Введение к работе
Актуальность темы
Гемостаз - это комплекс реакций организма, направленный на остановку кровотечений при повреждении сосудов. Важнейшими участниками гемостаза являются тромбоциты, специализированные клетки крови, способные к активации, качественному переходу в новое состояние, позволяющему им выполнять свои функции. Активированные тромбоциты выполняют в гемостазе две основные функции - механическое препятствование потере крови за счет прикрепления к стенке сосуда (адгезии) и скрепления друг с другом (агрегации) и предоставление своей отрицательно заряженной поверхности для генерации тромбина, основного фермента плазменного свертывания.
Уже более десяти лет назад началось активное изучение феномена гетерогенности активированных тромбоцитов, заключающегося в неодинаковости их свойств. Часть тромбоцитов при активации тромбином или тромбином с агонистом гликопротеина VI, коллагенового рецептора, экспрессирует большое количество фосфатидилсерина и удерживает на внешней стороне своей мембраны альфа-гранулярные белки (белковую «шубу»), такие как фибриноген, фактор Виллебранда, фибронектин, фактор V и тромбоспондин [Dale G.L. et al. 2002; Dale G.L. 2005]. Известно, что такие тромбоциты не связывают РАС-1, моноклональные антитела к активной форме главного рецептора агрегации, гликопротеина (GP) ПЫПа (интегрина аІІЬрЗ) [Dale G.L. et al. 2002; Dale G.L. 2005]. Это привело к предположению, что РАС-1-отрицательные тромбоциты не могут агрегировать. Считается, что такое их свойство может играть роль в регуляции роста тромба [Kulkarni S., Jackson S.P. 2004; Jobe S.M. et al. 2008]. Однако их агрегационная способность напрямую изучена не была.
В лаборатории физической биохимии крови Гематологического научного центра Министерства здравоохранения России аспирантом Н.Н. Топаловым недавно была обнаружена и охарактеризована еще одна субпопуляция активированных тромбоцитов (Topalov N.N. et al. Two types of procoagulant platelets are formed upon physiological activation and are controlled by integrin a(IIb)P(3), Arterioscler Thromb Vase Biol., 2012). Она образуется при активации тромбоцитов в физиологической концентрации помимо субпопуляций РАС-1-отрицательных и фосфатидилсерин-отрицательных («обычных» активированных) тромбоцитов. Как и РАС-1-отрицательные тромбоциты, тромбоциты новой субпопуляции экспрессируют большое количество фосфатидилсерина и удерживают на своей поверхности много фибриногена, однако, как и фосфатидилсерин-отрицательные тромбоциты, имеют низкую концентрацию внутриклеточного кальция и хорошо связывают РАС-1. Наличие интегринов аІІЬрЗ в активной конформации на поверхности тромбоцитов новой субпопуляции (фосфатидилсерин/РАС-1-положительных тромбоцитов) позволяет предположить, что эти тромбоциты агрегируют так же хорошо, как и фосфатидилсерин-отрицательные тромбоциты, однако агрегационная способность фосфатидилсерин/РАС-1-положительных тромбоцитов изучена не была.
Цель работы: исследование агрегапионной способности субпопуляций активированных тромбоцитов. Задачи исследования:
-
Определить способность тромбоцитарных субпопуляций участвовать в формировании агрегатов методами агрегометрии и проточной цитометрии.
-
Выявить механизмы, ответственные за агрегацию тромбоцитарных субпопуляций.
-
Исследовать распределение РАС-1-отрицательных тромбоцитов в тромбах с помощью конфокальной микроскопии.
Научная новизна. В работе обнаружено, что РАС-1-отрицательные тромбоциты участвуют в формировании агрегатов: они агрегируют с тромбоцитами других субпопуляций, имеющих на своей поверхности активную форму интегрина аІІЬрЗ, но не друг с другом. Выявлен механизм данного процесса: агрегация РАС-1-отрицательных тромбоцитов с фосфатидилсерин-отрицательными происходит за счет связывания активных интегринов аІІЬрЗ фосфатидилсерин-отрицательных тромбоцитов с лигандами, удерживаемыми на поверхности РАС-1-отрицательных тромбоцитов. Показано, что в условиях как венозного, так и артериального потока крови РАС-1-отрицательные тромбоциты преимущественно распределяются на поверхности тромбов, формирующихся на коллагене. Показано, что фосфатидилсерин/РАС-1 -положительные тромбоциты могут эффективно формировать агрегаты с тромбоцитами любых субпопуляций.
Научно-практическим значением результатов данной работы является вклад в понимание свойств субпопуляций активированных тромбоцитов и их (пато)физиологической роли. Результаты данной работы могут быть использованы для создания новых методов антитромботической терапии.
Положения, выносимые на защиту:
-
РАС-1-отрицательные тромбоциты обладают способностью связываться с фосфатидилсерин-отрицательными и фосфатидилсерин/РАС-1-положительными тромбоцитами, но не друг с другом.
-
Механизм агрегации РАС-1-отрицательных тромбоцитов с тромбоцитами двух других субпопуляций заключается в связывании активных интегринов аІІЬрЗ фосфатидилсерин-отрицательных и фосфатидилсерин/РАС-1-положительных тромбоцитов с лигандами, удерживаемыми на поверхности РАС-1-отрицательных тромбоцитов.
-
Фосфатидилсерин/РАС-1-положительные тромбоциты, в отличие от РАС-1-отрицательных и по аналогии с фосфатидилсерин-отрицательными тромбоцитами, могут эффективно формировать агрегаты с тромбоцитами любых субпопуляций.
4) РАС-1-отрицательные тромбоциты в тромбах, формирующихся на коллагене в
условиях венозного и артериального потока крови, преимущественно распределяются на их поверхности.
Апробация работы состоялась 1 февраля 2013 года на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.
Результаты диссертационной работы были представлены на International conference «54th Congress of the Gesellschaft fur Thrombose und Hamostaseforschung» (Нюрнберг, Германия, 24-27 февраля, 2010), 5-ой Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (Москва, Россия, 31 января - 2 февраля, 2011), XXIII Congress of International Society of Thrombosis and Hemostasis (Киото, Япония, 23-28 июля, 2011), 2-й Международной школе по проточной цитометрии (Москва, Россия, 26 - 31 августа, 2011), 58th Annual Meeting of the Scientific and Standardization Committee of the International Society of Thrombosis and Hemostasis (Ливерпуль, Англия, 27 - 30 июня, 2012), Gordon Research Conference on Hemostasis (Waterville Valley, США, 22-27 июля, 2012), 6-ой Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (Москва, Россия, 31 января - 2 февраля, 2013), VIII Симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, Россия, 1-3 февраля, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 публикаций. Статей в рецензируемых журналах - 2; публикаций в трудах конференций и съездов - 5.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 93 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов, главы 3 - описания экспериментальных результатов, главы 4 - обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 142 источника. Работа выполнена на базе Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией проф., д.ф.-м.н. Пантелеев М.А.).