Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
Роль кальция в живых системах 5
Потенциалоуправляемые Са2* каналы 5
Са2* антагонисты 6
Формальное описание работы потенциалоуправляемых Са2* каналов 7
Кинетика инактивации - отличительная черта подгрупп потенциалоуправляемых Са2*
каналов 8
Конформационно-зависимое действие веществ . 8
Исследования взаимосвязи структуры и функции белков при помощи рекомбинантных
каналов и анализ данных 9
Цели исследования 10
Положение, выносимое на защиту 11
Научная новизна 11
Теоретическое и практическое значение 12
Структура диссертации 13
ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
Кальции и кальциевые токи через клеточную мембрану 14
Классификация потенциалоуправляемых Са2* токов 14
Как ионы проникают через клеточную мембрану 16
Субъединицы Са2* каналов 18
cci-субъединица 19
р-субъединица 19
аг-д-субъединица 20
у-субъединица 20
Классификация потенциалозависимых Са2* каналов 21
Фармакология потенциалоуправляемых Са2* каналов 24
Молекулярные основы взаимодействия «канал-лиганд» 28
Структуры рецепторов кальциевых антагонистов на уровне отдельных аминокислот 30
Структура рецептора Дигидропиридинов 30
Структуры рецепторов Фенилалкиламинов и Бензотиазепинов 31
Исследования функции потенциалозависимых Са2* каналов на примере трансгенных
организмов 33
«Выключение» экспрессии Cav1 2 (сс1С) 34
Переэкспрессия Cav1 2 (сс1С) 34
«Выключение» экспрессии Cav1 3 (crfD) 34
«Выключение» экспрессии Cav2 1 (a1A) 35
«Выключение» экспрессии Cav2 2 (criB) 35
«Выключение» экспрессии Cav2 3 (сс1Е) 36
«Выключение» экспрессии р1-субъединицы 36
«Выключение» экспрессии /33-субъединицы 36
«Выключение» экспрессии у\'-субъединицы 37
Патологические состояния, вызванные мутациями в генах, кодирующих
потенциалозависимые Са2* каналы 37
Полушарная мигрень 37
Эпизодическая атаксия, тип 2 (ЕА2) 38
Мозжечковая (церебеллярная) атаксия, тип 6 (CSA6) 39
Врожденная стационарная никталопия (xlCSNB) 40
Предрасположенность к злокачественной гипертермии 40
Периодические гиперкалемические параличи 40
ионоселективный фильтр потенциалозависимых са2* каналов 41
Пространственная структура потенциалоуправляемых ионных каналов 44
«Внешний вид» комплекса потенциалозависимого Са2* канала 44
Пространственная структура потенциалозависимого К* канала 45
КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМЫХ СА2* КАНАЛОВ ВО ВРЕМЯ ПРОХОЖДЕНИЯ
ПОТЕНЦИАЛА ДЕЙСТВИЯ . 51
Кинетика инактивации - отличительная черта подгрупп Са2* каналов 53
Мутации, вызывающие полушарную мигрень у человека, изменяют кинетику
инактивации Са2* каналов 55
Исследования механизмов инактиваци с использованием рекомбинантных Са2+
каналов 58
В ИОНОПРОВОДЯЩЕИ структуре Са2* канала расположены детерминанты кинетики
инактивации 60
Внутриклеточные петли взаимодействие с р-субъединицами, G-белками и
СИНТАКСИНОМ 62
Карбоксильное окончание сплайс-варианты Cav1 2 и Са2* зависимая инактивация 65
Структурные определяющие медленной инактивации в Са2* каналах 66
Структуры, определяющие инактивацию, влияют на связывание лигандов в
ионопроводящеи структуре Са2* канала 68
Выводы и обсуждение 70
ГЛАВА II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 72
Ооциты Xenopus laevis как система для экзогенной экспрессии ионных каналов 72
Экспрессия химерных ои субъединиц в ооцитах Xenopus laevis 75
Эксперименты методом двухэлектродной фиксации потенциала 75
Анализ ингибирования Са2* и Ва2* токов Са2* антагонистами 76
Конструирование ионных каналов-мутантов 76
Частота снятия показаний 77
Программное обеспечение 77
Статистика 77
Приложение анализ кинетики ингибирования открытого и инактивированного
состоянии ионного канала 77
ГЛАВА III МЕХАНИЗМ ИНАКТИВАЦИИ CAV2.1 И РОЛЬ р-СУБЪЕДИНИЦ 80
Влияние аминокислот сегмента IVS6 на кинетику инактивации 80
Замена М1811 на полярные и заряженные аминокислоты вызывает значительное
ускорение кинетики инактивации 83
Влияние «консервативных» аминокислот на кинетику инактивации 86
Изменение кинетики инактивации различных мутантов при экспрессии
Р2а-СУБЪЕДИНИЦЫ 87
Обсуждение 90
Структуры сегмента IVS6, определяющие кинетику инактивации 90
Влияние мутаций в сегменте IVS6 на регулирование кинетики Cav2 1
р-субъединицами 92
Краткое резюме к Главе III . . 95
ГЛАВА IV МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ИЗРАДИПИНА: РОЛЬ
ИНАКТИВИРОВАННОГО СОСТОЯНИЯ СА2* КАНАЛА 96
Действие Р-субъединиц на инактивацию Са2* каналов и ингибирование (+)-израдипином 96 Молекулярные структуры в сегменте IVS6, определяющие инактивацию, влияют на
ингибирование Са2* каналов (+)-израдипином 98
Равновесная инактивация и потенциалозависимое ингибирование Са2* каналов
L-типа . 100
Кинетика израдипин-инактивации при -30 мВ 103
Действие (+)-израдипина на кинетику 1ВА при+20 мВ . 103
«Восстановление» Ва2* тока из потенциалозависимого
ингибирования (+)-израдипином 104
Обсуждение 105
Мутации в сегменте IVS6 влияют на ингибирование (+)-израдипином Са2* канала в
состоянии покоя . 105
Роль инактивации в подавлении сца dhp каналов (+)-израдипином 106
Роль инактивации при ингибировании Са2* каналов L-muna (+)-израдипином 106
Молекулярные структуры в сегменте IVS6, «ответственные» за инактивацию,
определяют кинетику восстановления каналов от инактивации в присутствии (+)-
израдипина . 107
Молекулярный механизм действия ДГП 108
Краткое резюме к Главе IV 109
ГЛАВА V ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОЕ УСКОРЕНИЕ БАРИЕВОГО ТОКА ЧЕРЕЗ CAV1.2
КАНАЛЫ (+)- И (-)-ИЗРАДИПИНОМ 110
Подавление (+)- и (-)-израдипином бариевых токов через СаИ 2 . 110
ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОЕ УСКОРЕНИЕ ИНАКТИВАЦИИ IBA (+)- И (-)-ИЗРАДИПИНОМ 113
Отличие стабильности (+)- и (-)- израдипин-инактивированных состоянии 115
Обсуждение 117
Эффективность ингибирования Са2* каналов в состоянии покоя (-80 мВ)
соответствует способности израдипина ускорять переход из состояния покоя в
инактивированное состояние (-30 мВ) 117
Ингибирование открытого состояния или «усиление» инактивации7 118
Молекулярные структуры Cav1 2, определяющие «исходную» и лиганд-зависимую
инактивацию 119
Краткое резюме к Главе V 120
ГЛАВА VI ОБЩИЕ СВОЙСТВА ИНГИБИРОВАНИЯ И ИНАКТИВАЦИИ СА2+ КАНАЛОВ:
СОВПАДЕНИЕ ИЛИ ЗАКОНОМЕРНОСТЬ? 122
Введение 122
потенциалозависимая инактивация и чувствительность химер cav каналов
к лигандам 124
аминокислоты, расположенные вблизи рецепторов сд2+ антагонистов, определяют
кинетику инактивации и чувствительность канала к лигандам 126
аминокислоты, не входящие в состав рецепторов са2+ антагонистов, но определяющие
кинетику инактивации, влияют на ингибирование канала лигандами 128
р-субъединица оказывает влияние на кинетику инактивации и подавление канала
лигандами 130
Структуры, определяющие кинетику инактивации, и чувствительность каналов к ДГП 132
Роль Са2+-зависимои инактивации в ингибировании КАНАЛА ЛИГАНДАМИ 136
Моделирование взаимодействия канал-лиганд 137
Обсуждение . 139
ГЛАВА VII КОНФОРМАЦИОННО-ЗАВИСИМОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ 141
Введение 141
Частотозависимое ИНГИБИРОВАНИЕ ионного канала в течении последовательности
импульсов 142
Количественный анализ частотозависимого ингибирования 145
Как учесть молекулярный механизм ингибирования ионного канала? 147
Зависимость связывания лиганда от состояния канала 149
ингибирование состояния покоя ионного канала 149
Особенности ингибирования открытого и инактивированного состояний канала 150
Методы исследования конформационно-зависимого ингибирования кальциевых
КАНАЛОВ 154
Взаимозависимость ингибирования и инактивации 154
Молекулярный механизм действия ФАА, дилтиазема и мибефрадила 157
Молекулярный механизм действия ДГП 158
Дискуссия и выводы 161
ВЫВОДЫ 164
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 166
Введение к работе
Роль кальция в живых системах
Уже в конце прошлого столетия было известно, что кальций необходим для поддержания нормальной клеточной активности. Биолог Жак Леб писал: "Как только ткани становятся беднее ионами кальция, тотчас же ионы натрия утрачивают способность вызывать сокращение. После добавления' к раствору хлористого натрия избытка солей кальция ритмические сокращения совершенно прекращаются. Это указывает на то, что сокращения вызываются только при известной концентрации ионов натрия; но когда отношение ионов натрия к ионам кальция становится слишком большим, сокращения становятся невозможными; невозможны они и в том случае, когда это отношение делается слишком малым" (Леб, 1910, цитата воспроизводится согласно книге П. Г. Костюка "Кальций и клеточная возбудимость").
Открытие роли электрического тока, как универсального раздражителя возбудимых тканей, и развитие представлений о наличии в каждой клетке проницаемой - в ответ на определенные стимулы - поверхностной мембраны сделало возможным изучение механизмов, лежащих в основе функционирования возбудимых клеток. В свою очередь, эти исследования заложили основы для понимания механизмов возникновения и проведения потенциала действия - основной формы реакции возбудимой клетки
Особая роль двухвалентных катионов в живых системах была подчеркнута открытием способности белковых макромолекул избирательно связываться с двухвалентными ионами, в том числе с ионами кальция.
Потенциалоуправляемые Са2* каналы
Для того, чтобы непротиворечиво объяснить механизм возникновения и проведения потенциала действия, оказалось необходимым предположить наличие особой структуры, встроенной в клеточную мембрану. Данная структура должна обеспечивать выборочное проведение определенных ионов через клеточную мембрану в ответ на определенный стимул -
например в ответ на изменение потенциала. Соответствующая - на тот момент гипотетическая - структура получила название «ионный канал».
Данная структура впоследствии была обнаружена экспериментально. Сначала удалось изолировать и исследовать свойства молекулы натриевого канала, а потом и измерить ионный ток через отдельный ионный канал.
На данный момент описано множество типов ионных каналов. Каналы способны избирательно проводить определенные ионы - как катионы, так и анионы - натрия, калия, кальция, хлора и некоторые другие. Ионные каналы, изменяют проводимость - «открываются» или «закрываются» - в ответ на изменение потенциала клеточной мембраны (потенциалоуправляемые каналы) или в ответ на изменение концентрации некоторых ионов - например того же кальция (!). Активность канала может также зависеть от концентрации достаточно сложных лигандов, таких как у-аминомасляная кислота, ацетилхолин, аденозинтрифосфат, инозитолтрифосфат или циклические нуклеотиды (хемовозбудимые каналы).
В данной работе мы подробно рассмотрим работу каналов, которые открываются в ответ на изменение потенциала клеточной мембраны и избирательно проводят ионы кальция - т.е., потенциалоуправляемые кальциевые каналы.
Потенциалоуправляемые ионные каналы, в том числе и кальциевые, играют важную роль в регуляции электрической активности возбудимых клеток. Изменения в кинетике и плотности экспрессии ионных каналов, вызванные, в том числе мутациями в соответствующих генах, приводят к разнообразным патологическим состояниям на уровне организма (Benatar, 1999; Felix, 2000). В качестве примеров таких патологических состояний можно привести обыкновенную полушарную мигрень, эпизодическую атаксию типа 2, церебральную атаксию типа 6, врожденную стационарную никталопию, предрасположенность к злокачественной гипертермии и периодические гиперкалемические параличи.
Са2* антагонисты
В 60х годах Fleckenstein обнаружил, что различные вещества способны избирательно подавлять «входящие» Са2+ токи, вызванные деполяризацией клеточной мембраны. Исследования, выполненные на клетках сердечных и гладких мышц, показали, что это ведет к уменьшению сократительной силы и
7 делает невозможным проведение потенциала действия (Fleckenstein et al., 1983). Увеличение концентрации Са2+ вновь увеличивало силу мышечных сокращений и восстанавливало проводимость Са2+ потенциала действия. Это дало повод ввести термин Са2+ антагонисты.
Особый интерес представляет взаимодействие
потенциалоуправляемых Са2+ каналов с широко используемыми в клинической практике 1.4-дигидропиридинами (ДГП, например нифедипин и нитрендипин), фенилалкиламинами (ФАА, галлопамил и верапамил) и бензотиазепинами (БТЗ, д-цис дилтиазем).
Фармакологическая активность Са2+ антагонистов, например их антиаритмическое и сосудо-расслабляющее действие, объясняется потенциало- и частото-зависимым (для ФАА и БТЗ) ингибированием проникновения ионов Са2+ через каналы L-типа в гладких и сердечных мышцах. Ингибирование потока двухвалентных ионов через Са2+ каналы определяется высокоспецифичным взаимодействием Са2+ антагонистов с соответствующими рецепторами (Caterall et al., 1992, Striessnig et al., 1993)
Молекулярные механизмы, лежащие в основе взаимодействия Са2+ антагонистов с соответствующими рецепторами, а также эффект такого действия на ионный канал в целом, на данный момент исследованы недостаточно.
Формальное описание работы потенциалоуправляемых Са2* каналов
При потенциалах покоя потенциалоуправляемые Са2+ каналы находятся в закрытом состоянии, или, другими словами, в состоянии покоя. В ответ на деполяризацию мембраны клетки каналы открывается (активируются), или, другими словами, переходят в открытое состояние. При продолжительной деполяризации каналы переходят в непроводящее инактивированное состояние, те., инактивируются. Отличие инактивированного и закрытого состояний канала (или состояния покоя) состоит в том, что под действием потенциала инактивированный канал не может немедленно активироваться, в то время как «просто» закрытый (в состоянии покоя) канал - может. При последующей реполяризации каналы переходят из инактивированного состояния в состояние покоя, или, другими словами, восстанавливаются от инактивации.
8 Молекулярные механизмы, лежащие в основе переходов между различными состояниями потенциалоуправляемых Са2+ каналов, на данный момент исследованы недостаточно.
Кинетика инактивации - отличительная черта подгрупп потенциалоуправляемых Са2+ каналов.
Для точного контроля притока ионов Са2+ во внутриклеточное пространство в процессе эволюции возникло семейство потенциалоуправляемых Са2+ каналов с различными биофизическими и фармакологическими свойствами. Одним из основных отличительных признаков подклассов Са2+ каналов является кинетика инактивации. Интересно отметить, что в процессе эволюции «дополнительно» к различным типам каналов появилось несколько инактивационных механизмов.
Каналы семейства Cav3 (Cav3.1-Cav3.3, или же каналы Т-типа) обладают самой быстрой кинетикой инактивации среди потенциалоуправляемых Са2+ каналов, если использовать Ва2+ в качестве носителя заряда. Несколько медленнее инактивируются Cav2.3 (R-тип), еще медленнее Cav2 2 (N-тип) и Cav2.1 (P/Q-тип). Медленнее всего инактивируются Ва2+ токи через каналы семейства Cav1, в частности Cav1.1 (каналы L-типа, характерные для скелетно-мышеченых клеток).
Конформационно-зависимое действие веществ
Предположение о том, что эффективность связывания вещества с ионным каналом зависит от того, в каком состоянии - покоя (R, от „Rest"), открытом (О, „Open") или инактивированном (I, „Inactivated") - находится канал, впервые высказали Armstrong (1966,1969) и Strichartz (1973). Эта идея легла в основу гипотезы «модулированного рецептора» («modulated drug receptor»; Hille, 1977; Hondghemetal, 1977).
Суть явления заключается в том, что некоторые вещества ингибиируют ионный канал эффективнее, если канал «используется», т.е. находится в открытом или инактивированном состояниях (во время, например, потенциала действия). В английском языке этот эффект получил логичное название «use-dependent inhibition» - ингибирование, зависимое от использования (Courtney, 1975). Используемый в русском языке термин
9 «частотозависимое подавление (ингибирование)» быть может не так элегантен, но суть явления отражает не менее точно.
Концепция «модулированного рецептора» предполагает, что в ионном канале, который находится в состоянии покоя, места связывания лигандов (рецепторы) находятся «глубоко» внутри молекулы канала. Эти рецепторы становятся доступными для связывания только в результате конформационных изменений, лежащих в основе процессов активации и/или инактивации ионных каналов.
Исследования взаимосвязи структуры и функций белков при помощи рекомбинантных каналов и анализ данных.
На данный момент можно выделить 2 основных подхода в исследовании взаимосвязи структуры и функций белков.
1. Создание молекул-«химер», состоящих из фрагментов двух
различных по своим свойствам белков. Последующее сравнение свойств
полученных рекомбинантных («химерных») белков со свойствами исходной
молекулы позволяет идентифицировать те структурные элементы, которые
«отвечают» за воспроизведение функций, уникальных для одной из исходных
молекул. Обычно такой подход используется в качестве «первой итерации».
2. Замена отдельных аминокислот («точечные мутации») и сравнение
свойств полученных рекомбинантных каналов со свойствами исходной
молекулы.
Описанные методы можно разделить еще на два подхода - а) «деструктивный», когда целью является сделать белок нефункциональным, и б) «конструктивный» - когда делается попытка заставить белок выполнять ранее несвойственные ему функции.
Во многих случаях для оценки результатов изменения структуры белка (например, фермента) достаточно самого простого критерия - «работает/не работает». В некоторых случаях для описания действия лиганда на рекомбинантный белок так же достаточно «действует/не действует».
Однако в случае ионных каналов подобные критерии применимы редко. В частности, для оценки эффективности лигандов, для которых характерно частотозависимое (например, БТЗ и ФАА) или потенциалозависимое (например, ДГП) действие, простейших критериев оказывается недостаточно: возникает необходимость подробного анализа
10 кинетики ингибирования и/или изменения кинетики самого канала под действием лиганда. «Готового к работе» метода анализа, способного учесть модификацию кинетики канала лигандом, на момент начала работы не существовало.
Отдельного разговора заслуживают исследования последствий замен отдельных аминокислот или участков аминокислотной последовательности на потенциалозависимость активации и инактивации, а также на кинетику активации и инактивации. Попыток описать изменения кинетики инактивации Са2+ каналов в рамках даже простейшей кинетической схемы отмечено не было.
Вопрос о том, можно ли в рамках существующих на данный момент концепций - «модулированного рецептора» и/или «лиганд-индуцированной медленной инактивации» - непротиворечиво объяснить все вышеописанные явления, в частности в рекомбинантных каналах, на момент начала работы так же оставался открытым.
Вопрос о (взаимо-) связи кинетики инактивации канала и его чувствительности к определенным лигандам на первый взгляд может показаться лишенным смысла. Тем не менее, аргументом в пользу существования такой взаимосвязи является тот факт, что некоторые мутации отдиночных аминокислот приводят к одновременному изменению кинетики инактивации и чувствительности канала к определенным лигандам.
Цели исследования
Исследовать возможную структурную и функциональную взаимосвязь процессов инактивации и ингибирования потенциалоуправляемых Са2+ каналов Са2+ антагонистами.
Разработать концепцию для описания изменений работы потенциалоуправляемых Са2+ каналов под действием лигандов, ионов, замен участков последовательности, мутаций и экспрессии различных регуляторных белков (например, дополнительных субъединиц). В частности, разработать методику определения механизма действия лигандов и их «фармакологической» активности по отношению к потенциалоуправляемым Са2+ каналам.
Положение, выносимое на защиту
Способность ДГП, ФАА и БТЗ ингибировать и модифицировать потенциалоуправляемые Са2+ каналы зависит непосредственно от кинетики инактивации таких каналов. Ингибирующее и модифицирующее действия ДГП и ФАА и БТЗ на потенциалоуправляемые Са2+ каналы объясняются тем, что эти лиганды меняют кинетику переходов каналов между состояниями, и, в том числе, ускоряют переход в инактивированные состояния.
Научная новизна
Обнаружен кластер из четырех аминокислот, замена которых приводит к значительным изменениям в кинетике инактивации потенциалоуправляемых Са2+ каналов. Расположение аминокислот в нижней трети сегмента IVS6 подтверждает предположение о том, что кинетика канала зависит от взаимодействий между сегментами S5 и S6, образующими ионопроводящую структуру канала. Представленные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие сегментов S5 и S6 зависит главным образом от заряда и полярности аминокислот.
Показана взаимозависимость процессов инактивации и ингибирования потенциалоуправляемых Са2+ каналов. В частности, одни и те же молекулярные структурные элементы могут входить как в состав «рецептора» определенного лиганда, так и в состав структуры, определяющую кинетику инактивации. Кроме того, показана корреляция между ингибирующей активностью лиганда по отношению к Са2+ каналу и кинетикой инактивации Са2+ каналов.
Кинетическая модель, учитывающая переходы между единственным закрытым, единственным открытым и несколькими («быстро-», «медленно-» и «Са2+-») инактивированными состояниями, впервые применена для оценки эффектов экспрессии различных р-субъединиц, замен участков последовательности и отдельных аминокислот, а также изменения кинетики каналов в присутствии различных лигандов.
Показано, что теории «модулированного (защищенного) рецептора» и «лиганд-зависимой медленной инактивации» недостаточны для корректного описания всех аспектов действия ДГП, ФАА и БТЗ на потенциалоуправляемые Са2+ каналы. Предложена альтернативная гипотеза, позволяющая непротиворечиво описать взаимовлияние кинетики
12 инактивации потенциалоуправляемых Са2+ каналов и способности лигандов изменять работу таких каналов.
Предложена методика оценки активности лигандов, обладающих частотозависимым действием на потенциалоуправляемые Са2+ каналы, а также способности Са2+ антагонистов модифицировать работу Са2+ каналов. Методика основана на анализе измеряемых экспериментально зависимостей а) кинетики ионных токов и/или Ь) ингибирования ионных токов от і) частоты стимулирования іі) длины импульсов и ііі) концентрации лиганда в рамках простейшей кинетической модели.
Теоретическое и практическое значение.
Информация о механизмах взаимодействия Са2+ антагонистов классов ДГП, ФАА и БТЗ с потенциалоуправляемыми Са2+ каналами на молекулярном уровне (лиганд-рецептор) должна оказать существенную помощь в разработке новых лекарственных препаратов.
Описанная методика позволяет определить механизмы действия лиганда на ионный канал («модулятор кинетики», «ингибитор открытого состояния канала» и тд.) и сравнительно точно предсказать поведение каналов в сложных системах, например при повторяющемся стимулировании в присутствии нескольких модуляторов (различных ионов, лигандов, дополнительных субъединиц и т д). Всесторонняя оценка действия лиганда на ионный канал имеет первостепенную важность при оценке его эффективности как «потенциального» лекарственного препарата
Полученные результаты и наработанные методики должны оказать существенную помощь в последующих исследованиях молекулярных механизмов, обеспечивающих работу потенциалоуправляемых Са2+ каналов.
Описанные методики и данные о молекулярных механизмах инактивации могут быть применены для исследований не только на потенциалоуправляемых Са2+ -, но так же и на других типах ионных каналов, в частности натриевых и калиевых.
Способность потенциалоуправляемых Са2+ каналов изменять свои свойства под действием различных ионов, лигандов и белков позволяет исследовать многие физиологические - в особенности регуляторные -процессы с новой точки зрения.
13 Структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы.
