Содержание к диссертации
Используемые сокращения 6
Введение 7
1. Обзор литературы 9
1.1 Белки MBD семейства 9
1.2. Белок Каизо и его особенности 11
ДНК- связывающий домен цинковые пальцы 13
р120- катенин и его особенности 21
Белки NF-kB и IkB семейств: роль и регуляция 29
Регуляция ядерного транспорта: NLS, NES и их регуляция 34
Дрожжевая другибрндная система 39
2. Материалы и методы 43
Методики 43
Полимеразная цепная реакция 43
Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 43
Бактериальные штаммы и плазмиды 43
Конструкции 44
Конструкции, использованные в экспериментах по определению клеточной локализации Каизо 44
Конструкции для поиска сигнала ядерной локализации 45
Конструкции для дрожжевой двугибридной системы 46
Конструкции, использованные в экспериментах по иммунопреципитации. 48
Получение конструкций, кодирующих функциональные домены Каизо с N- концевым FLAG и С- концевым НА пептидами 49
2.5.6. Получение конструкций для эксперимента по in vitro фосфорилированию
Каизо 50
2.6 Работа с дрожжами 50
Культивирование дрожжей .50
Получение дрожжевых компетентных клеток 51
Трансформация дрожжевых компетентных клеток 52
Маттинг 52
Выделение ядерных белковых экстрактов 52
Гель- фильтрационная хроматография 53
Вестерн блот- гибридизация со специфическими антителами 54
Иммунопреципитация и разделение белков в денатурирующем SDS- ПААГ. 55
Клеточные линии и трансфекции 56
Иммунофлуоресцентный анализ 56
Экспрессия рекомбинантных белков 57
Эксперимент по задержке ДНК- белковых комплексов в геле 58
Анализ статуса фосфорилирования белка Каизо 59
Дефосфорилирование с помощью Х- фосфатазы 59
Мечение белков 32Р in vivo 59
Получение пептидов при помощи обработки трипсином 60
Картирование фосфорилированных пептидов 61
Анализ фосфорилирования аминокислот 62
Анализ статуса фосфорилирования функциональных доменов белка
Каизо 62
2.15.7. In vitro фосфорнлирование Каизо 63
Метилирование ДНК с помощью SssI- метилазы 63
Тест на способность Каизо функционировать как метил- зависимый репрессор 63
Тест на способность Каизо функционировать как метил- зависимый активатор 64
3. Результаты и их обсуждение 66
Каизо и р120 находятся в разных белковых комплексах в ядерных экстрактах клеток эритролейкемии человека К562 66
Каизо подвергается пост- трансляционной модификации 68
Каизо фосфорилирован по остаткам серина 69
Каизо содержит 2 или 3 сайта фосфорилирования 72
Каизо фосфорилирован по остаткам серина, расположенным в BTB/POZ домене 73
МарКарКЗ киназа не фосфорилирует Каизо in vitro 75
Фосфорилирование белка Каизо по остаткам серина, расположенным в BTB/POZ домене не препятствует связыванию Каизо с р120 77
В дифференцированных клетках линии РС12 Каизо распределен по всей клетке 78
Клеточная локализация Каизо регулируется ингибитором NF-kB (IkB). 79
Характеристика сигнала ядерной локализации Каизо 82
Анализ взаимодействия Каизо с р120 в дрожжевой двугибридной системе. 86
р120 способен маскировать сигнал ядерной локализации белка Каизо. 91
Влияние р120 на функциональную активность белка Каизо 93
3.14 Уровень и клеточная локализация катенина р120 не изменены при
генетическом нокауте Каизо 103
Выводы 105
Список литературы 106
Используемые сокращения
DMEM- среда Дульбекко, модифицированная Иглом
dNTP- смесь дезоксирибонулеотид трифосфатов
DTT- дитиотрейтол
PMSF- фенилметилсульфонилфлюорид
SDS- додецил сульфат натрия
ПААГ- полиакриламидный гель
PBS- фосфатный солевой буфер
ПЦР- полимеразная цепная реакция
Tris- (гидроксиметил)- метиламин
HEPES- Ы-2-гидроксиэтилпиперазин->Г-2-этансульфоновая кислота
ЭДТА- этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭГТА- (этилендиокси)-диэтилендинитрилотетрауксусная кислота
ИПТГ- изопропил-тио-Р-галактозид
кДа- кило Дальтон
CG пара- ЦфГ динуклеотид
Введение к работе
Одним из ключевых направлений молекулярной биологии является исследование строения и функций белков, связанных с злокачественным перерождением клеток. Поэтому изучение взаимодействия двух белков непосредственно вовлеченных в опухолеобразование кажется вдвойне интересным.
Р", у- катенины, а также р120- это семейство многофункциональных белков, содержащих в своем составе так называемый Arm- домен, состоящий из 10 или более Arm повторов. Эти белки входят в состав мультибелковых катенин- кадхериповых комплексов, основным составляющим которых является трансмембранный гликопротеин Е-кадхерин, обеспечивающий межклеточную систему адгезии эпителиальных клеток, посредством взаимодействий своих внеклеточных доменов. Нарушение функционирования этой системы, связанное с дефектами каких- либо компонентов связывают с метастатическим фенотипом в 50% случаев карцином человека. Ключевая роль катенина р120 заключается в его способности посттрансляционно стабилизировать Е- кадхерин и влиять на силу адгезии клеток, а также регулировать динамику цитоскелета.
Каизо, новый член семейства BTB/POZ домен содержащих транскрипционных факторов, был впервые охарактеризован как партнер р120 в дрожжевой двугибридной системе. У позвоночных, большинство BTB/POZ белков (HIC-1, BcI-6, PLZF, ZF5, MIZ-1) являются регуляторами транскрипции и ассоциируются либо с ростом, либо подавлением роста опухолей. Лучше всего это показано на примере Вс1-6- белка, прямо ответственного за возникновение лимфом В- клеток. Вс1-6 является транскрипционным репрессором различных генов, включая циклины D1 и D2.
Каизо также является репрессором транскрипции, причем Каизо специфически связывает метилированную ДНК посредством трех доменов «цинковые пальцы» С2Н2
типа. Как было показано мыши, с генетически удаленным геном Каизо приобретают устойчивость к возникновению рака кишечника.
Исходя из выше сказанного, возрастает важность изучения взаимодействия Каизо и катенина р120, особенно если предположить существование некоторого сигнального пути, ответственного за передачу сигналов с поверхности клетки в ядро, приводящего к выключению некоторых метилированных генов. Предположительно, не только Каизо с р120, но и Е-кадхерин могут являться компонентами такого сигнального каскада. Таким образом, становиться понятно, что изучение подобного взаимодействия способно внести существенный вклад в понимание процессов как опухолеобразования, так и функционирования нормальной соматической/ эмбриональной клетки при транслировании эпигенетической информации.
Похожие диссертации на Определение функциональной значимости взаимодействия катенина р120 с метил-ДНК связывающим белком Каизо
