Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы Женило, Светлана Валерьевна

Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы
<
Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Женило, Светлана Валерьевна Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы : диссертация ... кандидата физико-математических наук : 03.00.02 Москва, 2006

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор Литературы 5

1.1.Метилирование генома эукариот и растений 6

1.2. ДНК метилтрансферазы. Защита от de novo метилирования 8

1.3. X инактивация. Геномный импринтинг 13

1.4 Метилирование ДНК и заболевания 18

1.5 Модификации гистонов. Связь метилирования ДНК и модификаций гистонов 21

1.6 Метил-ДНК-связывающие белки 26

1.7 Краткая характеристика белков семейства BTB/POZ 33

2. Материалы и методы 43

2.1.3. Олигонуклеоитиды для клонирования полноразмерных Kaiso, ZBTB4, ZBTB38

и цинковых пальцев ZBTB4 и ZBTB38 для имуннофлуоресценции 44

2.1.4. Олигонуклеотиды для анализа результатов по иммунопреципитации хроматина

методом ПЦР 45

2.1.5. Олигонуклеотиды, использованные для РТ-ПЦР 45

2.1.6. Олигонуклеотиды для получения NLS Kaiso 45

2.2. Полноразмерные кДНК Kaiso, ZBTB4, ZBTB38 45

2.3. Полимеразиая цепная реакция 46

2.3. Трансформация E.coli и выделение плазмидной ДНК ...46

2.4. Получение компетентных клеток 47

2.5. Клонирование ПЦР-продукта 48

2.6. Получение радиоактивно меченых ДНК-зондов для экспериментов по торможению ДНК-белковых комплексов в геле 48

2.7. Исследование ДНК-белкового взаимодействия методом задержки подвижности в

геле ДНК-белкового комплекса 50

2.8.Иммунопреципитация хроматина 50

2.9. Нозерн блот гибридизация и количественный РТ-ПЦР 52

2.10. Клеточные линии и временная трансфекция 54

2.11. Метил-зависимый репрессивный тест 54

2.12. Иммунофлуоресценция и микроскопия 55

2.13. Клонирование цинковых пальцев Kaiso, ZBTB4, ZBTB38 для in vitro трансляции. 55

2.14. Клонирование полноразмерных Kaiso, ZBTB4, ZBTB38 и цинковых пальцев данных белков для иммунофлуоресценции 56

2.15. Клонирование делений ZBTB4 и ZBTB38 для метил-зависимого репрессионого теста 56 '

3. Результаты и обсуждение 59

3.1. Два новых белка ZBTB4 и ZBTB38, гомологичных Kaiso, узнают метилированую ДНК in vitro 59

3.2. ZBTB4 и ZBTB38 связывают метилированую ДНК in vivo 64

3.3 ZBTB4 и ZBTB38 являются метил-зависимыми репрессорами 70

3.4. Картина экспрессии ZBTB4 и ZBTB38 76

Заключение 77

Выводы 81

Благодарности 82

Список Литературы

Введение к работе

Клетки многоклеточного организма генетически одинаковы, но в тоже время отличаются друг от друга, как структурно, так и функционально благодаря различной экспрессии генов. Многие отличия в экспрессии генов возникают в процессе развития организма и сохраняются во время митоза. Подобные стабильные изменения называются "эпигенетическими", при наследовании таких изменений не возникают мутации в последовательности ДНК. Исследования последних лет были нацелены на изучение двух молекулярных механизмов, которые лежат в основе эпигенетики: метилирования ДНК и модификации гистонов. Оба этих механизма являются критическими в раннем эмбриогенезе и гаметогенезе, для тканеспецифической экспрессии генов. Также эпигенетические механизмы защищают организм от вирусных геномов, которые могли бы направить работу клетки в своих целях. Нарушения в структуре хроматина могут привести к глобальным изменениям процесса развития организма, например, может быть нарушена инактивация Х-хромосомы, геномный импринтинг, могут развиваться различные заболевания. Так, показано, что экспрессия специфичного для мышей ретротранспозонного элемента ІАР в отсутствии метилирования возрастает примерно в 100 раз (1). Необходимость репрессии транскрипции транспозонов связана либо с ограждением организма от спонтанных перестроек, которые, хотя и не наследуются, но могут привести к развитию ряда генетических заболеваний; либо с понижением уровня транскрипционного шума, который может быть создан экспрессией многочисленных мобильных элементов.

Понимание процессов эпигенетического репрограммирования, изучение белков вовлеченных в этот механизм является важным для лечения многих заболеваний (рак (2), задержка умственного развития), которые связаны с изменением статуса метилирования ДНК или структуры хроматина.

Известно, что метилирование ДНК часто связано с подавлением транскрипции. Метилирование промоторных участков вызывает сильное и наследуемое подавление транскрипции определенных генов (3). Понимание механизма метил-чувствительной репрессии пришло в связи с открытием белков, которые могут распознавать метилированую ДНК и подавлять транскрипцию. У позвоночных белки, содержащие метил-ДНК-связывающий домен (MBD домен), представляют большой класс белков (MBD1, МеСР2, MBD2, MBD3, MBD4), которые могут связываться с одиночными метилироваными CpG парами и которые участвуют во многих процессах: в контроле стабильности генома, раннем эмбриональном развитии, созревании нейронов, дифференцировке Т клеток и др. (4). Но с другой стороны MBD белки не являются единственными, распознающими метилированую ДНК; белок Kaiso взаимодействует с метилироваными CGCG с помощью трех цинковых пальцев (5), а не за счет MBD домена. Кроме этого Kaiso может взаимодействовать и с неметилированой последовательностью TCCTGCNA (6). На данный момент возможно существование и других метил-ДНК связывающихся белков, так как по нашим данным в клеточных линиях, в которых отсутствуют MBD1, MBD2, Меср2 и Kaiso по-прежнему наблюдаются белки с метил-специфической активностью. В данной работе проведен поиск, изучение и характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков.

ДНК метилтрансферазы. Защита от de novo метилирования

Некоторые исследователи предполагают, что аномальный тип метилирования генома, наблюдаемый в опухолях, у старых животных и в культурах клеток может возникать в результате de novo метилирования ДНК метилтрансферазой, подвергшейся протеолизу in vivo (19). Активность метилтрансферазы варьируется в процессе клеточного цикла, наименьшая в G1 фазе, увеличивается к S- фазе и опять падает в G2/M (17). Нокаут Dnmtl приводит глобальному деметилированию и эмбриональной летальности во время гестации (20,21). Это говорит о том, что метилирование действительно важно для млекопитающих. Dnmtl во время S-фазы локализуется в репликационных участках, в то время как в оплодотворенных яйцеклетках Dnmtl хранится в цитоплазме, что способствует пассивному деметилированию при делении. Показано, что Dnmtl может взаимодействовать с ферментами, модифицирующими гистоны, например с гистоновой метилтрансферазой SUV39H1(22)H гистон-деацетилазами HDAC1 и HDAC2. Кроме этого, Dnmtl взаимодействует с различными метил-ДНК связывающимися белками: Mbd2, Mbd3, МеСР2 (23), а также с белком НР1, который связывается с гетерохроматином, в частности с девятым метилированым лизином гистона Н3(22). Оказалось, что Dnmtl имеет несколько стартов для трансляции. Одна из получаемых изоформ - это Dnmtl о, которая укорочена с N-конца на 114 аминокислотных остатков. Эта изоформа экспрессируется только в ооцитах и обладает повышенной устойчивостью к деградации (24). Такая стабильность Dnmtlo позволяет организовать запас этой ДНК метилтрансферазы в ооците, таким образом этот фермент оказывается доступен на стадии 8 клеток эмбриона; на этой стадии Dnmto участвует в материнском импринтинге (25).

Dnmt3a и Dnmt3b экспрессируются на высоком уровне в развивающемся эмбрионе мыши и ответственны за глобальное de novo метилирование после имплантации (26). Оба Dnmt3 фермента гомологичны между собой, но кодируются разными генами. N-концевой участок Dnmt3 содержит PWWP домен и PHD домен. PHD домен состоит примерно из 50 аминокислот представляет из себя Cys4-HisCys3 цинк-связывающий мотив. Для Dnmt3a PHD достаточен для репрессии транскрипции вне зависимости от метилтрансферазной активности. PWWP домен может связываться с ДНК, и по всей видимости, именно этот домен отвечает за привлечение к хроматину de novo метилтрансфераз. Dnmt3a и Dnmt3b могут метилировать как неметилированые, так и полуметилированые CpG динуклеотиды (27), не отдавая предпочтения полуметилированым участкам, как в случае с Dnmtl. При нокауте Dnmt3a и Dnmt3b мышь умирает.

В мышиных клетках Dnmt3a и Dnmt3b могут локализоваться на участках в перицентромерном хроматине. Причем PWWP необходим для привлечения к данному участку генома каталитической активности. Важность данного домена была подтверждена нахождением мутации в PWWP домене Dnmt3b. Такая мутация приводит к редкому аутосомному заболеванию - иммунодефициту, для которого характерно гипометилирование перицентромерных сателлитных участков (28). В результате этой мутации нарушается способность Dnmt3b связываться с ДНК в культуре клеток, а также наблюдается снижение уровня метилирования сателлитной ДНК в пациентах. Таким образом, хотя Dnmt3a и Dnmt3b очень похожи, однако они не взаимозаменяемы. Поскольку в этих пациентах Dnmt3a не нарушен, но болезнь развивается, следовательно Dnmt3a не может компенсировать отсутствие Dnmt3b.

Третий белок из семейства Dnmt3 ферментов - Dnmt3L, который не обладает метил-ДНК трансферазной активностью. Dnmt3L экспрессируется во время гаметогенеза в эмбрионе, таким образом картина экспрессии Dnmt3L совпадает с экспрессией Dnmt3a и Dnmt3b. Кроме этого, Dnmt3L может взаимодействовать с Dnmt3a и Dnmt3b. Как оказалось, делеция Dnmt3L приводит к тому что, LTR и другие ретротраспозоны не метилируются de novo, также нарушается не только отцовский импринтинг, но и возникают проблемы с метилированием в неперецентральных областях гетерохроматина. Кроме этого, удаление Dnmt3L приводит к тому, что сперматозоиды не могут участвовать в мейозе, и поэтому самцы, несущие такую делецию стерильны (29,30) (таблица 1).

Последний представитель класса ДНК-метилтрансфераз - это Dnmt2. Было показано, что Dnmt2 имеет очень слабую ДНК-метилтрансферазную активность in vitro (32), а нокаут Dnmt2 гена в эмбриональных стволовых клетках не привёл к каким-либо изменениям в картине метилирования ДНК (31).

Каким образом протяженным участкам длиной несколько тысяч пар оснований удается избежать метилирования в период de novo метилирования в предимплантационом эмбрионе остается до сих пор неясным. Было показано, что ДНК метилируется при попадании в ES клетки (эмбриональные стволовые клетки), но CpG-островки не метилируются (33). Возможно, что данные последовательности могут связываться с некими транскрипционными факторами (например, Spl) или обладать такой конформацией, которая препятствует их метилированию. Так сравнительно недавно было показано, что наличие сайта для белка CTCF, защищает себя и прилежащие участки от метилирования (34).

Модификации гистонов. Связь метилирования ДНК и модификаций гистонов

Основной структурой хроматина является нуклеосома, представляющая собой октамер четырех коровых гистонов (Н2А, Н2В, НЗ и Н4), вокруг которых уложено 147 пн ДНК. Каждый гистон представляет собой глобулярный домен и не структурированную N-концевую часть. К настоящему времени известно большое количество модификаций N-концевой части гистонов: метилирование, ацетилирование, фосфорилирование, убиквитинирование. Модификация гистонов влияет на состояние хроматина, доступность к ДНК. В результате модификации гистонов в зависимости от положения и вида модификации может происходить либо активация, либо подавление транскрипции за счет связывания определенных белков с той или иной модификацией гистона. Так бромодомены взаимодействуют с ацетилированым лизином; хромодомены с метилированым лизином; тьюдор домены с метилированым лизином и аргинином. Фосфорилирование тирозина, серина, треонина и убиквитинилирование лизина также распознается определенными доменами.

Ацетилирование и деацетилирование гистонов определяют транскрипционную активность хроматина. Так гистон НЗ может быть ацетилирован по следующим положениям лизина: К9, К14, К18 и К23; гистон Н4 - по остаткам К5, К8, К12, К16. Ацетилирование положительно заряженных остатков лизина приводит к нарушению взаимодействия гистонов с ДНК и, как следствие, к образованию менее компактной структуры хроматина, что приводит к доступности ДНК для транскрипционной машины. Хотя с другой стороны ацетилирование лизинов в гистонах Н2А (К7) и Н2В (КП, К16) в регуляторных районах определённых генов ассоциировано с подавлением транскрипции.

Метилирование гистонов возникает как в остатках лизина, так и аргинина. Так, для гистона Н4 показано метилирование по 20 лизину и третьему аргинину; для гистона НЗ наиболее хорошо охарактеризованы модификации по лизинам К4, К9, К27, К36, К79 и аргининам 2, 17, 26. Каждый из лизинов может быть моно-, ди- и триметилирован. Метилирование лизинов может быть связано как с активацией, так и с подавлением транскрипции, в зависимости от сайта и вида метилирования. В определенных случаях (например, Х-инактивация) метилирование одного и того же лизина может приводить к различным последствиям в зависимости от количества добавленных метильных групп (57). Метилирование остатков лизина в положениях девятом и двадцать седьмом сопряжено с репрессией транскрипции, тогда как метилирование лизинов в положениях К4 и К36 - с активным статусом хроматина. Так, хотя наличие метилированого НЗ К4 в хроматине коррелирует с экспрессией анализированных генов, высокая концентрация как ди-, так и триметилированного НЗ К4 наблюдается только в 5 -районе экспрессирующихся генов и постепенно понижается по мере продвижения к 3 концу (58). Это может свидетельствует о том, что метилирование НЗ К4 в геноме позвоночных является либо маркёром для РНК-полимеразы II, либо необходимо для инициации транскрипции, поскольку комплекс, содержащий РНК-полимеразу II, сам обладает хроматин-ремоделирующей активностью. В пользу этого предположения говорят и исследования, в которых было показано, что метилирование НЗ К4 запрещает взаимодействие с данным участком хроматина комплекса NuRD, связывание которого приводит к изменению структуры хроматина с «открытой» активной на «закрытую» пассивную (59).

Как уже было отмечено, метилирование гистона НЗ в положении К9 является маркёром неактивного хроматина. Сама модификация создаёт возможность для связывания ассоциированных с хроматином белков (например, белка НР1) и, таким образом, формирования стабильного гетерохроматина. Проведённые исследования на эмбриональных стволовых клетках, имеющих гомозиготный нокаутный по гистон-метилтрансферазе Suv39h генотип, подтвердили важность участия метилирования НЗ К9 в создании постоянного неактивного статуса перицентромерного гетерохроматина. Было показано, что перицентромерный гетерохроматин в клетках дикого типа обогащен триметилированным К9 и монометилированным К27 гистона НЗ. Отсутствие Suv39h ведёт к смещению от высокой концентрации триметилированного девятого лизина к высокой концентрации монометилированного. Одновременно с этим была зарегистрирована конверсия монометилированного К27 в триметилированный. Данное наблюдение подтверждает существование «пластичности» и «взаимосвязанности» в системах метилирования гистонов (60). Кроме того, было продемонстрировано участие гистон-метилтрансфераз в поддержании нормальной длины теломерных повторов и формировании теломерного гетерохроматина (61), а также ассоциированность метилирования по остатку К27 гистона НЗ с инактивированой Х-хромосомой (60).

Олигонуклеотиды, использованные для РТ-ПЦР

Лигированый в соответствующий вектор ПЦР-продукт смешивали с компетентными клетками E.coli, инкубировали на льду в течение 15 минут. Затем клетки подвергали тепловому шоку при 42 С в течение 1 минуты 30 секунд, после чего дополнительно инкубировали на льду в течение 2 минут. Далее к трансформированым клеткам добавляли 1 мл среды LB (на 1 литр: бакто триптон-10 гр, бакто-дрожжевой экстракт-5гр, NaCl-10 гр), инкубировали при 37 С в течение часа и высаживали на LB-arap (LB-среда + 15 гр палитр агара) с соответствующим антибиотиком. Колонии выращивали в течение ночи при 37 С. На следующий день бактериальные колонии переносили каждую в 2 мл среды LB, содержащей необходимый антибиотик, и растили в течение ночи при 37 С при постоянном покачивании. Затем клетки осаждали центрифугированием в настольной центрифуге на максимальных оборотах в течение 30 секунд. Осадок ресуспендировали в 100 мкл буфера I (50 мМ Трис-НС1, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ глюкоза, 100мкг/мл РНКаза А), после чего добавляли 200 мкл лизирующего буфера II (1% SDS, 0,2 M NaOH). Тщательно перемешивали и добавляли 150 мкл нейтрализующего буфера НІ (З М ацетат калия). Растворы перемешивали, встряхивая микропробирку несколько раз, после чего образцы центрифугировали в течение 15 минут в настольной центрифуге на максимальных оборотах. Супернатант переносили в новую микроцентрифужную пробирку, туда же добавляли 2 объёма этанола и высаживали плазмидную ДНК центрифугированием в течение 15 минут на 12000 g. Осадок промывали в 75% этаноле, высушивали на воздухе при комнатной температуре и растворяли в деионизованой воде.

Получение компетентных клеток.

Клетки XL 1 blue высаживали штрихом на чашку с тетрациклином. Затем брали несколько колоний и высаживали в 2 мл LB с тетрациклином на ночь на +37С с постоянным покачиванием. Полученную ночную культуру переносили в колбу с 200 мл LB с тетрациклином, которую ставили на +37С с постоянным покачиванием. Через 3 часа отбирала из неё 2 мл выросшей культуры и переносили в свежие 200 мл LB с тетрациклином и покачивали на +37С до ODWK)= 0,30-0,35. Далее всё делалось на холоду. Колбу охлаждали в 20-30 минут , перемешивая каждые 5-10 минут. Помещали выросшие клетки в охлажденные пробирки, центрифугировали 10 минут при +4С 3000 об/мин. К осадку клеток добавляли 50 мл раствора RF1 (ЮОмМ RbCl4, 50мМ МпСЬ, ЮмМ СаСЬ, ЗОмМ ацетат калия, 15% глицерин, рН 5,8 доводили уксусной кислотой до добавления глицерина, фильтровали через 0,22 мкр фильтр). Держали 15 минут на холоду. Затем центрифугировали 10 минут при +4С 3000 об/мин. Осадок клеток ресуспендировали в 5 мл раствора RF2 (10 мМ RbCl4, 10 мМ MOPS, 75мМ СаС12, 15% глицерин, рН 6,8 доводили NaoH до добавления глицерина, фильтровали через 0,22 мкр фильтр). Инкубировали 15 минут на холоду, фасовали по 100 мкл в охлажденные микропробирки и замораживали в жидком азоте. Хранили полученные компетентные клетки на -70С. 2.5. Клонирование ПЦР-продукта

Свежесинтезированный ПЦР-продукт чистили в агарозном геле или из рестрикционои смеси с помощью кита для очистки ПЦР-продукта QAIquick PCR-purification kit (Qiagen) или кита для элюции ДНК из геля QAIquick Gel-extraction kit (Qiagen Cat.N» 28706) согласно протоколам фирмы-производителя. Полученный фрагмент лигировали в соответствующий вектор. Условия лигирования: 1х буфер для лигирования (400мМ трис-НС1, 100MMMgCl2, IOOMMDTT, 5ММ ATP (рН 7.8 at 25С)), 50 нг вектора, вставка, 1 ед. Т4 ДНК-лигазы (Fermentas); инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Полученным конструктом трансформировали компетентные клетки Е.соИ, штамм XL 1 blue. Плазмиды, содержащие вставку, отбирали с помощью рестрикционого анализа: в течение часа инкубировали аликвоту выделенной плазмиды с соответствующими эндонуклеазами рестрикции (фирмы Fermentas) в буфере, рекомендованном производителем. После чего анализировали продукты реакции в 1 % агарозном геле, приготовленном на ТАЕ буфере (40 мМ Трис-ацетат рН 7.6; 1 мМ ЭДТА).

Получение радиоактивно меченых ДНК-зондов для экспериментов по торможению ДНК-белковых комплексов в геле Фрагмент гена lacZ был амплифицирован с помощью праймеров lacZ_for, lacZ_rev и использован в качестве пробы. Одноцепочечные праймеры, соответствующие неметилированой пробе CG (CpG_for/CpG_rev), полуметилированой CpG (HemimethylCpG_for/ HemimethylCpG_rev), метилированой CpG (MethylCpG_for/ MethylCpG_rev), метилированой СрА (MethylCpA_for/ MethyICpA_rev), метилированой CCTGG (MethylCCTGG_for/ MethylCCTGG_rev), последовательности матрилизина (KBS_for/ KBS_rev), мутантной последовательности матрилизина (MutKBS_for/ MutKBS_rev) были нагреты в 50 мМ NaCl до 95С и затем были отожжены друг на друге в процессе медленного остывания.

Метилирование lacZ ДНК-зонда проводили в следующих условиях: 5 -10 пМоль ДНК-зонда, lx NE буфер 2 (50мМ NaCl, ЮмМ Трис-HCl рН 7.9, ЮмМ MgCb, 1мМ DTT), 10 ед. Sss I метилазы (New England Biolabs, Cat.№ M0226L), 3.7мМ S-аденозилметионин; инкубировали 16 часов при 37 С. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до 5 мМ с последующей инкубацией на 65 С в течение 10 минут. Метилированый ДНК-зонд осаждали этиловым спиртом. Полноту метилирования проверяли рестрикционым анализом с использованием метил чувствительной рестриктазы НраІІ или метил нечувствительной рестриктазы Mspl.

ZBTB4 и ZBTB38 связывают метилированую ДНК in vivo

В то время как уменьшение метилированых цитозинов по пятому положению в геноме в результате нокаута гена метил-ДНК-трансферазы dnmt-1 приводит к смерти эмбриона в середине гестации. Одним из возможных объяснений является взаимозаменяемость данных метил-ДНК-связывающих белков. Однако, недавно было показано, что мышь, в которой путем генетического нокаута удалили гены этих трех метил-ДНК-связывающихся белков, развивалась нормально в течение всего эмбрионального периода. Фенотип такой взрослой мыши был практически такой же как и у мыши нокаутной по МеСР2 гену, т.е. с симптомами характерными для Ретт синдрома. Более того в лаборатории профессора Берда (Adrian Bird) на основе siRNA была получена клеточная линия фибробластов из клеток хвоста мыши (нокаутной по Mbd2, МеСР2, Kaiso генам), в которой отсутствовал белок Mbdl (Helle Jorgensen&Adrian Bird, personal communication). Поэтому, вероятно, что данные белки являются не единственными белками, которые могут воспринимать метилированую ДНК.

В данной работе на основе поиска по базе данных данных NCBI, RefSeq проект были найдены два белка, гомологичные Kaiso: ZBTB4 и ZBTB38. Эти белки имеют три гомологичных цинковых пальца и похожую доменную структуру всего белка : на N-конце все три белка содержат BTB/POZ домен. ZBTB4 и ZBTB38 более схожи друг с другом, чем с Kaiso. Возможно эти семейства генов являются результатом двух расхождений от одного общего гена: первое привело к происхождению Kaiso-предшественника и ZBTB4/ZBTB38-npefliuecTBeHHHKa. гВТВ4/гВТВ38-предшественник в свою очередь привел к образованию ZBTB4 и ZBTB38. Данная работа показала, что все три белка связываются с метилированой ДНК. Этот факт говорит в пользу того, что вероятно, общий предшественник данных генов также был наделен этим свойством взаимодействовать с метилированой ДНК, и такая способность связывать метилированую ДНК с помощью цинковых пальцев должна существовать в целом ряде организмов. Практически во всех видах позвоночных были найдены ортологи ZBTB4 и ZBTB38, таким образом можно выделить два семейства: одно содержит ZBTB4, другое ZBTB38. И хотя у некоторых организмов и не были идентифицированы гены того или иного семейства, скорей всего это связано с незаконченностью геномых проектов для данных видов.

Эксперименты по задержке подвижности комплексов белок-ДНК показали, что ZBTB4, также как и Kaiso, обладает сродством к нескольким последовательностям ДНК. In vitro, три цинковых пальца ZBTB4, гомологичные цинковым пальцам Kaiso, могут взаимодействовать как с метилированой ДНК, так и с неметилированым KBS сайтом. Кроме этого, ZBTB4 содержит ещё три дополнительных цинковых пальца (рис.8), которые возможно могут участвовать в распознавании ещё какой-либо последовательности. Такая картина имеет место для ZBTB38 (105). Zenon является крысиным гомологом ZBTB38. Как было показано в работе (105) Zenon связывается с неметилированой ДНК, а точнее с Е-боксом CACCTG. Таким образом, и ZBTB4, и ZBTB38 связываются не только с метилированой ДНК, но и с определенными неметилироваными последовательностями.

Если же рассматривать только свойства данных белков связывать метилированую ДНК, то ZBTB4 и ZBTB38 ведут себя также как и MBD белки: связывают метилированые CpG in vitro, привлекаются на хромоцентры в мышиных клетках и подавляют транскрипцию с метилированой матрицы. Выводы. -найдены два новых гомолога Kaiso: ZBTB4 и ZBTB38, у которых гомологичны три цинковые пальца и N-концевые BTB/POZ домены - показано, что ZBTB4 и ZBTB38 связываются с метилированой ДНК in vitro, причем для связывания достаточно одного метилированого CpG; кроме этого ZBTB4 имеет сродство и к неметилированому KBS сайту, также как и Kaiso - показано, что ZBTB4 и ZBTB38 связываются с метилированой ДНК in vivo. Данные белки привлекаются к метилированым хромоцентрам и взаимодействуют с метилированым DMR локуса H19/IGF2; при отсутствии метилирования в клетках dnmtl-/- данные белки уже не связываются с хромоцентрами - показано, что ZBTB4 и ZBTB38 являются метилчувствительными репрессорами, причем для эффективной репрессии ZBTB4 достаточно трех цинковых пальцев, в то время как для ZBTB38 необходимы как цинковые пальцы, так и BTB/POZ домен. ZBTB4 является более сильным репрессором, чем ZBTB38

Похожие диссертации на Характеристика нового семейства метил-ДНК связывающих белков, содержащих POZ-домен и цинковые пальцы