Содержание к диссертации
1. МЕТОД ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ КОРРЕЛЯЦИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ11
1.1. Концентрационный корреляционный анализ11
1.:1.1. Корреляции флуктуаций числа молекул 12
1.1.:2. Измерение флуктуации числа молекул 16
1.:2. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия и химическая кинетика 26
1.:2.:1. Форма сигнала и ее связь с кинетическими параметрами 26
1.:2.:2. Отношение сигнала к шуму в флуоресцентной
корреляционной спектроскопии 30
1.3. Экспериментальные установки флуоресцентной корреляционной спектроскопии 3 5
2. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ КОРРЕЛЯЦИОННЫЙ СПЕКТРОМЕТР С БОЛЬШИМ ОТНОШЕНИЕМ СИГНАЛА К ШУМУ 45
2.1. Регистрация флуоресцентной эмиссии 46
2.:2. Применение привязки в флуоресцентной корреляционной спектроскопии 49
:2.:2.1. Операция привязки 51
2.:2.:2. Влияние привязки и конечности интервала выборки на оценку автокорреляционной функции флуоресценции 53
2.:2.:3. Влияние привязки на отношение сигнал-шум эксперимента по корреляции флуоресценции
2.3. Коррелятор с одноканальной привязкой входного сигнала л 59
:2.4. Оптическая часть спектрометра 65
:2.:4..1. Возбуждение флуоресцентного излучения 65
:2.:4.:2. Сбор флуоресцентной эмиссии 67
3. РОЛЬ ФОТОФИЗИЧЕСКИХ И ФОТОХИМИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ ПО КОРРЕЛЯЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ 75
3.:1. Необратимое выцветание красителей 77
3.:2. Обратимое выцветание красителей 82
3.:3. Изучение поступательной диффузии молекул красителей 85
3.:4. Изучение поступательной диффузии макромолекул, меченных красителем 90
4. ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАНИЯ КРАСИТЕЛЕЙ С МАКРОМОЛЕКУЛАМИ 94
4.:1. Форма сигнала
4.:2. Не ковалентное связывание красителей с поли нуклеиновыми кислотами 98
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 109
ЛИТЕРАТУРА
Введение к работе
Решение множества проблем биофизики связано с исследованием кинетических процессов, протекающих в системах макромолекул как в растворах, так и в клетках и мембранах. За последние двадцать лет широкое распространение получили импульсные и релаксационные методы исследования, позволяющие изучать быстрые химические реакции в растворах [1]. В течение последнего десятилетия для исследования динамических свойств макромолекул развертывалось применение корреляционных оптических методов , таких как спектроскопия корреля-ции фотонов и спектроскопия оптического смешения [2]. В начале 1970-х годов появились новые методы, позволяющие исследовать кинетические свойства молекул в разбавленных растворах - методы концентрационной корреляционной спектроскопии [3]. С их помощью измеряют величину и временное поведение флуктуации числа наблюдаемых молекул в малом объеме образца. Согласно флуктуационно-диссипационной теореме [4], релаксация этих флуктуации подчиняется тем же законам, что и релаксация системы после макроскопического возмущения [5-7:]. Кинетические параметры разных динамических процессов (диффузия, химические реакции, конформационные изменения и :т.д.) связаны с амплитудой и скоростью флуктуации.
Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (ФКС) является одной из разновидностей концентрационной корреляционной спектроскопии, в которой для наблюдения флуктуации числа молекул используют флуоресцентную эмиссию. Хотя появление ФКС, связанное с работами Эльсона, Мэджа и Уебба [8], относится к началу 70-х годов, в последующее за первыми экспериментами десятилетие этот метод не нашел такого широкого применения, как предшествующие ему оптические методы измерения флуктуации интенсивности света. Это объясняется главным образом экспериментальными трудностями флуоресцентной корреляционной спектроскопии. ФКС довольно широко и эффективно используется для изучения поступательной диффузии в биохимических системах - в растворах [9,10], мембранах [11] и клетках [12]. Большой интерес представляют возможности ФКС в изучении химических реакций [10] и вращательной диффузии [13,14], однако эти области исследования еще находятся в начальной, методологической стадии. Более того, до сих пор во всех экспериментах, опубликованных другими авторами, корреляционные функции даже в миллисекундной области времен заметно искажены шумом. Более интересный с точки зрения физики, но в смысле шумов и более трудный для экспериментатора диапазон меньших характерных времен ранее не был исследован. Относительно мало внимания обращено и на выбор красителей, применимых в ФКС с высоким отношением сигнала к шуму. Фотофизические и фотохимические процессы в молекуле красителя -зонда ограничивают возможности повышения интенсивности возбуждения и являются важными лимитирующими факторами, резко ограничивающими применимость ФКС. Большинство красителей, используемых до сих пор в ФКС, не позволяют достигать высокого отношения сигнала к шуму и тем самым ограничивают возможности расширения временного диапазона эксперимента.
Настоящая работа поставлена с целью изучения возможностей применения флуоресцентной корреляционной спектроскопии для исследования динамики химических систем. Основными задачами являлись следующие:
- Разработка флуоресцентного корреляционного спектрометра для экспериментов с большим отношением сигнала к шуму.
- Расширение диапазона измеряемых времен корреляции в микросекундную область.
- Изучение фотовыцветания красителей и выбор конкретных красителей, удовлетворяющих требованиям фотостабильности и одновременно способностью связывания с полинуклеотидами.
Актуальность работы прежде всего определяется возможностью применения метода ФКС для исследования очень малого числа молекул - малых концентраций веществ, заключенных в малых объемах -и особенно процессов, протекающих in vivo в клетках. При этом, имеющаяся в ФКС возможность одновременного наблюдения динамики химической реакции и поступательной диффузии молекул, принимающих участие в реакции, открывает путь к исследованию образования таких комплексов, для которых при этом изменяется только коэффициент диффузии красителя, а не его спектр поглощения.
Отношение сигнала к шуму можно повысить, оптимизируя разные составные части экспериментальной установки. Так как отношение сигнал-шум в ФКС пропорционально интегральной эффективности детектирования фотонов [15], то оптическая система собирания флуоресцентной эмиссии должна быть как можно более эффективной. Другими словами, апертура собирающей оптической системы должна быть по возможности большой. В первых экспериментах по корреляции флуоресценции, а также и в некоторых последующих исследованиях использовали зеркальную оптику, собирающую эмиссию от пространственного угла, равного почти 4тт стерадиана. Однако, при такой оптической системе фоновая флуоресценция накладывает строгие требования на качество материала окон ячейки и его полировки [16.}. Поэтому целесообразно пользоваться оптикой микроскопа, позволяющей осуществлять эффективное диафрагмирование в фокальной плоскости объектива.
Расширение диапазона измеряемых времен корреляции в микросекундную область заставляет применять метод счета фотонов и требует разработки коррелятора - специального вычислительного устройства для измерения автокорреляционных функций последовательности импульсов [17:]. При этом использование операции привязки позволяет значительно упростить коррелятор и исследовать более быстрые процессы. В настоящей работе показано, что одноканальная привязка не искажает автокорреляционную функцию и уменьшает отношение сигнала к шуму только в (ЇЇ/2) раз [18:]. Поэтому обосновано применение коррелятора с одноканальной привязкой, специально разработанного для эксперимента по корреляции флуоресценции.
При ширинах каналов коррелятора (интервалов выборки), меньших 25 микросекунд, обосновывается применение двух ФЭУ с последовательным вычислением кросскорреляционной функции между двумя последовательностями импульсов, исходящих из обоих ФЭУ [19]. Это позволяет избавиться от искажений, вызванных собственными шумами ФЭУ, в частности, явлением после импульсов.
В работе изучены характеристики, однофотонного фотовыцветания множества красителей разных структур и выделены красители, удовлетворяющие требованию фотостабильности [19]. Показано, что для достижения отношения сигнала к шуму больше ста при интервале выборки 10 мкс и длительности измерения 1000 с, практически применимы красители с квантовым выходом фотовыцветания 10 [20]. При больших интенсивностях возбуждения в растворах разных красителей обнаружен и описан эффект появления быстрых зависящих от интенсивности возбуждающего света членов в автокорреляционной функции флуоресценции [20]. Поэтому следует применять такие интенсивности возбуждения, при которых этот эффект не искажает форму корреляционной функции.
Основными защищаемыми положениями диссертации являются следующие:
- При достижении высокого отношения сигнала к шуму флуоресцентная корреляционная спектроскопия является перспективным методом изучения кинетики химических реакций в многокомпонентных растворах красителей и макромолекул, а также фотофизических процессов обратимого выцветания молекул.
- Для достижения высокого отношения сигнала к шуму эксперимента по корреляции флуоресценции необходимо применять красители
- с низким квантовым выходом выцветания (меньшим 10 при обычных условиях эксперимента). Применимы оксазины, родамины и пиронины.
- Применение метода привязки в флуоресцентной корреляционной спектроскопии является обоснованным., Это позволяет разработать флуоресцентный корреляционный спектрометр, с помощью которого можно измерять автокорреляционные функции флуоресценции в широком диапазоне времен корреляции от 0,5 мкс до 10 с с отношением сигнала к шуму больше ст,а.
Диссертация состоит из введения, четырех основных разделов и заключения. Первый раздел представляет собой реферативный обзор литературных данных по теме диссертации. Вводятся необходимые понятия и описывается общая ситуация в рассматриваемой области. Описывается физическая сущность концентрационной корреляционной спектроскопии, выделены преимущества ФКС. Более детально рассмотрены теория формы сигнала в ФКС и проблема отношения сигнала к шуму. Приведены результаты флуоресцентных корреляционных экспериментов, полученных к настоящему времени другими исследовательскими группами.
Второй раздел содержит сведения о разработанных принципах конструирования флуоресцентного корреляционного спектрометра с большим отношением сигнала к шуму. Обосновано применение метода счета фотонов, обсуждено влияние операции привязки на точность измерений. Описана конструкция быстродействующего цифрового коррелятора с одноканальной привязкой, работающего в режиме реального времени. Рассмотрены проблемы оптимизации оптической части спектрометра .
В третьем разделе изучены возможности применения разных красителей в ФКС. Рассматривается роль фотофизических и фотохимических процессов выцветания. Описан обнаруженный в растворах разных красителей эффект появления быстрых зависящих от интенсивности возбуждения членов в автокорреляционной функции флуоресценции. Приведены и проанализированы результаты экспериментов по изучению поступательной диффузии красителей и. меченной красителем тРКК.
В четвертом разделе описаны и проанализированы результаты экспериментов по применению ФКС для исследования химического связывания красителей с полинуклеотидами. Проведено сравнение формы сигнала в описываемом эксперименте с другими экспериментами ФКС, определены отношения сигнала к шуму в проведенных экспериментах. В заключении сформулированы основные результаты работы.
По теме диссертации опубликовано семь работ [16-22]. Основные результаты работы доложены на 5-ой международной конференции по применению техники корреляции фотонов в механике жидкостей (ФРГ, г. Киль, 1982) [22], на 16-ом Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии (Болгария, г. София, 1983) [21], на конференции молодых ученых Института кибернетики (г. Таллин, 197 9), на конференциях в рамках дней физики в Тартуском государственном университете (г. Тарту, 1978, 1983:).
