Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1 Гемостаз 8
1.2 Тромбоциты 9
1.3 Субпопуляции активированных тромбоцитов 12
1.4 Мембранные реакции 19
1.5 Влияние температуры на свертывание крови 22
1.6 Трансглутаминазы
1.6.1 Общие сведения о трансглутаминазах 23
1.6.2 Фактор XIII 25
1.6.3 Тканевая трансглутаминаза 26
Постановка задачи 27
Глава 2. Материалы и методы 28
2.1 Материалы 28
2.1.1 Реагенты 28
2.2 Методы 29
2.2.1 Выделение отмытых тромбоцитов 30
2.2.2 Получение свободной от тромбоцитов плазмы 31
2.2.3 Титрование активных сайтов тромбина 31
2.2.4 Проточная цитометрия 32
2.2.5 Микроскопия 36
2.2.6 Планшетный спектрофотометр 37
2.3 Статистическая обработка данных 43
Глава 3. Результаты 44
3.1 Роль трансглутаминаз и полимеризации фибрина в формировании покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов 44
3.1.1 Изучение кинетики формирования двух субпопуляций тромбоцитов и распределения покрытия из фибриногена на их поверхности 44
3.1.1 Выявление механизмов формирования проагрегаторной активности прокоагулянтных тромбоцитов 46
3.2 Роль полимеризации фибрина в формировании покрытия из тромбоспондина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов 54
3.3 Роль трансглутаминаз в формировании прокоагулянтной активности активированных тромбоцитов
3.3.1 Разработка методов количественного измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов 57
3.3.2 Зависимость прокоагулянтной активности тромбоцитов от степени активации 69
3.3.3 Влияние тканевой трансглутаминазы на регуляцию прокоагулянтной активности тромбоцитов 70
Глава 4. Обсуждение 73
Выводы 80
Благодарности 81
Список литературы 82
Список сокращений и обозначений 88
- Субпопуляции активированных тромбоцитов
- Общие сведения о трансглутаминазах
- Получение свободной от тромбоцитов плазмы
- Выявление механизмов формирования проагрегаторной активности прокоагулянтных тромбоцитов
Субпопуляции активированных тромбоцитов
В течение многих лет исследователи предполагали, что свойства тромбоцитов при активации одинаковы, точнее, что различия между отдельными клетками не превышают обычных статистических разбросов. Только в конце 90-х годов начали появляться работы, свидетельствующие о появлении различия внутри популяций активированных тромбоцитов. [Feng P, Tracy P.B. 1998, Pasquet J.M. et al. 1998, Heemskerk J.W. et al. 1997, Patel D. et al. 2003]
Однако официальной точкой открытия нового подкласса тромбоцитов (“укутанные” тромбоциты) можно считать работу Альберто Л. и его команды в 2000 году [Alberio L. et al. 2000]. Они обнаружили, что при активации тромбоцитов тромбином с коллагеном выделяется субпопуляция клеток, экспрессирующих на свою поверхность большое количество -гранулярного фактора V. Такие тромбоциты были названы “COAT-FV” (коллаген и тромбин активированные тромбоциты с фактором V). Дальнейшие исследования показали, что эти тромбоциты экспрессируют на свою поверхность большое количество фосфотидилсерина. Кроме того, Альберто Л. с соавторами показали, что они способны связывать фактор Xа, т.е. эта субпопуляция клеток прокоагулянтна [Alberio L. et al. 2000]. В 2002 году Д.Дейл и коллеги показали, что COAT-FV тромбоциты не только экспрессируют на свою поверхность фактор V и фосфотидилсерин, но и удерживают на своей поверхности большое количество других -гранулярных белков. В результате чего им дали другое название «COAT» тромбоциты (т.е. тромбоциты, активированные коллагеном и тромбином), кроме того, это название отражает тот факт, что тромбоциты как бы “укутаны” в шубку из белков [Dale G.L. et al. 2002]. Однако одного четкого определения “укутанных” тромбоцитов не существует. Это связано с тем, что при активации тромбоцитов различными агонистами отделяющаяся субпопуляция не всегда имеет фиксированный набор свойств, отличающих ее от остальных тромбоцитов. Чаще всего “укутанными” тромбоцитами называют субпопуляцию клеток с большим количеством -гранулярных белков и фосфатидилсерина на поверхности, появляющуюся при сильной активации тромбоцитов (тромбином, конвульксином, тромбином с конвульксином). В литературе можно встретить и другие названия “укутанных” тромбоцитов – некротические тромбоциты [Jackson S.P., Schoenwaelder S.M. 2010], SCIP тромбоциты (тромбоциты, индуцированные повышенной концентрацией внутриклеточного кальция) [Kulkarni S., Jackson S.P. 2004], прокоагулянтные тромбоциты [Heemskerk, J. W. 2012]. В данной работе мы будем называть их прокоагулянтными тромбоцитами.
Механизмы внутриклеточной сигнализации, приводящие к разделению тромбоцитов на две субпопуляции, плохо изучены. Предположение, что тромбоциты до активации принадлежат к той или иной субпопуляции, не находит подтверждения, так как количество образующихся прокоагулянтных тромбоцитов можно менять, варьируя активаторы и их концентрацию [Kempton C.L. et al. 2005]. Было показано, что в формировании прокоагулянтных тромбоцитов играет роль гамма-цепь Fc-рецептора (FcR), сопряженная с гликопротеином VI [Jobe S.M. et al. 2005]. Также митохондриальная пора (MPTP), по-видимому, является важным участником в формировании прокоагулянтных тромбоцитов, так как эффекторы образования MPTP регулируют появление прокоагулянтных тромбоцитов [Jobe S.M. et al. 2008]. Последнее обстоятельство и экспрессия прокоагулянтными тромбоцитами фосфатидилсерина привели к активному обсуждению в литературе возможной связи формирования прокоагулянтных тромбоцитов с процессами клеточной гибели, апоптозом и некрозом [Jackson S.P., Schoenwaelder S.M. 2010]. Было также показано, что прокоагулянтные тромбоциты характеризуются повышением концентрации внутриклеточного кальция [Topalov N.N. et al. 2012].
Дальнейшие исследования показали, что активация тромбоцитов тромбином в сочетании с конвульксином приводила к образованию субпопуляции тромбоцитов с высоким уровнем связывания на поверхности не только -гранулярных белков, но также факторов VIII, IX, X [Kempton C.L. et al. 2005]. Кроме того, было показано, что доля данной группы тромбоцитов дозо-зависимо увеличивается от повышения концентрации конвульксина при двойной активации тромбином с конвульксином. Также обнаружили, что процент тромбоцитов, которые выставляли фосфатидилсерин, измеренный связыванием аннексина V, коррелировал с процентным содержанием тромбоцитов с увеличенным связыванием коагуляционных факторов. Более того было показано, что эта субпопуляция тромбоцитов появляется как раз в тот момент, когда генерация тромбина и фактора Xa комплексами протромбиназы и внутренней теназы, соответственно, достигает своего максимума [Kempton C.L. et al. 2005].
Пантелеев М.А. с коллегами в своей работе показал, что при активации тромбоцитов тромбином образуются две субпопуляции и их отношение зависит от концентрации тромбина. Они также продемонстрировали, что одна из этих субпопуляций имеет высоко связующую способность для коагуляционных факторов (фактор IXa, фактор VIII и фактор X) и что эта та же самая субпопуляция, которая имеет высокий уровень фосфатидилсерина на своей поверхности. [Panteleev M.A. et al. 2005]
Также было обнаружено, что при активации тромбоцитов тромбином или PAR1-активирующем пептидом (SFLLRN) образуется субпопуляция тромбоцитов с высоким уровнем фосфатидилсерина, которая еще была способна связывать фактор IXa. Кроме того, с увеличением концентрации активатора процент этой субпопуляции доза-зависимо увеличивался. Более того было показано, что увеличение концентрации активатора также ведет к увеличению концентрации фактора Xa, активированного комплексом внутренней теназы [London F. S. et al. 2004]
Таким образом можно заключить, что прокоагулянтные тромбоциты способны удерживать на своей поверхности не только белки -гранул, но и белки свертывания крови: факторы VIII, VIIIа, IX, IX [Kempton C.L. et al. 2005; Panteleev M.A. et al. 2005; London F. S. et al. 2004]. Кроме того, рядом ученых было показано, что именно на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов происходят основные реакции плазменного звена системы свертывания крови [London F. S. et al. 2004; Kempton C.L. et al. 2005]. Одна из этих реакций состоит в активации фактора X, присутствующего в крови в виде неактивного предшественника. Эта реакция катализируется связанными с мембраной прокоагулянтного тромбоцита факторами VIIIa и IXa. Другая реакция катализирует превращение протромбина в тромбин, она ускоряется благодаря формированию комплекса факторами Va и Xa и также происходит на поверхности прокоагулянтного тромбоцита (Подробнее эти реакции будут рассмотрены в п. 1.4).
Общие сведения о трансглутаминазах
В работе была использована кровь здоровых доноров, у которых не было болезней свертывания крови. Кровь забирали на Станции переливания крови (СПК) Гематологического научного центра Министерства здравоохранения России.
Кроме того, в ряде экспериментов была использована кровь пациентов с генетическими заболеваниями, такими как дисфибриногенемия и дефицит ФXIII. Пациент с дисфибриногенемией имел гомозиготную фибриногеновую МЕТЦ мутацию (p.Argl6Cys) в цепи Аа, которая предотвращала отщепление фибринопептида А, таким образом формирование фибринового сгустка не наблюдалось, хотя отщепление фибринопептида В было в норме. Тромбоциты агрегировали нормально. Пациент страдал от тяжелого кровотечения и была история переливания фибриногена (последнее было 2 года назад до нашего исследования). Пациент с тяжелой формой ФXIII дефицита (FXIII 1%) имел гомозиготную вставку T866 в экзоне 6 (p.Pro255SerfsX16).
Для получения отмытых тромбоцитов, в день проведения эксперимента, кровь здоровых доноров заготавливалась на 3.8 % цитратном буфере (для предотвращения свертывания крови) в соотношение кровь: цитрат - 9:1. Чтобы предотвратить преждевременную активацию тромбоцитов добавлялись простагландин E1 (1мМ) и апираза (0,1 единиц активности/мл). Кровь центрифугировалась при комнатной температуре при 100g в течение 8 минут. Затем отбиралась богатая тромбоцитами плазма, в которую, чтобы предотвратить агрегацию клеток, добавлялся цитратный буфер в соотношении плазма: цитрат – 3:1. Далее богатая тромбоцитами плазма центрифугировалась при 400g в течение 5 минут при комнатной температуре. После чего плазма отбиралась, а осажденные тромбоциты ресуспензировались 300 мкл буфера А. Для окончательного отделения тромбоцитов от белков плазмы крови суспензия очищалась на гель-хроматографической колонке (LKB, Швеция) (высота ширина = 6 см 1 см, скорость прокачки = 0,5 мл/мин) (рис. 9), упакованной сефарозой CL-2B (Sigma, St. Louis, MO, США) (высота геля = 4,5 см) и уравновешенной буфером А [Panteleev M.A. et al. 2005].
Качество отделения тромбоцитов от плазменных белков проверялось методом агрегометрии, а именно отсутствием агрегации гель-фильтрованных тромбоцитов в ответ на добавление к ним ристоцетина [Weiss H.J. et al. 1973; Козинец Г.И., Макаров В.А. 1998]. Известно, что ристоцетин не вызывает активацию тромбоцитов, однако он инициирует связывание фактора Виллебранда с гликопротеином Ib-V-IX тромбоцитов, приводящее к их агрегации (для процесса такой пассивной агрегации, не связанной с активацией тромбоцитов, иногда используют термин «агглютинация»). Тромбоциты в процессе гель-фильтрации отделяются от плазменного фактора Виллебранда, следовательно, при качественном их выделении добавление ристоцетина в суспензию не вызывает никаких тромбоцитарных ответов, что и регистрируется агрегометром.
Свободную от тромбоцитов плазму получали из крови здоровых доноров, заготовленной на 3.8 % цитратном буфере, соотношение кровь: цитрат составляет 9:1. Кровь центрифугировалась при комнатной температуре при 1600g в течение 15 минут для отделения основной части клеток от плазмы. Далее супернатант отбирался и центрифугировался ещё 5 мин при комнатной температуре при 10.000g. В результате чего получали свободную от тромбоцитов плазму. При этом концентрация тромбоцитов в ней не превышала 106 клеток/литр.
Фирменный раствор тромбина (Haematologic Technologies, Essex Junction, VT, США) разводился буфером А до теоретически рассчитанной концентрации равной 5000 нМ.
Для анализа активных сайтов тромбина (вычисления истинной концентрации тромбина в растворе) использовали следующую схему эксперимента. PPACK (необратимый ингибитор тромбина) разводился до следующих концентраций: 30,15,7.5,3.25,0 нМ и разливался по 50 мкл в планшет, затем добавлялось по 50 мкл тромбина в концентрации 30 нМ, после чего производилась инкубация смеси в течение 10 минут. Далее в каждую лунку планшета добавлялось по 100 мкл хромогенного субстрата (Chromozym ТН) для тромбина в конечной концентрации 0.3 мМ. Измерение изменения оптической плотности раствора проводили на планшетном спектрофотометре Thermomax (Molecular Devices, США) на длине волны 405 нм при 37С в течение 10 мин.
Остаточная активность тромбина определялась по скорости гидролиза хромогенного субстрата. Дальнейший анализ проводился в программе OriginPro 7.5, где по полученным данным строились графики изменения оптической плотности во времени, после чего находилась скорость расщепления субстрата в начальный момент времени. Затем строилась кривая зависимости скорости расщепления субстрата в начальный момент времени от концентрации РРАСК. Далее проводилась линейная аппроксимация и находилась концентрация, при которой скорость расщепления равна нулю. Зная данную концентрацию (А), степень ингибирования (В) тромбина РРАСК и степень разведения (С) тромбина от теоретически рассчитанной концентрации 5000нМ, вычислялась экспериментальная концентрация раствора тромбина по формуле (1).
В основе метода проточной цитометрии лежит измерение параметров одиночной клетки. Суспензию предварительно окрашенных флуоресцентными красителями клеток (как правило, в роли красителей выступают моноклональные антитела, конъюгированные с флуоресцентными метками) под давлением прогоняют через капилляр. Клетки, подхваченные потоком жидкости, выстраиваются друг за другом в цепочку благодаря принципу гидродинамического фокусирования (рис. 10), в соответствии с которым создаются условия ламинарного потока без перемешивания суспензии клеток с обволакивающей жидкостью.
Получение свободной от тромбоцитов плазмы
Тромбоциты в концентрации 50тыс/мкл активировались кальциевым ионофором в концентрации 5мкМ в присутствии 2,5 мМ CaCl2. Тромбоциты и активатор доводились до нужной концентрации буфером А. Активация тромбоцитов производилась 10 минут при комнатной температуре.
Далее на поверхности активированных тромбоцитов собирался комплекс протромбиназы - смесь общим объемом 30 мкл со следующими концентрациями компонентов: активированные тромбоциты –5 тыс/мкл (далее будет показано, что при данной концентрации метод работает линейно), CaCl2 – 2.5 мМ, фактор Xа – 10 нМ, фактор II – 1,4 мкМ (6). Вышеуказанная смесь состояла из двух подсмесей: смесь 1 -объем смеси 20 мкл, состав: активированные тромбоциты, CaCl2; смесь 2 - объем смеси 10 мкл, состав: фактор Xa, фактор II. Концентрации подсмесей рассчитывались с учётом (6). Доведение до нужной концентрации производили буфером А.
Фактор II активировался этим комплексом в течение 5 минут при температуре 37С. Затем эту реакцию останавливали путем добавления 270 мкл 5.6 мМ EDTA. После чего 20 мкл этой смеси переносилось в новые лунки планшета многоканальной пипеткой и далее для измерения количества наработанного фактора IIa добавлялось 180 мкл хромогенного субстрата CTH такой концентрации, чтобы в рабочем растворе (200 мкл) его концентрация была 0.3 мМ.
С помощью планшетного спектрофотометра Thermomax (Molecular Devices, США) определялось изменение светопропускания при расщеплении субстрата (CTH) активированным фактором II от времени в течение 30 минут с интервалом 6 сек на длине волны 405 нм при температуре 37С. Дальнейший анализ проводился в программе OriginPro 7.5 аналогично методу, описанному в п. 2.2.5.1
Для этого в каждый образец добавлялось по 20 мкл смеси из факторов: IXа-0.2 нМ, VIIIa- 40 нМ и X- 800нМ (концентрации IXа, VIIIa, X рассчитывались с учетом (7)).
Фактор VIII предварительно был активирован 1нМ тромбина в течение 1 мин, после чего был добавлен PPACK 2 мкМ для инактивации тромбина.
Окончательная концентрация компонентов в 40 мкл: CaCl2 – 2.5 мМ, фактор VIIIа – 20 нМ, фактор IXa – 0.1 нМ, фактор X – 400 нМ (7).
Далее происходила активация фактора X комплексом внутренней теназы в течение 4 минут, при 37 С в режиме перемешивания.
Затем реакцию активации фактора X останавливали путем добавления 40 мкл 20 мМ EDTA. После чего 60 мкл этой смеси переносилось в новые лунки планшета многоканальной пипеткой и далее для измерения количества наработанного фактора X добавлялось 140 мкл хромогенного субстрата S2765 такой концентрации, чтобы в рабочем растворе (200 мкл) его концентрация была 0.4 мМ.
С помощью планшетного спектрофотометра Thermomax (Molecular Devices, США) определялось изменение светопропускания при расщеплении субстрата (S2765) активированным фактором X от времени в течение 30 минут с интервалом 6 сек на длине волны 405 нм при температуре 37С. Дальнейший анализ проводился в программе OriginPro 7.5
Сборка комплекса протромбиназы Для выяснения роли пленок с фибробластами/тканевым фактором в сборке протромбиназы брали 5 образцов по 20 мкл (концентрации CaCl2 и фосфолипидов рассчитывались с учетом (8)): Для этого в каждый образец добавлялось по 10 мкл смеси из факторов: Va - 6 нМ, Xa – 30 нМ, II-4.2 мкМ (концентрации IXа, VIIIa, X рассчитывались с учетом (8)). Фактор V предварительно был активирован до концентрации 100 нМ : путем инкубации V (120 нМ) в течение 50 мин c RVV-V(10 нМ) при комнатной температуре. Окончательная концентрация компонентов в 30 мкл : CaCl2 – 2.5 мМ, фактор Vа – 2 нМ, фактор Xa – 10 нМ, фактор II – 1.4 мкМ (8). Далее происходила активация фактора II комплексом протромбиназы в течение 5 минут, при 37 С в режиме перемешивания.
Затем реакцию активации фактора II останавливали путем добавления 270 мкл 5.6 мМ EDTA. После чего 20 мкл этой смеси переносилось в новые лунки планшета многоканальной пипеткой и далее для измерения количества наработанного фактора IIa добавлялось 180 мкл хромогенного субстрата CTH такой концентрации, чтобы в рабочем растворе (200 мкл) его концентрация была 0.3 мМ.
С помощью планшетного спектрофотометра Thermomax (Molecular Devices, США) определялось изменение светопропускания при расщеплении субстрата (CTH) активированным фактором II от времени в течение 30 минут с интервалом 6 сек на длине волны 405 нм при температуре 37С. Дальнейший анализ проводился в программе OriginPro 7.5
Метод измерения прокоагулянтной активности трмбоцитов по влиянию их на свертывание плазмы
Для активации тромбоцитов в 96-луночном планшете готовились по 5 мкл активационной смеси в необходимом количестве лунок. Активационные смеси содержали вещества-активаторы, доведенные до нужной концентрации буфером A. Далее в каждую лунку с активатором добавлялись по 5 мкл тромбоцитов, разбавленных до нужной концентрации буфером А содержащим CaCl2. Концентрации в суспензиях после добавления активационной смеси были: 100 тыс/мкл тромбоцитов, 2,5 мМ CaCl2. Тромбоциты активировались 15 минут. Для активации тромбоцитов использовался конвульксин в концентрациях 10нг/мл и 100 нг/мл.
Далее, для того чтобы наблюдать изменение прокоагулянтной активности тромбоцитов в зависимости от активатора, в суспензию активированных тромбоцитов добавлялось по 90 мкл свободной от тромбоцитов плазмы содержащей CaCl2 такой концентрации, чтобы в рабочем растворе (100 мкл) его концентрация была 20 мМ.
После этого с помощью планшетного спектрофотометра в течение 1,5 часов с интервалом 6 сек на длине волны 405 нм при температуре 37С регистрировалось изменение оптической плотности при сворачивании плазмы. По полученным данным находилось время, за которое плазма сворачивается наполовину, т.е. когда оптическая плотность достигает половины от максимального значения.
Выявление механизмов формирования проагрегаторной активности прокоагулянтных тромбоцитов
Центральной задачей данной работы являлось исследование механизмов формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. В данной работе впервые было показано, что фибрин(оген) удерживается на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов посредством тромбин-индуцированной полимеризации фибрина, кроме того тканевая трансглутаминаза также способна пришивать фибриноген к их поверхности. Тем самым, мы показали, что агрегационная активность прокоагулянтных тромбоцитов формируется за счет полимеризации фибрина, а также трансглутаминазной реакции. Было показано, что добавление тканевой трансглутаминазы при активации тромбоцитов или после нее не меняет их прокоагулянтную активность, количество прокоагулянтных тромбоцитов при этом также остается неизменным. Для этого было разработано два метода количественного измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов, основанных на сборке ферментативных комплексов на поверхности активированных тромбоцитов.
Несмотря на то, что прокоагулянтные тромбоциты были открыты более 10 лет назад, [Alberio L. et al. 2000; Dale G.L. et al. 2002] механизмы формирования и удерживания покрытия из белков на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, как и его функция, до сих пор слабо изучены.
В недавних исследованиях Якименко А.О. со своими коллегами пердположили возможный механизм вовлечения прокоагулянтных тромбоцитов в агрегаты [Yakimenko, A. O. et al. 2012], несмотря на отсутствие на их поверхности активной формы интегрина IIb [Dale G.L. et al. 2002, Mattheij N.J. et al. 2013]. А именно, что прокоагулянтные тромбоциты вовлекаются в агрегаты за счет связывания активированными рецепторами GPIIbIIIa на непрокоагулянтных тромбоцитах свободных концов молекул фибриногена прокоагулянтных тромбоцитов в составе их белкового покрытия. В данной работе мы напрямую показали, что для вовлечения прокоагулянтых тромбоцитов в агрегаты необходима активная форма GPIIbIIIa на поверхности непрокоагулянтных тромбоцитов. Кроме того, прокоагулнятные тромбоциты не способны вовлекаться в агрегаты в отсутствии покрытия из фибриногена на их поверхности, однако они не способны агрегировать друг с другом за счет полимеризации фибрина (данные получены сотрудником ФНКЦ ДГОИ им. Д. Рогачева Якименко А.О.). В связи с этим изучение механизмов формирования белкового покрытия становится чрезвычайно важным. Кроме того, тот факт, что фибриноген на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов локализуется в виде единичной “шапки” (данные получены аспирантом ЦТП ФХФ РАН Обыденным С. И.), а не как предполагалось ранее в виде “шубы” или отдельных островков, как это было показано для непрокоагулянтных тромбоцитов ранее [Peerschke E. I. 1995], вызывает дополнительный интерес к изучению механизмов формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов.
Одним из главных механизмов формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов предполагалась трансглутаминазная реакция, т.к. в работе Д.Дейла и др. было показано, что добавление дансилкадаверина-конкурирующего амино-донора для трансглутаминаз, а также специфических антител к фактору XIIIa доз зависимо снижает количество -гранулярных белков на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов [Dale G.L. et al. 2002]. Однако у мышей дефицитных по фактору XIII белковое покрытие формировалось нормально [Jobe S.M. et al. 2005]. Это заставляло задуматься о наличие дополнительных механизмов. Таким механизмом могла бы быть полимеризация фибрина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов [Munnix I.C. et al. 2009]. В пользу существования этого механизма свидетельствует то, что стимуляция тромбоцитов без тромбина (агонистом гликопротеина VI-конвульксином или PAR-1-рецептора-SFLLRN) приводит к формированию прокоагулянтных тромбоцитов без белкового покрытия. Однако, серьезно этот механизм никем не изучался.
В данной работе мы проверили оба этих возможных механизма. Наши результаты показали, что добавление ингибитора полимеризации фибрина GPRP в 5,5 раз уменьшает количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов при их активации тромбином и в 2,6 раз при их активации тромбином с CRP. Кроме того, стимуляция тромбоцитов CRP без тромбина, в присутствии анцистрона - протеазы, сворачивающей фибриноген, в 4 раза увеличивает количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Помимо этого, в экспериментах с тромбоцитами пациента с нарушением полимеризации фибрина (дисфибриногенемией) было показано, что количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов снижено почти в 5 раз при стимуляции тромбоцитов тромбином и в 8 раз при их стимуляции тромбином с CRP по сравнению со здоровыми донорами. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что механизм полимеризации фибрина играет важную роль в формировании белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов.
Однако это не исключает возможность существования дополнительных механизмов. В согласии с данными Джоба С.М. [Jobe S.M. et al. 2005] было показано, что фибриногеновое покрытие на поверхности прокоагулянтых тромбоцитов у пациентов с дефицитом ФXIII формируется нормально. В своем исследовании Джоб С.М. предположил, что в случает дефицита ФXIII возрастает роль другой трансглутаминазы – TTГ. В нашей работе было показано, что добавление пан-трансглутаминазного ингибитора - T101 не приводит к значимому уменьшению количества фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Однако, при добавлении ТТГ при активации тромбоцитов CRP, количество фибриногена на их поверхности возрастает в 3 раз. Откуда можно сделать вывод, что транглутаминазы действительно способны пришивать фибриноген к поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, однако этот механизм по всей видимости не является ключевым.
Кроме того, было показано, что формирование покрытия из тромбоспондина, также индуцируется анцистром при стимуляции тромбоцитов CRP в отсутствии тромбина (данные получены сотрудником ЦТП ФХФ РАН ЯН. Котовой). Поэтому несмотря на то, что ингибитор полимеризации фибрина GPRP не ингибирует формирование покрытия из тромбоспондина, основываясь на предыдущих данных по встраиванию тромбоспондина в фибриновый сгусток [Bale М. D. et al. 1995], формирование фибрина важно для удержания тромбоспондина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов.
Подытоживая полученные данные, можно заключить, что полимеризация фибрина является наиболее значимым механизмом формирования покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов в то время как механизм, обусловленный трансглутаминазной реакцией, представляется второстепенным. Кроме того, механизм полимеризации фибрина является по всей видимости одним из механизмов удержания других белков а-гранул на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Однако, возможно, что роль трансглутаминазной реакции может увеличиться in vivo, где секреции тромбоцитов является более значимой в связи с увеличением локальной концентрации тромбоцитов в пределах тромба.
Как уже обсуждалось выше, Д.Дейлом [Dale G.L. et al. 2002] показано, что трансглутаминазы влияют на формирование белкового покрытия у прокоагулянтных тромбоцитов. Также, рядом ученых было показано, что на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов помимо белков -гранул удерживаются такие белки как факторы VIII, Villа, IX, IXа [Kempton C.L. et al. 2005; Panteleev M.A. et al. 2005; London F. S. et al. 2004]. И именно на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов происходят основные реакции плазменного звена системы свертывания крови, такие как сборка комплекса протромбиназы и внутренней теназы. Поэтому, встал вопрос о влиянии трансглутаминаз на формирование прокоагулянтной активности тромбоцитов. Однако прежде чем изучать данный вопрос, необходимо было разработать метод, с помощью которого это стало бы возможным.
