Введение к работе
Актуальность темы. Взаимодействие пептидов с мембранами вызывает огромный интерес в связи с изучением антибактериальных пептидов как новых высокоэффективных антибиотиков, а также как модельная система для изучения процесса фолдинга мембранных белков. Антимикробный пентадекапептид грамицидин А (гА) был открыт и выделен в чистом виде более полувека назад. Показано, что при добавлении в водный раствор, омывающий бислойную липидную мембрану (БЛМ), грамицидин А самопроизвольно встраивается в БЛМ, образуя ионный канал, селективный к моновалентным катионам (Andersen and Коерре, 2007). Структура этого канала формируется двумя одиночными правозакрученными спиралями с шагом 6,3 аминокислотных остатка на виток, N-концы которых соединяются между собой водородными связями, так что при этом образуется трансмембранный димер. Канал грамицидина А представляет одну из самых популярных моделей биофизических исследований. Было установлено, что помимо указанной структуры, грамицидин А способен формировать в мембранах и другие структуры, например, двойную спираль. Последняя является доминирующей в большинстве органических растворителей и кристаллах грамицидина. Свойства ионных каналов, образованных двойной спиралью, изучены слабо. Грамицидин А широко применяется в биохимии как агент, выравнивающий ионные градиенты в биологических системах, в частности, как разобщитель окислительного фосфорилирования в митохондриях и хлоропластах. В то же время в ряде работ было показано, что его действие не сводится лишь к деполяризации мембраны. Помимо изучения грамицидина как простейшей модели ионного канала, проводятся также исследования аналогов этого пептида, направленные на изучение его антибактериального действия. К сожалению, применение грамицидина А как антибиотика сдерживается его высокой токсичностью по отношению к эукариотическим клеткам. Этот недостаток теоретически может быть преодолен путем поиска соответствующего аналога грамицидина. В этом
плане приобретает большое значение изучение функционирования различных аналогов грамицидина. Модификации грамицидина А путем присоединения к С-концу его аминокислотной последовательности ряда группировок обеспечили возможность изучения взаимодействия ионного канала с различными лигандами и явились основой для построения высокочувствительных мембранных биосенсоров (Cornell et al., 1997). Интересны также аналоги, которые имеют измененное по сравнению с грамицидином А число аминокислот как с С-конца, так и с N-конца. В частности в группе Керта (Arndt et al., 2001) был синтезирован аналог грамицидина А, укороченный на четыре аминокислоты с N-конца, который получил название мини-грамицидин (рис. 1). Было показано, что его активность на БЛМ существенно зависит от толщины мембраны. В настоящей работе мы провели систематическое исследование механизма работы мини-грамицидина и его ковалентного димера как на бислойных липидных мембранах, так и на липосомах и митохондриях.
Ранее в нашей лаборатории был разработан новый метод изучения грамицидина и его аналогов, основанный на сенсибилизированной фотоинактивации (Rokitskaya et al., 1996). Было показано, что этот метод позволяет получать уникальную информацию о кинетике функционирования каналов.
Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение механизма функционирования мини-грамицидиновых каналов в бислойной липидной мембране. В этой связи ставились следующие задачи:
Исследовать чувствительность индуцированной мини-грамицидином проводимости плоской бислойной липидной мембраны к освещению в присутствии фотосенсибилизатора.
Изучить кинетику сенсибилизированной фотоинактивации каналов ковалентного димера и мономера мини-грамицидина в плоских мембранах различного липидного состава.
Провести систематическое исследование активности каналов ковалентного димера и мономера мини-грамицидина как на плоских БЛМ, так и на липосомах и митохондриях.
Изучить параметры одиночных каналов мини-грамицидина в зависимости от толщины плоской мембраны.
5. Сформулировать и обосновать модель функционирования каналов
мономера и ковалентного димера мини-грамицидина.
Научная новизна и практическая значимость работы. Обнаружено, что механизм функционирования мини-грамицидина сходен с таковым для грамицидина А. Показано, что каналы, формируемые ковалентным димером мини-грамицидина, обладают большей чувствительностью к фотодинамическому воздействию, чем каналы мономера мини-грамицидина, что говорит о существенно различной структуре этих каналов.
При изучении кинетики сенсибилизированной фотоинактивации ковалентного димера мини-грамицидина в ответ на вспышку света четко продемонстрировано влияние толщины мембраны на функционирование каналов мини-грамицидина. Впервые с помощью измерения тока через плоскую бислойную мембрану показано, что ионофорная активность ковалентного димера мини-грамицидина связана с формированием им каналов двух типов. Полученные результаты существенно расширяют представление о работе ионных каналов, формируемых пептидами мономером и ковалентным димером мини-грамицидина в бислойных липидных мембранах. Данные нашей работы вносят вклад в решение фундаментальной проблемы - механизма функционирования ионных каналов в биологических мембранах.
Публикация и апробация работы. По результатам исследований опубликовано 5 работ, из них: одна в реферируемом научном российском журнале («Биологические мембраны»), одна в реферируемом зарубежном журнале (Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes) и 3 в тезисах конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 115 страницах текста и включает Введение, Литературный обзор, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение результатов и заключение, Выводы и Список цитируемой литературы из 124 ссылок. В работе содержится 41 рисунок.
