Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУШ 6
I. Бактериородопсин - светозависимый протонный
насос 6
1.1. Halobacterium Halobium б
-
Фотофизиология Halobacterium Halobium ... б
-
Реконструкция протонного насоса и фотофосфо-рялирование в модельных системах 7
2. Структурные основы функционирования бактерио
родопсина 7
-
Структура пурпурных мембран .7
-
Аминокислотная последовательность 9
3. Фотохимические свойства бактериородопсина ... 9
3.1. Изомеры ретиналя и реакция фотоизомеризации
в бактериородопсине 9
3.2. Фотохимический цикл бактериородопсина .... 12
4. Структура хромофорного центра бактериородопсина 15
-
Спектры поглощения и модели хромофорного центра ретинальсодержащих белков 15
-
Модификации хромофорного центра бактериородопсина - как метод его изучения 19
5. Применение методов пикосекуццной спектроскопии и резонансного комбинационного рассеяния для
исследования ретинальсодержащих белков .... 22
-
Пикосекундная спектроскопия и модели первичных процессов ..... 22
-
Резонансное комбинационное рассеяние .... 24
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЗО
I. Приготовление образцов ЗО
-
Выделение пурпурных мембран 30
-
Приготовление суспензий и пленок пурпурных мембран 31
2. Приборы и техника эксперимента 32
-
Пикосекундная спектроскопия 32
-
Фотостационарная низкотемпературная спектроскопия 33
-
Резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния 38
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЗДЕНИЕ 44
I. Исследование первичной реакции в бактериоро-
допсине 44
2. Влияние дегидратации на бактериородопсин ... 53
-
Влияние дегидратации на спектры поглощения в видимой и ИК областях спектра 54
-
Фотоактивность при комнатной температуре . . 62
2.3. Фотоактивность при низких температурах ... 69
3. Влияние дегидратации на хромофорный центр
бактериородопсина (по данным резонансного
комбинационного рассеяния света) 76
ВЫВОДЫ 84
ЛИТЕРАТУРА 86
Введение к работе
Актуальность проблемы
Бактериородопсин (БР) является одним из наиболее изученных мембранных белков. Особый интерес к БР объясняется следующими основными причинами: I) БР - единственный белковый компонент определенных участков клеточной мембраны (так называемых пурпурных мембран) галофильных микроорганизмов Halobacte-rium Haiobium и представляет собой протонную транслоказу, которая использует в качестве источника энергии свет; 2) по своей структуре БР сходен с родопсином позвоночных, что дает возможность для их сравнительного изучения.
За поглощение света ответственен хромофорный центр БР. Изменения в структуре хромофорного центра после поглощения света сопровождаются определенной последовательностью спектральных превращений. БР и родопсин обладают сходными фотохимическими свойствами, однако исходно существует различие в изомерной форме остатков ретиналей, которые являются хромофорами этих белков. Известно, что пурпурные мембраны, адаптированные к темноте, содержат смесь 13-цис БР и полностью - транс БР, а спектральные изменения, сопровождающие первичную реакцию для этих молекул, близки. В связи с этим возникает вопрос о реакции фотоизомеризации как первичной, запускающей все последующие химические реакции в родопсине и БР. В настоящее время не выяснено, какова роль существования цис и транс форм БР и зависимого от света изменения соотношения этих форм. Не достаточно хорошо изучено, как сказывается на спектральных характеристиках БР изменение изомерного состояния остатка ретиналя и его взаимодействие с функциональными группами белка.
Данная работа посвящена изучению методами оптической спектроскопии роли изомерного состояния остатка ретиналя и ближайшего к нему белкового окружения в фотохимических процессах в БР. В связи с этим были поставлены следующие основные задачи:
Исследовать первичную реакцию в БР.
Изучить действие дегидратации, приводящей к ингибиро-ванию реакции 13-цис —полностью транс фотоизомеризации, на фотохимический цикл БР.
Исследовать изменения в структуре хромофорного центра БР, вызванные дегидратацией пурпурных мембран.
В данной работе проведено исследование фотообратимости первичной реакции в БР. На основании полученных данных предложена энергетическая схема первичных процессов в БР, которая отличается от схем, приводимых ранее. Проведено детальное изучение действия дегидратации на хромофорный центр БР. В ходе работы были разработаны и успешно применены такие методы исследования, как получение спектров резонансного комбинационного рассеяния света от твердых фотоактивных образцов, фиксация определенного количества влаги на образце при низкой температуре.
