Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современник представления о механизме реакций ферментативного декарбокжлирования пяроштоградной кислоты
1.1. Общая характеристика тиаминзависимых реакций 12
1.2. Механизм реакции декарбоксилирования пирови-ноградной кислоты: классическая схема 14
1.3. Физико-химические характеристики тиамина 19
1.4. Взаимодействие тиаминпирофоефата с ионами металлов 22
1.5. Роль свободнорадикаяьных реакций и процессов переноса электрона в механизме тиаминового катализа 26
Глава 2. Шзико-химичвше характеристики пирошноградной кислоты - субстрата пируватдекарбоксилазы
2.1. Структура и спектральные свойства пировиноградной кислоты в органических растворителях 29
2.2. Структура пировиноградной кислоты в водных растворах. Обратимая гидратация пировиноградной кислоты 31
2.3. Фотохимическое декарбоксилирование пировиноградной кислоты 33
Глава 3. Шзико-химические характеристики пируватдекарбоксилазы
3.1. Общие свойства и структура пируватдекарбоксилазы 37
3.2. Регуляция каталитической активности пируватде-карбоксилазы 39
3.3. Взаимодействие пируватдекарбоксилазы с кофак-торами, субстратом и продуктом реакции - ацетальдегидом 41
Глава 4 Матешалы исследования, методы и техника эксперимента
4.1. Объекты исследования 47
4.2. Выделение пируватдекарбоксилазы из пивных дрожжей 48
4.3. Приборы и техника эксперимента 51
4.4. Химическая модификация белков 53
4.5. Фотохимические превращения пирошноградной кислоты 55
Глава 5. Шзико-химйчшкйе свойства пйровшогрдпдой кислоты
5.1. Спектрально-люминесцентные свойства пирошноградной кислоты в органических растворителях и их связь со структурой молекулы 58
5.2. Состояние и люминесцентные свойства пирошноградной кислоты в водных растворах 67
Глава 6. Декарбоксилирование пирошноградной кислоты
6.1. Механизм фотодекарбоксилирования пирошноградной кислоты в водных растворах 77
6.2. Влияние тиамина на фотодекарбоксилирование пирошноградной кислоты 86
6.3. Окислительное декарбоксилирование пирошноградной кислоты в фотохимической и ферментативной реакциях 89
Глава 7. Некоторые шзико-химические характеристики пируватдекарбоксилазы
7.1. Флуоресценция пируватдекарбоксилазы. рН - индуцируемые конформационные перестройки молекулы фермента 97
7.2. Взаимодействие пируватдекарбоксилазы с субстратом и ионами металлов 102
7.3. Взаимодействие тиаминпирофосфата с ионами металлов 109
7.4. Некоторые регуляторные свойства пируватдекарбоксилазы 120
7.5. Влияние температуры на скорость реакции, катализируемой пируватдекарбоксилазой. Роль внутриглобулярной подвижности 128
Глава 8. Взаимодействие пируватдекарбоксилазы с ацетальдегидом
8.1. Необратимое ингибирование пируватдекарбоксилазы продуктом реакции - ацетальдегидом 132
8.2. Механизм взаимодействия ацетальдегида с белком 135
8.3. Изучение взаимодействия карбонилсодержащих соединений с белком методом флуоресцентной метки 139
Выводы 153
Литература 155
- Механизм реакции декарбоксилирования пирови-ноградной кислоты: классическая схема
- Структура пировиноградной кислоты в водных растворах. Обратимая гидратация пировиноградной кислоты
- Взаимодействие пируватдекарбоксилазы с кофак-торами, субстратом и продуктом реакции - ацетальдегидом
- Состояние и люминесцентные свойства пирошноградной кислоты в водных растворах
Введение к работе
Ферменты, содержащие в качестве необходимого кофактора тиаминпирофосфат и контролирующие отдельные реакции углеводного обмена и цикла трикарбоновых кислот, занимают одно из центральных мест в метаболизме клетки. Важнейшей реакцией, катализируемой тиаминовыми ферментами, является декарбоксилирование пировиноградной кислоты, которая выступает в клетке связующим звеном в превращениях углеводов, жиров и аминокислот. Декарбоксилирование пировиноградной кислоты может протекать не только в ферментативных реакциях, но и неферментативно.
Под действием ультрафиолетового излучения она эффективно декарбоксилируется, образуя те же продукты, что и при ферментативном декарбоксилировании. Ферментативный и фотохимический процессы связаны с разрывом одной и той же связи в молекуле пировиноградной кислоты. Несмотря на значительное количество работ, посвященных данному вопросу, единая схема, описывающая фотохимическое декарбоксилирование пировиноградной кислоты, отсутствует.
Одним из тиаминовых ферментов, катализирующих необратимое декарбоксилирование пировиноградной кислоты, является пируват-декарбоксилаза / Ш 4.1.1.1 /, выделяемая из пивных дрожжей. Изучение этого фермента позволяет проследить основные закономерности тиаминового катализа.
Структурные, функциональные и регуляторные свойства многих тиаминзависимых ферментов плодотворно исследуются в течение длительного времени. Общие черты механизма тиаминового катализа известны более четверти века. Вместе с тем, многие детали декар-боксидирования пировиноградной кислоты как в ферментативных, так и в неэнзиматических модельных реакциях требуют своего уточнения.
Формулирование общих положений теории ферментативного катализа возможно лишь на основании результатов работ, посвященных выяснению особенностей и закономерностей функционирования многочисленных индивидуальных ферментов, а также на основании исследования конгруэнтных модельных реакций. Установление закономерностей ферментативного катализа требует знания химизма превращений субстрата и кофермента в ходе ферментативной реакции, дополненного исследованием структурных перестроек молекулы белка. В соответствии с этим настоящая работа касалась свойств самого фермента - пируватдекарбокеилазы и свойств ее субстрата и кофермента.
Целью работы было изучение закономерностей ферментативного, катализируемого пируватдекарбоксилазой, и фотохимического декарбоксилирования пировиноградной кислоты. Параллельное рассмотрение ферментативного и фотохимического процессов может оказаться полезным при выяснении механизма ферментативного катализа. Для решения поставленной задачи представлялось необходимым провести изучение физико-химических и регуляторних характеристик пируватдекарбокеилазы дрожжей, выяснить особенности ее функционирования, закономерности взаимодействия фермента с кофакторами, субстратом и продуктом реакции. В задачу работы также входило изучение структуры и физико-химических свойств молекулы пировиноградной кислоты, путей деградации энергии ее электронного возбуждения - процессов люминесценции и фотохимии. Имеющиеся предпосылки для проведения подобного рода работы рассмотрены в литературном обзоре.
Настоящая работа является составной частью исследований, проводимых Отделом регуляции обмена веществ АН БССР по теме " Механизм действия тиаминовых ферментов и их роль в обеспечении метаболических гомеостатических реакций организма". Выполнение работы потребовало применения ряда физико-химических методов исследования: люминесцентной, УФ- и ИК-спектроско-пии, спектроскопии электронного парамагнитного и ядерного магнитного резонанса, методов химической модификации белков и других. Использование этих методов позволило получить некоторые конкретные результаты, которые в определенной степени расширяют наши представления о процессах декарбоксилирования пировинограднои кислоты.
Для понимания механизма реакция декарбоксилирования необходимо знание структурных особенностей молекулы субстрата. Нами изучено влияние межмолекулярных взаимодействий на геометрию молекулы пировинограднои кислоты, рассмотрены спектральные свойства пировинограднои кислоты в органических растворителях, связь спектральных характеристик со структурой молекулы (глава 5).Важным для энзимологии пировинограднои кислоты представляется вопрос о содержании различных её форм в водном растворе. На основании данных спектроскопии ЯМР нами рассчитано содержание четырёх основных форм пировинограднои кислоты при различных значениях рН среды, рассмотрено влияние температуры на равновесие между этими формами (глава 5).
Значительное место в работе уделено изучению путей дезактивации энергии электронного возбуждения пировинограднои кислоты. Глава 5 и глава 6 посвящены изучению процессов её люминесценции и фотохимии. При 77 К в органических растворителях, а также в водно-кристаллических матрицах пировиноградная кислота обладает интенсивной фосфоресценцией с хорошо разрешенной колебательной структурой. Колебательная структура обусловлена валентными колебаниями карбонильной, а также гидроксильной и метильной групп молекулы хромофора. Низкотемпературная фосфоресценция в водно-кристаллических, матрицах цринадаежшт негидратированной молекуле пировиноградной кислоты и её аниону. Параметры фосфоресценции отражают зависимость от рН содержания негидратированных форм кетокислоти при 77 К (глава 5).
По мере повышения температуры возрастает вклад процессов фотохимического превращения пировиноградной кислоты в дезактивацию её возбуждённого триплетного состояния. При комнатной температуре пировиноградная кислота в водном растворе эффективно фо-тодекарбоксилируется. На основании изучения закономерностей процесса фотодекарбоксилирования ( зависимость от рН, концентрационная зависимость и т.д.) предложена схема этого процесса, предполагающая участие гидратированной формы молекулы пирозинограднож кислоты. Методом ЗПР зарегистрировано образование - ряда свободно-радикальных промежуточных продуктов фотолиза кетокислоти, в частности, катион-радикала и свободного электрона. В присутствии соответствующих акцепторов электронов ультрафиолетовое излучение генерирует поток электронов с пировиноградной кислоты на них. Поток электронов на соответствующие акцептори создаётся и при ферментативном окислительном декарбоксилировании пировиноградной кислоты (глава 6).
Одним из факторов, определяющих ферментативное декарбокси-лирование пировиноградной кислоты, является наличие ионов металла. В работе было изучено взаимодействие двухвалентных катионов с пируватдекарбоксилазой и её коферментом - тиаминпирофосфатом (глава 7). Нами определены значения констант ассоциации" некоторых катионов с рядом производных тиаминпирофосфата; сделан вывод об участии в связнвании иона металла пирофосфатного остатка и атома азота в положении I пиримидинового кольца кофермента. Молекула апопируватдекарбоксилазы содержит четыре эквивалентных центра связывания ионов металла. Связывание одного катиона сопровождается вытеснением одного протона. В главе 7 отражены результаты изучения некоторых физико-химических и регуляторних свойств дрожжевой тшруватдекарбоксилазы. Каталитическая активность фермента контролируется рядом факторов: концентрацией субстрата и продукта, ионной силой, температурой, значением рН среды. Методом собственной триптофановой флуоресценции выявлен ряд структурных рН-индуцируемых перестроек молекулы фермента. Конформационные переходы белковой глобулы коррелируют с изменением ферментативной активности.
Эффективным ингибитором пируватдекарбоксилазы выступает её продукт - ацетальдегид. Помимо обратимого, возможно также необратимое ингибирование фермента ацетальдегидом, связанное с кова-лентной химической модификацией (алкшшрованием) пируватдекарбоксилазы. Необратимая модификация фермента ацетальдегидом протекает через первичный этап образования шиффова основания с последующей конденсацией двойной связи с близлежащей нуклеофильнои группой белка (глава 8).
Изучение взаимодействия ацетальдегида с пируватдекарбокси-лазой, а также, в качестве примера, с сывороточным альбумином, поднимает интересный и важный вопрос о значении постсинтетической модификации белков вообще.
Проделанная работа позволяет вынести на защиту следующие положения:
1. Низкотемпературная фосфоресценция (Тп —— $0переход) пи ровиноградной кислоты принадлежит её негидратированным формам. Интенсивность фосфоресценции отражает содержание негид . ратированных форм при 77 К.
2. Фотохимическое декарбоксилирование лировиноградной кислоты протекает при взаимодействии возбуждённого триплетного состояния кето-формы кислоты с гидратированной молекулой лировиноградной кислоты. В присутствии акцепторов электронов пировиноградной кислоты становится окислительным и сопровождается восстановлением акцепторов.
3. Тиаминпирофосфат осуществляет многоточечное связывание иона металла; в связывании участвуют пирофосфатная группировка и атом азота в положении Ґ шришдаового цикла кофермента.
4. Продукт реакции - ацетальдегид, помимо обратимого ингиЗиро-вания способен вызывать необратимую инактивацию пируватде-карбоксилазы за счет ковалентной химической модификации фермента. Подобная неферментативная химическая модификация ацет-альдегидом возможна и для ряда других белков, при этом существенно нарушаются их функциональные свойства. Модификация протекает через первичный этап образования основания Шиффа с последующей конденсацией двойной связи с близлежащим нуклео-фильным остатком молекулы белка.
Механизм реакции декарбоксилирования пирови-ноградной кислоты: классическая схема
Основой для установления механизма тиаминового катализа послужили два факта: I) экспериментальное доказательство образования ацетоина при декарбоксилировании лировияоградной кислоты в присутствии тиамина и сходство этой реакции с ацилоиновой конденсацией, протекающей в ферментативных системах [l8l] (о том, что соли тиазолия, в том числе тиамин, катализируют бензоиновую конденсацию, было известно ещё ранее) и 2) установление Бреслоу в 1957 г. высокой подвижности атома водорода в положении 2 тиазолового кольца [93]. Бреслоу связал высокую скорость обмена протона у атома углерода, заключённого между двумя гетероатомами S и N тиазолового цикла с каталитическими свойствами тиамина в реакции ацилоиновой конденсации [92]. Им было предположено, что катализ тиазолием сходен с ацилоиновой конденсацией, катализируемой CN-ионами. Предложенная Бреслоу последовательность этапов взаимодействия тиамина с ПК-субстратом является общепринятой [зі, 34, 167]. В основе этой схемы лежат следующие этапы: I) ионизация тиазолового кольца тиамина с образованием 2-карбаниона, имеющего илидный характер; 2) присоединение к карбаниону поляризованного карбонильного углерода ПК или другой oL-кетокислоты; 3) декарбоксилирование этого промежуточного соединения с образованием ионизированной формы 2- -окси-этилтиамина (I -карбаниона) (схема I).
Предложенная схема была подтверждена в дальнейшем целым рядом экспериментов. Мецлер с соавт. показали, что для осуществления каталитической реакции декарбоксилирования Ж в модельной системе необходимо тиазолиевое кольцо, не содержащее заместителей в положении 2 [127]. "Активный ацетальдегид" - 2-(ot -оксиэтил)тиаминпирофосфат и "активный пируват" - 2-( ok-окси-этил -о/-карбокси)тиаминпирофосфат были хрома тографически идентифицированы в работающей пируватдекарбоксилазной системе [126, 134]. Была подтверждена высокая реакционность протона во втором положении тиазолиевого кольца [lI9]. В недавних работах Клюгера с соавт. описан синтез, свойства, реакционная способность, взаимодействие с апопируватдекарбоксилазой первичного промежуточного продукта реакции - аддукта ПК и ЗЇЇФ [160, I6l] .
Схема I Подученные г последнее время различными авторами результаты позволили уточнить многие существенные детали механизма катализа. Истинным промежуточным продуктом реакции считается не 2-(JJ -оксиэтил)тиаминпирофосфат, а остающийся в активном центре фермента после декарбоксилирования "первичный" =і -карбанион [34, 62]. Само соединение 2-( Х -оксиэтил) ШФ можно рассматривать как побочный продукт нефизилогической реакции, протекающей в отсутствии соответствующих акцепторов альдегида. Нуклеофильный алифатический U -карбанион стабилизирован за счёт резонанса с енамином [l43] . Недавно получено прямое доказательство образования промежуточного енамина, связанного с ферментом, в ходе пируватдекарбоксилазной реакции [ГТО] . Карба-нионный интермедиат обладает уменьшенным положительным зарядом на тиазоловом цикле, что обеспечивает его повышенное сродство к активному центру фермента [Пб] . Как показали результаты рентгеноструктурного анализа, введение заместителей в положение С-2 существенно изменяет конформацию молекулы тиамина [231 ] . Конформация 2-6-лактил)тиаминпирофосфата("активного пирувата") такова, что образование этого промежуточного соединения и его декарбоксилирование структурно скоординированы. Эта конформация обеспечивает максимальное перекрывание орбиталей и соответствует принципу минимальных- перемещений в процессе реакции декарбоксилирования.
Центральным моментом в процессе тиаминового катализа является образование двух карбанионов: илида тиамина и карбанио-на 2- -оксиэтил)тиаминпирофосфата. Имеются все основания предположить, что окислительное и неокислительное декарбоксилирование ПК осуществляется по единому механизму с общим промежуточным продуктом.
Структура пировиноградной кислоты в водных растворах. Обратимая гидратация пировиноградной кислоты
Более важным нежели свойства Ж в органических растворителях для энзимологии представляется поведение Ж в водных растворах. От структуры и свойств молекулы субстрата во многом зависят пути его ферментативного превращения. Водные растворы пировиноградной кислоты характеризуются равновесием между кетоформой кислоты, 2,2-диоксипропионовой кислотой, образуемой при гидратации и анионами этих кислот [83,225]. Соотношение между этими четырьмя формами определяется концентрацией кислоты, значением рН среды и температурой.
Помимо этих основных четырёх форм в растворе в весьма незначительном количестве присутствует енольная форма Ж, составляющая 0,0033$ [53]. Процесс обратимой гидратации Ж изучен в ряде лабораторий [20, 83, 190, 225, 237]. Гидратация, протекающая по механизму общего кислотного катализа,представляет сложный процесс, в котором участвуют не менее трёх молекул воды.
Константа диссоциации протона кето-формы равна 0,86 10 2 М (рКа = 2,06) , константа диссоциации гидратированной формы 2,5 КЗ""4 М(рКа = 3,6) [вз] . Активность карбонильной группы недиссоциированной кислоты в реакции гидратации на два порядка выше активности ее диссоциированной формы. Константа гидратации недиссоциированной формы К = 2,65 [і90J , константа гидратации аниона ПК Kg = 0,0395 [67,83] . С понижением температуры содержание гидратированной формы существенно возрастает [237 J .
Состояния равновесия реакций гидратации ПК могут рассматриваться как модели любых реакций кетокислоти с основными группами белков или кофермента. Учитывая высокую реакционность карбонила недиссоциированной кислоты, а также тот факт, что константа скороети связывания субстрата - ПК с пируватдекарбоксилазой линейно снижается с ростом рН, параллельно убыли концентрации недиссоциированной кетокислоты, Шелленбергер с соавт. делают вывод о том, что истинным субстратом пируватдекарбоксилазы является негидратированная, недиссоциированная форма ПК [ 67,234] .
Образование непродуктивного тройного комплекса, включающего субстрат, кофермент и фермент, в случае лактатдегидро-геназы приписывают енольной форме ПК [бз] . Таким образом, знание содержания и свойств различных форм пировиноградной кислоты важно для понимания механизма ее энзимологических превращений.
В бинарных растворах, содержащих ионы марганца и Ж, наблюдается одноцентровая прямая координация иона металла карбоксильной группой пирувата [і80] . В активном центре ряда ферментов такая связь заменяется на опосредованную через молекулу воды. Взаимодействие с металл-связанной водой в активном центре обеспечивает поляризацию карбонильной группы ПК. Структура связанной в активном центре молекулы Ж существенно отличается от таковой в растворе.
В связывании пирувата с белками (как это показано для лактатдегидрогеназы) принимают участие аргининоше остатки, взаимодействующие по типу ионной пары с карбоксильной группой субстрата [ 243] . Протонированный остаток гистидина образует водородную связь с карбонильной группой ПК [88] . Взаимодействие с гуанидиновой группировкой остатка аргинина существенно увеличивает электрофильность карбонила молекулы ПК [243] . Фотофизические и фотохимические процессы, протекающие при поглощении кванта света молекулой пировинограднои кислоты, представляют интерес как с точки зрения свойств самой молекулы, так и ее ферментативных превращений.
В первых классических работах, посвященных фотохимии ПК, установлено, что при облучении водных растворов кислоты ультрафиолетовым светом образуется углекислый газ, в растворе при этом остается ацетоин и следы ацетальдегида и диацетила [l72, 173] . Те же продукты возникают при декарбоксилировании пировинограднои кислоты тиаминовыми ферментами. Возможен обратный фотохимический синтез пировинограднои кислоты из адетальдеги-да под действием ультрафиолетового излучения в присутствии нитрата аммония [55] . Таким образом, процессы фотохимического образования и превращения ПК представляют интерес также в связи с проблемой абиогенного синтеза биологически важных соединений.
Декарбоксилирование ПК в водных растворах протекает не только при поглощении молекулой ультрафиолетового кванта света, фотодекарбоксилирование ПК наблюдается при облучении видимым светом с длиной волны более 400 нм в присутствии окиси меди в качестве катализатора процесса, декарбоксилирование ПК обнаружено также в результате многофотонного поглощения инфракрасного лазерного излучения [ 95J Механизм реакции фотохимического превращения ПК существенно зависит от свойств растворителя. В органических водо-роддонорных растворителях Ж претерпевает эффективное фотовосстановление без заметного декарбоксилирования. Основной продукт в таких растворителях - диметилвинная кислота; выделен также, например, в метаноле, аддукт ПК и растворителя [150] . В газовой фазе фотохимический процесс завершается образованием ( и ацетаяьдегида. В бензоле, в отсутствии способных к отрыву протонов, фотореакция отсутствует [173] .
Взаимодействие пируватдекарбоксилазы с кофак-торами, субстратом и продуктом реакции - ацетальдегидом
Во взаимодействии ТПФ с пируватдекарбокеилазой принимают участие различные группировки молекулы кофермента. Определяющую роль в этом взаимодействии играет ион металла [206, 249J . Функциональное значение различных участков молекулы ТПФ было изучено в лаборатории Шелленбергера в экспериментах с различными модифицированными аналогами кофермента [73, ПО, 211] .
В молекуле ТПФ условно можно выделить каталитические и фиксирующие группировки. Так, атом азота в первом положении пиримидина оказался важным как для катализа, так и для связывания с белком; возможно, эта связь опосредована через ион металла. Азот в третьем положении не является столь необходимым в функционировании. Существенную роль в связывании играют ме-тильные группы в четвертом положении тиазола и втором положении пиримидина, обеспечивающие гидрофобные взаимодействия с белком. Решающее значение для связывания с ферментом принадлежит пирофосфатному остатку ТПФ, который играет якорную функцию [249] . Ион металла лигандируется пирофосфатной группировкой, а также, возможно, атомом азота в первом положении пиримидина ТПФ, и одним или несколькими аминокислотными остатками белка. Аминогруппа в четвертом положении пиримидина, не участвуя в связывании с белком, существенна для катализа. Оптимум процесса связывания ТШ с апопируватдекарбоксилазой соответствует рН 6,4 [89]
Образование каталитически активной холопируватдекарбок силазы из апофермента и ТПФ требует значительных промежутков времени [89] . Стадия, лимитирующая скорость в процессе образования холофермента, связана с конформационными изменениями в белке [67] . Наличие выраженной лаг-фазы в процессе формирования каталитически активного фермента из апоформы и ТШ показано для пируватдегидрогеназного комплекса из ряда источников [14, 136, 228J . Продолжительность лаг-периода зависит от концентрации ТПФ. Наличие ионов металла, ПК существенно уменьшает, а неорганического пирофосфата, конкурентного ингибитора по отношению к ТПФ - увеличивает длительность лаг-периода [і4, ІЗб] . Причиной лаг-фазы считают либо медленные конформационные изменения, приводящие к формированию активной структуры белка [ІЗб] , либо медленное связывание кофермента и апофермента[228].
Полагают также, что связывание ТПФ и ПК с пируватдегид-рогеназным комплексом осуществляется по неупорядоченному кинетическому механизму [228] , связывание субстрата происходит независимо от ТПФ [82] .Связывание кофактора и субстрата сопровождается конформационными перестройками фермента [228] .
Как утке отмечалось, связывание Ж с пируватдекарбокеи-лазой также вызывает конформационные изменения в белковой молекуле [б7] . По мнению Шелленбергера, Ж, являясь субстратом пируватдекарбоксилазы, одновременно влияет на процесс взаимодействия апофермента и кофермента и выступает регулятором активности фермента [б7, 138] . Регуляторное действие связано со взаимодействием карбонильной группы молекулы Же SB. -группой регуляторного центра ОДК [209] .
Для связывания молекул субстрата с пируватдекарбокеи-лазой необходимо выполнение ряда стерических требований; связывание определяется реакционностью карбонильной группы субстрата и гидрофобными взаимодействиями молекулы Ж и фермента. Константа Михаэлиса для Ж при рН 6,0 равна 2,9 10" М [67] .
Взаимодействие продукта реакции - АА с пируватдекарбок-силазой изучено менее детально. Имеющиеся данные позволяют предположить, что ВДК имеет первичный акцептор ацетальдегида, т.е. что молекула ВДК содержит некоторую функциональную группу, осуществляющую первичное акцептирование альдегидной группы с промежуточного продукта реакции декарбоксилирования -карбаниона оксиэтил - ТПФ [34, 14б] . Промежуточное восстановительное ацетилирование функциональной группы активного центра фермента предполагается и при окислительном декарбок-силировании Ж, катализируемом пируватдегидрогеназой [61, 238] . Более того, модификация функциональных групп молекулы белка карбанионным интермедиатом реакции декарбоксилирования может приводить к необратимой инактивации фермента [ііб, 155, 229] . Подобная инактивация при протекании реакции декарбоксилирования Ж в присутствии акцепторов электронов показана и для ВДК дрожжей [ЮЗ] .
Состояние и люминесцентные свойства пирошноградной кислоты в водных растворах
Установление закономерностей проявления структуры молекулы, характера межмолекулярных взаимодействий в люминесцентных и иных спектральных свойствах пировиноградной кислоты окажется в дальнейшем полезным при изучении фотохимических превращений ПК, взаимодействии ее с ферментом. Стереохимия молекулы ПК, взаимное расположение карбонильных групп, определяющее степень ЯГ- электронного сопряжения и, соответственно, распределение электронной плотности в молекуле, обуславливают, вероятно, не только спектральные свойства пировиноградной кислоты, но и многие закономерности реакций декарбокеилирования ПК. Следует также отметить, что активный центр пируватдекар-боксилазы весьма гидрофобен [34, 40 ] , потому свойства молекулы ПК, проявляемые в неполярных органических растворителях, отражают поведение субстрата в активном центре фермента. 5.2. Состояние и люминесцентные свойства пировиноградной кислоты в водных растворах Как следует из данных, представленных в предыдущем параграфе, состояние ПК в неполярных органических растворителях описывается равновесием между мономерной формой с внутримолекулярной водородной связью и ассоциированными формами с межмолекулярной водородной связью. В водных растворах подобным равновесием можно пренебречь. Знание физико-химических свойств различных форм ПК, существующих в ее водных раетворах имеет важное значение для понимания механизма реакций ферментатив- ного и фотохимического декарбоксилирования пировинограднои кислоты. Нами изучены люминесцентные характеристики пировинограднои кислоты в водно-кристаллических матрицах, определено содержание ее различных молекулярных форм, спектральные параметры ПК соотнесены с относительным количеством этих форм. значение рН раствора Ж при комнатной температуре до кристаллизации) (рис.5) . Интенсивность фосфоресценции максимальна в нейтральной среде. С понижением рН наолвдается значительное падение интенсивности свечения (рис.6, кривая i) , длинноволновой сдвиг спектра фосфоресценции (рис.6, кривая 4) и Зависимость от рН относительного квантового выхода фосфоресценции Ж (і) и отношения интенсивностей свечения при двух длинах волн (4) , Т я 77 К; содержания негидратированной (2) и гидратированной (з) форм Ж и оптической плотности Ж на длине волны 320 нм ( б) , Т = 298 К. изменение его колебательной структуры.
Понижение рН приводит также к уменьшению длительности фосфоресценции, причем падение интенсивности фосфоресценции опережает уменьшение длительности. Можно предположить, что падение интенсивности фосфоресценции с уменьшением рН связано с уменьшением количества излучающих молекул, находящихся в равновесии с нефосфоресцирующими формами молекул ПК. Солевая добавка (0,3 М К Сі) не влияла ни на положение и квантовый выход, ни на длительность фосфоресценции. Очевидно, что молекулы ПК не изменяют своих спектральных свойств в зависимости от того, как они выкристаллизованы при замерзании водного раствора : в комплексе друг с другом, в окружении молекул воды или в присутствии молекул добавки [43] . Многочисленные исследования показали, что равновесие различных форм ПК в водных растворах описывается следующей схемой [83, 225]
Соотношение и физико-химические свойства различных форм Ж в водных растворах во многом определяют протекание реакций ферментативного превращения пировиноградной кислоты, т.е. определяют поведение ПК как субстрата [53, 234] . Содержание различных форм ПК в водном растворе удобно контролировать методом спектроскопии ЯМР. Спектр ЯМР ПК (0,2 М) в Н20 при комнатной температуре имеет сигнал (4,74 м.д.) ОН-групп растворителя и перекрывающийся с ним сигнал ОН-групп молекул ПК и два синглетных пика (1,65 и 2,55 м.д.) , принадлежащих метильным группам соответственно гидратированной формы" (недиссоциированная молекула СНз С (ОН) 2 СООН и ее анион) и негидратированной формы (недиссоциированная молекула СН3 СО СООН и ее анион) . По соотношению интенсивностей сигналов метильных групп при различных значениях рН можно непосредственно определить содержание гидратированной и негидратированной форм ПК (рис,6, кривые 3 и 2) . Наши данные согласуются с литературными [83] . Содержание енольной формы ПК в водных растворах весьма незначительно [53, 83] и,следовательно, не может изменить соотношение остальных четырех форм. Наличие в спектре ЯМР двух сигналов метильных групп, а не четырех, вызвано высокой скоростью обмена молекул ПК между двумя состояниями кислоты - протонированным и депротониро-ванным, в двух формах : гидратированной и негидратированной. В спектре ЯМР для каждой из этих форм появляется общий сигнал с частотой : где А и Уд - относительное содержание протонированной формы ПК и положение сигналов метильных групп ПК в протонирован-ном состоянии, В и Vg - то же для молекул ПК в непротониро-ванном состоянии.
