о конформационных состояниях белка. Исследования фотоиндуцированных релаксационных процессов получили широкое распространение при изучении конформационной динамики в белках. На их основе была получена ценная информация о влияния растворителя на конформационную динамику [50,51]. При понижении температуры конформационная динамика белка замораживается, что позволяет разделить различные конформационные движения на временной шкале эксперимента. Однако при криогенных температурах вышеперечисленные методики малочувствительны при исследовании релаксационных процессов в белках, поэтому при низких температурах применяются методы селективной спектроскопии. Наиболее распространенным методом исследования релаксационных процессов в белках является метод выжигания провалов. Он позволяет исследовать низкотемпературные релаксации в хромопротеинах, которые в оптических спектрах проявляются в явлении спектральной диффузии.
Метод выжигания провалов
Хорошо известно, что даже при низких температурах ширина полос в оптических спектрах хромопротеинов составляет несколько сотен см"1. Широкие полосы поглощения при криогенных температурах также наблюдаются в спектрах органических молекул в стеклах и полимерах. В большинстве случаев основной причиной уширения оптических спектров хромофоров в неупорядоченных средах при низких температурах является неоднородное уширение. Использование селективных методов спектроскопии позволяет в значительной степени устранять это неоднородное уширение и выявлять тонкую структуру спектров, присущую индивидуальным молекулам хромофоров [16]. Оптическая полоса примесного центра в твердом теле имеет сложную структуру, она состоит из узкой бесфононной линии (БФЛ) и широкого фононного крыла (ФК). Схематично компоненты оптической полосы в спектре флуоресценции показаны на РисЗа. Величина электрон-фононного взаимодействия в системе характеризуется фактором Дебая - Валлера, который зависит от свойств молекулы хромофора, взаимодействия хромофора с матрицей и температуры: где Izpi и Ipw - интегральные интенсивности БФЛ и ФК соответственно. Фактор Дебая-Валлера достигает максимального значения при Т = 0 и падает с повышением температуры. Наличие широкого ФК не позволяет полностью устранять неоднородное уширение даже при низких температурах. Но обычно при анализе формы и ширины БФЛ в селективно возбуждаемых спектрах вкладом ФК можно пренебречь [52,53]. Ширина БФЛ Гиот зависит от температуры Т и определяется временем жизни возбужденного состояния 7/ и временем дефазировки Т2 (см. обзоры [16,54,55] и ссылки там):
Исследование временной и температурной стабильности спектрального провала
Повышение температуры приводит к увеличению скорости СД. Поэтому использование высоких рабочих температур позволило бы исследовать релаксации, недоступные в экспериментальной шкале времен при температуре жидкого гелия. Однако прямое повышение рабочей температуры неэффективно из-за того, что при этом однородная ширина БФЛ растет гораздо быстрее, чем диффузионная [68]. Это приводит к уменьшению точности измерений уширения спектрального провала. Метод термических циклов представляет альтернативный способ изучения температурной и временной зависимости низкотемпературных релаксаций, в котором растущий с температурой вклад однородной компоненты автоматически исключается [69].
Для проведения циклов использовался гелиевый криостат проточного типа (Leybold-Heraeus, VSK 3-300). Минимально Достижимая температура была 3.5 К при потреблении гелия на уровне 20 л в течение 8 часов. Температура образца изменялась за счет нагревания шахты с контактным газом (Не). Время нагрева и охлаждения было в пределах tc = 5 - 15 мин в зависимости от температуры цикла. Стабилизация температуры осуществлялась с помощью самодельного ПИД- контролера. Температурный сенсор (Сегпох 50, Lake Shore) позволяет измерять температуру от 1.4 К до 100 К. Он прикреплялся непосредственно к кювете с образцом. Точность стабилизации и измерения температуры составляет 0.1-0.2К. Методологически алгоритм проведения термических циклов заключается в следующем. Образец охлаждается до рабочей температуры Ть, после чего выжигается провал. После регистрации провала производится нагрев образца. Повышение температуры приводит к возрастанию скоростей релаксаций, что, в свою очередь, отражается в уширении провала. Система релаксирует в направлении нового термодинамически равновесного состояния в течение времени цикла tc. В энергетической шкале новое состояние характеризуется большей энергией, что позволяет системе преодолевать более высокие энергетические барьеры. С повышением температуры меняется и однородная ширина линии, однако однородная компонента полностью обратима в температурной шкале. Понижение температуры до Ть возвращает ее к начальному значению, и ее вклад в уширение провала в термическом цикле автоматически оказывается нулевым. Диффузионная же компонента возрастает, отражая рост СД при температуре цикла Тс.
В нашей работе мы проводили исследование термоиндуцированной СД в зависимости от температуры цикла Тс. Провал выжигался при Т = 4 К, термические циклы проводились с последовательным увеличением температуры. Диффузионное уширение провала измерялось сразу после возвращения температуры к исходному значению.
Исследование временной и температурной стабильности спектрального провала
При криогенных температурах в белках наблюдаются низкотемпературные фотореакции. При выжигании провала в белках под воздействием света может происходить фотоиндуцированное изменение локального окружения хромофора, поэтому, наряду с внутримолекулярной фотохимической реакцией может присутствовать и фотофизическое выжигание. Природа и механизм низкотемпературных фотореакций в белках до сих остается малоизученной областью. Важную информацию о типе низкотемпературных фотореакций можно получить на основе исследования стабильности спектрального провала. Две методики получили широкое применение: а) исследование стабильности провала как функции температуры и б) исследование стабильности провала как функции времени.
Метод измерений состоит в следующем. После охлаждения образца до заданной температуры выжигается провал. Число молекул, перешедших в состояние продукта, пропорционально площади выжженного провала А. Переход из состояния продукта в исходное состояние, так называемая темновая реакция, приводит к уменьшению площади выжженного провала.
В зависимости от соотношения высоты барьера и рабочей температуры квТ темновая реакция может быть вызвана как процессами туннелирования, так и активационными процессами. При заданной температуре Т число восстановившихся молекул зависит от времени наблюдения. Повышение температуры приводит к ускорению темновой реакции и более быстрому восстановлению продукта.
В нашей работе мы проводили измерения уменьшения площади выжженного провала: а) в зависимости от времени при заданной температуре и б) в зависимости от температуры термического цикла. В первом случае выжигание провалов проводилось при 4.2 К в различные моменты времени 4 после охлаждения образца до рабочей температуры при максимальной длительности этой задержки около 100 часов. Уменьшение площади каждого из выжженных провалов регистрировалось в течении времени наблюдения t. В наших экспериментах оно варьировалось в диапазоне около 4 порядков с общей продолжительностью в несколько недель.
Равновесная и неравновесная спектральная диффузия в белках.
При исследовании конформационной динамики белков при физиологических температурах было обнаружено большое влияние растворителя на релаксационные процессы в белках. К примеру, повышение вязкости белкового раствора приводит к замедлению процессов рекомбинации СО в гем-группе миоглобина после фотодиссоциации [50]. Это замедление обусловлено тем, что наиболее подвижные части белка находятся в непосредственном контакте с растворителем, и повышение вязкости последнего приводит к значительному уменьшению подвижности аминокислот и замедлению процесса диффузии молекул СО внутри белка. В других экспериментах были обнаружены интересные особенности релаксационных процессов в сахарной матрице (трехалоза). Молекулы трехалозы обладают тем свойством, что при комнатной температуре в стеклообразном состоянии приводят к значительному ускорению процессов рекомбинации СО [87]. Это может быть связано с уменьшением подвижности белка в твердой матрице, что замедляет диффузию СО из белка в растворитель. При этом важное влияние на скорость рекомбинации оказывает наличие молекул воды в ядре белка [88].
При криогенных температурах растворитель также оказывает влияние на релаксационные процессы в белках. К настоящему времени при криогенных температурах было исследовано влияние молекул трехалозы и эффекта дейтерирования на низкотемпературную динамику белка [27-29]. Было обнаружено, что дейтерирование белка приводит к уменьшению СД, а наличие молекул трехалозы в растворителе приводит к ее возрастанию. В данных работах влияние растворителя на флуктуационные процессы в белках, а также наблюдаемая степенная зависимость СД были проанализированы в рамках модели диффузионного движения [45,90]. В настоящей работе мы продолжили исследование влияния матрицы на низкотемпературную динамику белка. При этом анализ экспериментальных данных по СД был расширен, результаты проанализированы не только в рамках модели диффузионного движения [89,90,91,92], но и в рамках модели ДУС.
Модель диффузионного движения, так же как и модель ДУС, является феноменологической моделью. В ней предполагается, что низкотемпературные релаксации в неупорядоченной системе являются результатом кооперативного движения атомов, которое в фазовом пространстве состояний белка может быть описано как диффузионный процесс. В модели свободного блуждания по траектории предсказывается степенная временная зависимость СД в оптических спектрах как следствие предположения о диффузионном движении в пространстве частот и фазовом пространстве конформационных состояний (см. Главу 1). При физиологических температурах кооперативное движение является неотъемлемым условием функциональности белка. В работе [93] было показано, что конформационная динамика белков может быть интерпретирована как результат диффузионного движения. Важную роль в конформационной динамике белков играет подвижность молекул воды в гидратационном слое [94,95].
Такой тип движения, вполне возможно, сохраняется и при понижении температуры, однако флуктуационные процессы, вызванные диффузионным движением, должны сдвигаться во временной шкале в более медленную область. Формализм модели диффузионного движения в конформационном пространстве для случая низких температур был предложен в работах [46] и использовался для анализа данных по СД в белках. Основы модели изложены в Главе 1, здесь мы лишь напомним основные выводы. В моделях диффузионного движения априори предполагается гауссов процесс в частотном пространстве, и, как результат, диффузионное ядро имеет контур Гаусса. Поэтому, в соответствии с моделью, фиттинг экспериментальных данных проводился исходя из следующих предположений:
1. Поскольку во всех экспериментах первоначально выжженный провал хорошо аппроксимировался лоренцевым контуром, предполагалось, что вклад СД в исходный провал мал, и им можно пренебречь.
2. В соответствии с положениями используемой модели, диффузионное ядро полагалось имеющим гауссов контур. Поэтому контур провала, уширяющегося в процессе СД, фиттинговался функцией Фойгта. При этом ширина лоренцевой компоненты фиксировалась и полагалась равной начальной ширине провала.
На Рис.12 показана временная зависимость уширения гауссова диффузионного ядра а для Нг - Сс в смеси глицерин/вода. Из рисунка можно видеть, что:
а) СД имеет нелогарифмическую зависимость, которая может быть аппроксимирована степенной функцией ta, где 0.2 а 0.5;
б) уменьшение величины а с ростом времени старения ta говорит о вкладе релаксационных процессов в диффузионное уширение.
В модели диффузионного движения нет указания, какие участки белка участвуют в диффузионном движении. Мы провели исследования низкотемпературной динамики белка, уменьшив подвижность аминокислот в гидратационном слое за счет внедрения белка в твердую матрицу уже при комнатной температуре. Нами было обнаружено, что в Нг-Сс в сахарной матрице: а) резко возрастает величина диффузионного уширения; б) временная зависимость СД также может быть аппроксимирована степенной функцией f; в) наблюдается эффект старения.
