Введение к работе
Актуальность проблемы.
Клинико-биохимические анализы относятся к числу самых распространенных методов используемых для диагностики заболеваний человека. Такого рода исследования, как известно, включают общие анализы крови и мочи, изучение состава рада других биологических жидкостей организма. Общим недостатком существующих методов качественного и количественного анализа нативных биологических жидкостей является необходимость их предварительного фракционирования. До недавнего времени эти анализы проводились с помощью химических методов, но, в связи с токсичностью многих из них, низкой чувствительностью и другими недостатками, широкое распространение на сегодняшний день получили энзимологические методы, когда используется «свободный» фермент. Однако, наряду с явными преимуществами такого подхода, есть и ряд недостатков: неоднозначность анализа в присутствии других, агрессивных к ферменту высокомолекулярных соединений, в частности, протеаз и других внутриклеточных компонентов, одноразовое использование фермента и тд. Таким образом, появляется необходимость защитить фермент-сенсор от неблагоприятного воздействия, сохранив при этом к нему доступ субстрата, увеличить его стабильность при длительном хранении, а также разработать возможность многократного использования фермента. Одним из видов такой защиты нам представляется инкапсулирование ферментов в полиэлектролитные микрокапсулы (ПМК).
Такие ПМК относятся к изделиям новой области полимерной нанотехнологии. В настоящее время это направление бурно развивается во всем мире: в США, странах Евросоюза, Китае, Австралии; растет число научных лабораторий, исследующих эти объекты; появляются первые фирмы, выпускающие коммерческие изделия. При этом наряду с чисто фундаментальными исследованиями структуры, физико-химических и биологических свойств полиэлектролитных микрокапсул, все больший акцент делается на прикладные исследования, направленные на практическое использование ПМК, в частности, в медицине, химической технологии, биотехнологии, экологии и многих других областях. Сочетание уникальных
свойств и сравнительно простая технология получения широкого спектра ПМК с заданными параметрами (структурными, механическими, функциональными), легкость включения в них самых разнообразных веществ, как низко-, так и высокомолекулярных, в том числе лекарственных препаратов, а также возможность управления проницаемостью оболочек ПМК, делает перспективным их использование в качестве средств адресной доставки лекарственных препаратов к органам и тканям, пролонгированного и терапевтического эффекта, в качестве микрореакторов, микроконтейнеров и т.п.
ПМК, содержащие инкапсулированный фермент, можно использовать как микродиагностикум, способный распознавать и количественно определять низкомолекулярные вещества как в нативных биологических жидкостях, так и в сточных водах, если они являются субстратом, ингибитором или активатором инкапсулированного фермента.
Цель исследования - разработка методологии получения высоко функциональных полиэлектролитных фермент-содержащих микрокапсул и создание на их основе нового класса клинико-биохимических методов анализа -микродиагностикумов.
Задачи работы.
Изучение влияния полиэлектролитов (ПЭ) (полианионов и поликатионов) на каталитические и структурные характеристики ферментов -лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и уреазы.
Исследование каталитических характеристик ферментов, заключенных в микрокапсулы с полиэлектролитными оболочками разного состава.
Изучение влияния моно- и дивалентных солей на свойства полиэлектролит-белковых комплексов. Выбор состава среды, увеличивающего активность инкапсулированных ферментов.
Изучение свойств полиэлектролитного ферментного микродиагностикума: стабильности при длительном хранении, к разрушению протеазами и возможности многократного использования.
Научная новизна работы. Впервые выявлены структурно-
функциональные особенности белков, обуславливающие разрушающее действие на них полиэлектролитов. Разработан и запатентован не имеющий прямых аналогов клинико-биохимический метод анализа - полиэлектролитный ферментный микродиагностикум.
Практическая значимость. Данная работа позволит решить основные проблемы существующих в настоящий момент биохимических анализов, а именно, даст возможность проводить исследования непосредственно в биологических жидкостях без их предварительного фракционирования. А также значительно удешевит проведение анализа за счет увеличения стабильности фермента-сенсора при его хранении и возможности многократного использования.
Кроме того, результаты анализа механизма полиэлектролит-белковых взаимодействий полезны для понимания роли полиэлектролитов в регуляции внутриклеточных метаболических процессов, для выявления условий токсичности полиэлектролитов (ПЭ) и соответственно для выбора нетоксичных полиэлектролитов для приготовления капсулированных фармакологических лекарственных средств.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на отечественных и международных конференциях: «Ломоносов 2006». (Москва, 2006. Секция «биоинженерии и биоинформатики»), «Ломоносов 2006». (Москва, 2006. Секция «Биология»), «Structural chemistry of partially ordered systems, nanoparticles and nanocomposites», (St-Peterburg, 2006), «Биология наука 21 века» (Пущино, Московская обл. 2006), «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем». (Иваново, 2006, 2007), «Современные проблемы науки о полимерах» (С-Пстербург, 2007), «Биология - наука XXI века» (Пущино, Московская обл. 2007), «Математика компьютер образование» (Дубна, Московская обл., 2008, Пущино 2009).
По материалам диссертации опубликовано 22 печатных работ, в том числе 6 статей и 2 патента.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из
введения, обзора литературы, описания материалов и методов, обсуждения
результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах,
содержит ;3 .таблицы и &J) рисунка.
