Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов Топалов, Николай Николаевич

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Топалов, Николай Николаевич. Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.02 / Топалов Николай Николаевич; [Место защиты: Центр теоретич. проблем физико-хим. фармакологии РАН].- Москва, 2012.- 82 с.: ил. РГБ ОД, 61 12-3/937

Введение к работе

Актуальность темы

Тромбоциты - это безъядерные клетки крови, основной функцией которых является участие в свертывании крови, процессе, предотвращающем кровопотерю при повреждении кровеносного сосуда. Повреждение кровеносного сосуда приводит к активации каскада реакций плазменного гемостаза и тромбоцитов. Основные активаторы тромбоцитов это коллаген, обнажающийся при повреждении сосуда, тромбин, основной белок каскада плазменного гемостаза, АДФ и тромбаксан А2, секретируемые тромбоцитами в процессе активации. При активации тромбоцит может изменять форму, адгезировать к месту повреждения, агрегировать с другими тромбоцитами, секретировать различные вещества, формировать прокоагулянтную поверхность, содержащую фосфатидилсерин, и отделять микровезикулы.

Известно, что любая сильная активация тромбоцитов приводит к разделению тромбоцитов на две субпопуляции. Это так называемые укутанные и неукутанные тромбоциты. Поверхность укутанных тромбоцитов, в отличие от неукутанных, содержит фосфатидилсерин, такая поверхность необходима для существенного ускорения реакций плазменного звена системы гемостаза. Укутанные тромбоциты также характеризуются наличием альфа-гранулярных белков, связанных с поверхностью таких тромбоцитов, и дезактивацией интегрина aIIbp3a, основного трансмембранного белка, обеспечивающего агрегацию тромбоцитов.

Механизмы формирования субпопуляций активированных тромбоцитов изучены недостаточно хорошо. Известно, что различная активация ведет к формированию различного количества укутанных тромбоцитов, что говорит о том, что тромбоциты изначально являются гомогенной популяцией и разделяются на субпопуляции именно в процессе активации. Также было показано, что секреция АДФ, но не тромбаксана А2, регулирует формирование укутанных тромбоцитов. Также известно, что добавление кальциевого ионофора А23187 ведет к экспрессии фосфатидилсерина всеми тромбоцитами суспензии, что говорит о вероятной роли кальциевой сигнализации в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов.

В данной работе изучалась роль кальциевой сигнализации в формировании укутанных тромбоцитов. Была разработана методика детекции кальция в субпопуляциях тромбоцитов, произведен сравнительный анализ флуоресцентных красителей, чувствительных к концентрации кальция в цитоплазме тромбоцитов. Произведен анализ кинетики кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов при различной активации.

В большинстве работ, посвященных изучению субпопуляций активированных тромбоцитов, тромбоциты активировались в концентрации более чем на порядок ниже физиологической. Такой подход позволяет упростить экспериментальную модель, сведя к минимуму вклад секреции тромбоцитов и межклеточных взаимодействий. Таким образом, в данный момент существует необходимость детального изучения процессов, происходящих в тромбоцитах при их активации в физиологической концентрации, что, возможно, позволит прояснить ряд противоречий и выявить дополнительные механизмы, ведущие к экспрессии фосфатидилсерина при активации тромбоцитов.

Цель работы: Изучить свойства и механизмы формирования фосфатидилсерин- положительных тромбоцитов в физиологических концентрациях.

Задачи исследования:

  1. Подобрать оптимальный внутриклеточный Ca2+-флуорофор, подходящий для достоверной оценки изменений концентраций кальция, характерных для сильной активации тромбоцитов.

  2. Исследовать кальциевую сигнализацию в тромбоцитах при использовании различных активаторов.

  3. Исследовать зависимость кальциевой сигнализации и экспрессии фосфатидилсерина от концентрации активированных тромбоцитов.

  4. Выявить механизмы, регулирующие экспрессию фосфатидилсерина при активации тромбоцитов в физиологической концентрации.

Научная новизна. При активации тромбоцитов в физиологических концентрациях

(2^10 /мл-4*10 /мл) впервые выявлена гетерогенность среди ФС-положительных тромбоцитов. Помимо известной ранее ФС-положительной субпопуляции с устойчиво повышенной концентрацией внутриклеточного кальция, выявлена новая, также ФС- положительная субпопуляция с низкой концентрацией кальция, не превышающей уровня, характерного для неактивированных тромбоцитов. Для тромбоцитов новой ФС-положительной субпопуляции характерны высокие значения прямого и бокового светорассеяния, способность связывать фибриноген/фибрин и наличие активного интегрина aIIbp3a. Показано, что секреция тромбоцитов в процессе активации увеличивает количество тромбоцитов в обеих ФС-положительных субпопуляциях, но не влияет на соотношение между ними. Показано, что тромбоциты новой субпопуляции формируются в результате межклеточных взаимодействий с участием интегрина aIIbp3a. При снижении концентрации активируемых тромбоцитов ниже 5x10'/мл,

вновь выявленная вторая ФС-положительная субпопуляция не образуется.

Научно-практическое значение. Полученные результаты позволяют по-новому взглянуть на роль активации тромбоцитов в свертывании крови. Тромбоциты вновь открытой субпопуляции, сочетающие прокоагулянтные и агрегационные способности, представляются наиболее важными участниками свертывания крови. Полученные результаты по-новому раскрывают роль межклеточных взаимодействий в процессе

активации тромбоцитов. Также результаты, полученные в работе, дают новое представление о возможном дополнительном влиянии на гемостаз антагонистов интегрина aIIbp3a, использующихся в терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

    1. Концентрации кальция, наблюдаемые в тромбоцитах при сильной активации, находятся в пределах динамического диапазона флуоресцентного Са2+-флуорофора Fura Red. В отличие от Calcium Green-1, она может использоваться для исследования кальциевой сигнализации в субпопуляциях тромбоцитов крови.

    2. Экспрессия фосфатидилсерина укутанными тромбоцитами сопровождается продолжительным увеличением концентрации кальция в цитоплазме.

    3. При активации тромбоцитов в физиологических концентрациях формируется новая субпопуляция тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, которая характеризуется:

    а) низким уровнем внутриклеточного кальция

    б) более высоким сигналом прямого и бокового светорассеяния, чем у укутанных тромбоцитов

    в) поверхностью, покрытой фибриногеном

    г) наличием активированного интегрина aIIbp3, в отличие от ранее описанных укутанных тромбоцитов.

      1. Формирование этой субпопуляции прокоагулянтных тромбоцитов при физиологической концентрации обусловлено межклеточными взаимодействиями через интегрин aIIbp3 в процессе активации.

      Апробация работы. Работа прошла апробации: 26 марта 2012 года на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.

      Результаты диссертационной работы были представлены: 12-я международная школа-конференция "Биология наука XXI века" (Пущино, Россия, 10-14 ноября 2008), 36th FEBS Congress, (Турин, Италия, 25-30 июня 2011), XXIII Congress of the international society on thrombosis haemostasis (ISTH) (Киото, Япония, 23-28 июля 2011).

      Публикации. По материалы диссертационной работы опубликовано 6 научных работ. Статей в рецензируемых журналах - 1; публикаций в трудах конференций и съездов - 5

      Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 83 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов, главы 3 - описание экспериментальных результатов, главы 4 - обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 88 источников. Работа выполнена на базе Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный

      центр РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф., д.б.н. Атауллаханов Ф.И.) и Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией д.ф-м.н. Пантелеев М.А.).

      Похожие диссертации на Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов