Введение к работе
Актуальность проблемы. Биолюминесцентная система Са2+-регулируемых фотопротеинов морских кишечнополостных организмов является на сегодняшний день одной из наиболее изученных. Уникальность этих белков состоит в том, что они представляют собой устойчивый фермент-субстратный комплекс из одноцепочечного нолипептида (около 20 кДа), целентеразина и кислорода. Присоединение ионов кальция вызывает конформационные перестройки в белке, в результате которых практически мгновенно развивается реакция окислительного декарбоксилирования целентеразина, продуктами которой являются целентерамид, СОг и квант света в голубой области спектра. Несмотря на то, что, на данный момент накоплены глубокие знания о структуре и свойствах фотопротеинов, остаётся невыясненной роль ключевых аминокислотных остатков активного центра в осуществлении биолюминесцентной функции фотопротеинов.
В 2000г. были установлены пространственные структуры двух фотопротеинов - акворина из медузы Aequoria victoria и обелина из гидроидного полипа Obelia longissima. Показано, что в обоих белках субстрат локализован в виде пероксицелентеразина внутри гидрофобной полости белковой глобулы нековалентными связями. Среди аминокислотных остатков, участвующих в локализации пероксицелентеразина, в обоих белках находятся 4 триптофаповых остатка, образующих «сэндвич»-структуры с ароматическими остатками молекулы целентеразина. Эти триптофановые остатки являются строго консервативными среди всех фотопротеинов, для которых к настоящему времени определены аминокислотные последовательности.
Цели и задачи исследования. Целью представленной работы являлось определение роли триптофаповых остатков активного центра в биолюминесцентной реакции Са2+-регулирусмого фотопротеина обелина на основе исследования основных физико-химических свойств мутантных форм обелина с разными заменами триптофановых остатков активного центра.
Выполнение данного исследования требовало:
-
Выделить в чистом виде мутантные формы рекомбинантного фотопротеина обелина, имеющие замены по триптофановым остаткам активного центра на фенилаланин, и мутантные формы, имеющие замены по 92-му триптофановому остатку на гистидин, аргинин, лизин и глутаминовую кислоту.
-
Исследовать основные характеристики полученных мутантных форм рекомбинантного обелина: скорость и эффективность образования фермент-субстратного комплекса, стабильность образованного фотопротеина, его биолюминесцентная активность, а также спектральные характеристики биолюминесценции, поглощения и флуоресценции.
-
Сравнить полученные данные с физико-химическими свойствами обелина дикого типа. На основе влияния той или иной мутации на
РОС национальная] ивлмотека I
основные характеристики обелина установить функцию триптофановых остатков активного центра. При решении поставленных задач получены результаты, которые выносятся на защиту:
-
Замена 114-го и 135-го триптофановых остатков активного центра обелина, локализованных у 2-гидроксибензильной группы целентеразина, приводят к существенному уменьшению способности апобелков образовывать устойчивые фотопротеиновые комплексы и резкому падению специфической активности, что свидетельствует о важной роли этих остатков в локализации молекулы целентеразина.
-
Замены 92-го триптофанового остатка обелина, который локализован у 6-п-гидроксифенильной группы целентеразина, приводят к изменению спектральных характеристик биолюминесценции. Это изменение связано со сдвигом равновесия между таутомерными формами эмиттера - фенолят-анионом в ион-парном состоянии (Х,„ах = 475 нм) и нейтральной формой (hmx - 390 нм) возбужденной молекулы целентерамида. Тгр92 участвует в формировании структуры молекулы-эмиттера.
III. Предложена гипотеза, согласно которой финальной стадией образования эмиттера биолюминесцентной реакции Са2+-регулируемых фотопротеинов является перенос протона 6-п-гидроксифенильной группы возбужденного целентерамида на His22, эффективность которого регулируется водородной связью между атомом азота индольного кольца и 6-п-гидроксифенильной группой целентеразина.
Научная новизна и практическая ценность. Все результаты данной работы получены впервые и перспективны для использования в фундаментальных и в прикладных исследованиях. Высокая скорость биолюминесцентного ответа и высокая чувствительность к ионам Са2+ в сочетании с разными спектральными характеристиками некоторых полученных мутантных белков делают их перспективными для использования в качестве индикаторов для одновременного изучения кальциевых потоков в различных клеточных органеллах. Это позволит оценить функционально связанные переходы кальция в разных частях клетки и углубить понимание регуляторной функции ионов кальция в различных клеточных процессах. Также перспективным может быть использование мутантов обелина с изменёнными спектральными характеристиками как меток в иммуноанализе для одновременного определения нескольких антигенов с регистрацией сигнала на разных длинах волн.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на ХН-м Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Кэмбридж, Великобритания, 2002) и на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы.
Структура и объём работы. Работа изложена на 93 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключение, выводы и список цитируемой литературы (80 источников). Диссертационная работа проиллюстрирована 32 рисунками, содержит 11 таблиц.
