Содержание к диссертации
Введение
2.Обзор литературы 10
2.I. ПУФА-терапия кожных болезней 10
2.I.I. Побочные эффекты ПУФА-терапии псориаза 14
2.1.2.Методы регистрации эритемы и пигментации.. 17 2.2.Фотофизические и фотохимические свойства псораленов 18
2.2.1.Спектральные характеристики 18
2.2.2.Первичные фотопродукты псораленов 21
2.2.3.Псоралены как фотосенсибилизаторы I и II типа 24
2.3.Реакции фотоприсоединения 8-МОП к пиримидиновым основаниям 25
2,4.Фотоприсоединение псораленов к ДНК. .26
2.5.Фотоокислительные реакции псораленов 32
2.5.1.Реакции псораленов с белками 32
2.5.2.Сенсибилизированное 8-МШ фотоокисление липидов 36
2.6.Сенсибилизированное псораленами повреждение биологических мембран 39
2.7.Влияние антиоксидантов на фотохимические реакции и фотобиологические эффекты псораленов 41
3 .Материалы и методы 46
3.1.Использовавшиеся соединения и материалы 46
3.2.УФ-облучение 47
3.З. Деление общей фракции фосфолипидов из желтка куриных яиц 48
3.4.Приготовление суспензии липосом 48
3.5«Очистка линоленовой кислоты и метилового эфира линоленовой кислоты от продуктов автоокисления.49
3.6.Приготовление суспензии линоленовой кислоты...49
3.7.Определение гидроперекисей липидов методом регистрации хемилюминесценции, индуцирован ной ионами Fe 51
3.8.Использование ТБК-реакции для определения продуктов окисления липидов 55
3.9.Определение конъюгированных диенов 58
ЗЛО. Изучение фотосенсибилизированного 8-М СП окисления липидов в зависимости от степе
ни их исходной окисленности 60
3.11.Исследование флюоресцирующих продуктов фотохимических реакций 8-МОП 60
3.12.Изучение темнового окисления липидов УФ-облученным 8-МОП 61
3.13.Изучение генерации синглетного кислорода 8-метоксипсораленом 62
3.14.Изучение термолюминесценции растворов 8-МШ 62
3.15.Изучение фотоприсоединения 8-МОП к ДНК 63
3.16.Изучение инактивации E.coli при ПУФА- воздействии 65
3.17.Изучение фотосенсибилизированной 8-МОП инактивации лизоцима 65
3.18.Регистрация ПУФА-эритемы 66
3.19.Методика клинических испытаний фонола как ингибитора фототоксических эффектов 8-1011 70
3.20.Расчет ошибки среднего значения 70
4.Результаты и обсуждение 72
4.1. Фотосенсибилизированное 8-метоксипсораленом окисление липидов 72
4.2.1.Изучение способности 8-МОП генерировать синглетный кислород 84
4.2.2.Окисление ненасыщенных липидов фотоокисленным 8-МОП 87
4.2.3.Влияние растворителя на способность фотоокисленного 8-МОП индуцировать
окисление липидов 91
4.2.4.Изучение продуктов фотоокисления 8-МСП 95
4.2.4.1.Спектроскопия фотопродуктов 8-МОП 95
4.2.4.2.Флюоресцентные исследования продуктов фотоокисления 8-MCQ 98
4.3.Исследование низкотемпературных реакций фотопродуктов УФ-облученного 8-метокси-
псоралена методом термолюминесценции 104
4.4.Фотоинактивация 8-метоксипсораленом фермента лизоцима 115
4.5.Изучение влияния антиоксидантов на присоединение 8-МОП к ДНК 118
4.5Л.Влияние антиоксидантов на образование флюоресцирующих 4',5-моноаддуктов 8-М0П-ДНК 120
4.5.2.Влияние антиоксидантов на образованиедиаддуктов 8-М0П-ДНК 120
4.5.3.Влияние ионола на фотосенсибилизированную 8-МОП инактивацию культуры Е.со11 123
4.6.Влияние ионола на индукцию ПУФА-эритемы 123
4.6.1.Оценка спектров отражения кожи при ингибировании ионолом ПУФА-эритемы 126
4.7.ПУФА-терапия псориаза с использованиемионола 128
5.Заключение 132
6.Выводы 138
7.Список литературы 140
- Побочные эффекты ПУФА-терапии псориаза
- Деление общей фракции фосфолипидов из желтка куриных яиц
- Фотосенсибилизированное 8-метоксипсораленом окисление липидов
Побочные эффекты ПУФА-терапии псориаза
При ПУФА-терапии кожных заболеваний могут наблюдаться различные осложнения. В литературе описаны такие патологические последствия ПУФА-воздействия, как тошнота (2 ), зуд ( 8 ), у 2-3% больных наблюдается обострение основного заболевания (8 ). Описаны единичные случаи, когда ПУФА-терапия приводи-ла к появлению гипертрихоза ( 2 ), подногтевых кровоизлияний ( 8 ), фото аллергического дерматоза ( 8 ) и других осложнений. Все эти реакции встречаются редко и не могут служить причиной для отказа от применения ПУФА-терапии.
В литературе дискутируется вопрос о возможном канцерогенном эффекте ПУФА-воздействия. Показано возникновение рака кожи белых мышей при совместном применении 8-МОП и УФВ-излучения. Длительное (2 раза в неделю в течение 8 месяцев) УФА-облучение в комбинации с 8-МОП канцерогенного эффекта не имело. В этой серии опытов животные получали 8-МОП в дозах, на порядок яревы-тающих терапевтические. Наблюдали развитие кожных язв, резко выраженную пигментацию, но признаков новообразований не обнаружено. В обзоре ( 94 ) отмечено, что до последнего времени не зафиксировано ни одного случая возникновения рака кожи у больных, получавших ПУФА-лечение по поводу псориаза или витилиго. Изучение лимфоцитов больных псориазом после 1, 5, 10 и 20 сеансов ПУФА-терапии не выявило хромосомных аберраций или случаев обмена генетическим материалом между соседними хромосомами ( 2 ). Канцерогенный эффект ПУФА-воздействия проявляется у больных ксеродермией ( 29 ).. Показано, что при этом заболевании у больных отсутствуют гены, ответственные за репарацию УФ-довреж ДЄНИЙ ДНК (50 ), Причем ЭТО Касается только клеток Xeroderma pigmentosum группы А. Эта популяция не способна репарировать ни моноаддукты ДНК - 8-МОП, ни моноаддукты ДНК - ангелицин, их накопление приводит к возникновению клеток-мутантов, часть из которых дает начало развитию опухолей кожи.
Из 525 пациентов, прошедших курс ПУФА-терапии, у троих через 2 года были обнаружены признаки малигнизации. У всех троих это были рецидивы опухолей кожи, существовавших до ПУФА-воздействия ( 64 ). По данным специалистов, частота возникновения злокачественных опухолей кожи у пациентов, подвергнутых ПУФА-воздействию, не выше, чем у населения страны в целом.
Осложнением ПУФА-терапии может быть помутнение хрусталика при применении псораленов внутрь (63 ). Это осложнение можно предупредить ношением светозащитных очков в течение 8-Ю часов после приема препарата.
ПУФА-воздействие легко вызывает эритему. Эритема - это стойкое покраснение кожи, вызванное расширением кровеносных сосудов в ответ на повреждающие воздействия различного характера. ПУФА-эритема лимитирует продолжительность разовой дозы облучения и, следовательно, определяет количество сеансов, необходимое для достижения клинического эффекта. Вероятно, борьба с развитием ПУФА-эритемы имеет значение для сокращения числа сеансов и, соответственно, ускорения выздоровления.
Деление общей фракции фосфолипидов из желтка куриных яиц
Фосфолипиды выделяли из желтка куриных яиц (диетических I категории) по модифицированному методу Блайя и Даера ( 27 ) К одному объему желтка добавляли два объема метанола и один объем хлороформа, тщательно гомогенизировали, добавляли к смеси один объем хлороформа и один объем дистиллированной воды, вновь гомогенизировали. Затем проводили разделение смеси на фракции в делительной воронке при температуре 0-5С в течение 30 минут, после этого отбирали нижнюю фракцию в круглодонную колбу. Растворитель выпаривали на роторном испарителе. Осадок растворяли в 3 мл петролейного эфира (фракция, кипящая при 40-70С), проводили преципитацию в ледяном безводном ацетоне для удаления пигментов и нейтральных липидов. Ацетон приливали в колбу, фосфолипиды выпадали в осадок, надосадочную жидкость сливали. Осадок вновь растворяли в петролейном эфире и еще раз добавляли ацетон. Преципитацию проводили трижды. Полученные липиды растворяли в смеси хлороформ - метанол (1:1), сливали в предварительно взвешенную круглодонную колбу, выпаривали растворитель досуха и определяли вес липидов. Липиды хранили в смеси хлороформ - метанол не более двух дней при -15С.
Лецитин из общей фракции фосфолипидов выделяли методом препаративной тонкослойной хроматографии (14 ).
Фотосенсибилизированное 8-метоксипсораленом окисление липидов
В работе Абиева и соавт.( і ) показано, что при воздейст-вии УФА-света и 8-МОП на липосомы из общей фракции фосфолипидов яичного желтка наблюдается появление продуктов перекисного окисления липидов. Накопление продуктов ПОЛ регистрировали как ме-тодом индуцированной ионами Fe ; хемилюминесценции, так и с помощью ТЕК-метода в модификации Ю.М.Петренко и др. ( 12 ). Необ-ходимо отметить, что оба метода позволяют определять количество только первичных стабильных продуктов ПОЛ - гидроперекисей.
В нашей работе было продолжено изучение данного явления в различных модельных системах с использованием независимых методов регистрации продуктов ПОЛ. Эти попытки были предприняты с целью выяснения влияния распределения фотосенсибилизатора в гомогенных и гетерогенных системах на фотооенсибилизированное окисление, различий в качественном составе липидного субстрата, а также для изучения качественного состава продуктов окисления: как гидроперекисей, так и вторичных стабильных продуктов - малонового диальдегида и других альдегидов, реагирующих с тиобарби-туровой кислотой.
В качестве объектов изучения были использованы растворы фосфолипидов и жирных кислот в органических растворителях, а также липидные модели биологических мембран - липосомы из фосфолипидов и UFA -сомы из ненасыщенных жирных кислот.
Нами были воспроизведены данные Абиева ( I ) по накопле нию гидроперекисей липидов при ПУФА-воздействии с использованием как регистрации хемилюминесценции (но не суспензии липосом.
Для регистрации накопления гидроперекисей при действии УФА и 8-МОП по хемилюминесценции суспензию линоленовой кислоты готовили так, как это описано в разделе 3.6. Проводили УФА-облучение суспензии с 8-МОП и без него и, добавляя ионы Fe ++, регистрировали ХЛ. На рис. 8 видно, что облучение линоленовой кислоты в присутствии 8-МОП приводит к интенсивному фотоокислению кислоты (кривая 1), при УФА-облучении без фото-сенсибилизатора процесс окисления выражен слабее (кривая 2). Причины, обусловившие сложный характер дозовых зависимостей, будут рассмотрены ниже.
Спектр поглощения раствора лецитина в метаноле, облученного в присутствии 8-МОП, представлен на рис. 9 . Это разностный спектр (облученный раствор против необлученного). В области 233 нм наблюдается хорошо выраженный максимум поглощения диеновых конъюгатов, что говорит об интенсивном накоплении гидроперекисей не только в двухфазной системе, как показано в предыдущем опыте, но и растворе липидов.
Далее нами была предпринята попытка изучить качественный состав продуктов сенсибилизированного 8-МОП перекисного фотоокисления липидов. Для решения поставленной задачи мы использовали известный метод ТБК-реакции, но в различных модификациях.
