Введение к работе
Актуальность проблемы. Мероцианин-540 (МЦ540) - фотосенсибилизатор (ФС), применяемый в фотодинамичесхой терапии (ФДТ) При проведении ФДТ с МЦ540 протекают два типа фотодинамических реакций- тип I - перенос электрона между электронновозбужденным красителем и биосубстратом, тип II — перенос энергии с электронновозбужденного красителя на молекулярный кислород с генерацией синглетного кислорода, который и окисляет биомолекулы Кроме того, сам ФС под действием света разрушается, и образуются его стабильные фотопродукты, которые могут взаимодействовать с биомолекулами, что приводит к повреждению последних [Gulliya, 1990]. В литературе показано, что фотопродукты МЦ540 обладают противовирусной [Gulliya, 1990, Tran, 1992] и противоопухолевой активностью [Grabbe, 1998, Sieber, 1987, Pervaiz, 1998; Perv"-7, 1999] in vitro и in vivo Фотолиз МЦ540 сильно зависит от агрегатного состояния красителя [Bilski, 1999] Существует метод, позволяющий обнаруживать агрегаты красителей - метод резонансного светорассеяния (РСР). Этот метод применялся для исследования агрегации хлоринов, порфиринов и др [Pasternak, 1995, Bomsevich, 1997; Yang, 2003] Для изучения агрегатных свойств МЦ540 данный метод ранее не применялся В этой связи, является актуальным использовать метод РСР для выяснения влияния растворителей на агрегатное состояние МЦ540 и скорость его фотолиза
Известно, что ФДТ с красителями порфиринового и хлоринового ряда инициируют супрессию Т-клеточного звена иммунитета т vivo Известно также, что супрессорное действие ФДТ с порфиринами, хлоринами и псораленами реализуются через стадию образования фотопродуктов [Kyagova, 2005; Potap-enko 1998] Однако в литературе нет данных о том, могут ли фотопродукты МЦ540 влиять на иммунную систему В этой связи исследование влияния фотопродуктов МЦ540 на Т-клеточный иммунный ответ in vivo является актуальным
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследовать фотолиз и фотовыцветание мероцианина 540 в различных агрегатных состоя-
ниже и оценить иммуносупрессорное действие фотопродуктов данного красителя
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Разработать методику получения неискаженных спектров резонансного светорассеяния красителей
Изучить методами резонансного светорассеяния, спектрофотомерии и спектрофлуориметрии влияние растворителя на агрегацию и фотолиз МЦ540
Изучить действие предоблученного МЦ540 (пМЦ540) на Т-клеточный иммунный ответ in vivo в модели реакции контактной чувствительности у мышей
Научная новизна исследования. В диссертационной работе разработана методика получения неискаженных спектров РСР агрегатов красителей Введено понятие "резонансного фактора" (РФ), величина которого определяется только размерами и структурой агрегатов красителя, и не зависит от неспецифического рэлеевского светорассеяния Предложено строить спектры РСР как зависимость РФ от длины волны Показано, что добавление солей к водным растворам МЦ540 приводит к возникновению крупных надмолекулярных агрегатов, обладающих интенсивным РСР При этом в спектрах поглощения и РСР МЦ540 появляется индуцированная солями спектральная полоса комплексиро-вания с максимумом около 517 нм Эти агрегаты начинают формироваться при концентрациях солей одновалентных катионов выше критической (ККС) Величина ККС обратно пропорциональна концентрации МЦ540 Обнаружен другой тип крупных надмолекулярных агрегатов, образующихся при концентрациях соли ниже ККС, характеризующийся максимумом в спектре РСР при 420 нм и никак не проявляющийся в спектрах поглощения
Исследовано фотовыцветание МЦ540 в водных и водно-солевых смесях методами РСР и спектрофотометрии Разработан флуориметрический метод оценки фотолиза МЦ540 Обнаружено, что скорость фотолиза МЦ540 в растворах увеличивалась в условиях, благоприятствующих агрегации этого красителя. В водных растворах она увеличивалась в присутствии солей, экранирующих
отрицательно заряженную группу SCV и таким способом способствующих образованию крупных агрегатов Выявлено, что из всех присутствующих агрегатных форм МЦ540 в водно-солевых растворах, наиболее фотолабильны крупные надмолекулярные агрегаты, характеризующиеся максимумами спектров РСР при 517 и 420 нм, тогда как димеры и мономеры фотолизируют значительно медленнее Обнаружено, что в растворах МЦ540 в дистиллированной воде квантовый выход фотолиза зависит от длины волны действующего света При облучении светом 436 нм (поглощают преимущественно димеры) квантовый выход фотолиза в 2 раза выше, чем при облучении около 546 нм (поглощают преимущественно мономеры) Таким образом, доказано, что фотолабильность разных агрегатных форм МЦ540 убывает в ряду крупные агрегаты > димеры > мономеры
Впервые обнаружено, что предоблученный МІД540 (пМЦ540) способен влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo в модели реакции контактной чувствительности (КЧ) у мышей. Впервые показано, что супрессия КЧ, вызванная пМЦ540, адоптивно переносится другим животным Выявлено, что в основе иммунного механизма супрессорного действия пМЦ540 на КЧ лежит угнетение функций клеток - эффекторов КЧ и активация клеток с неспецифическим супрессорным действием на КЧ
Практическая значимость. Работа является фундаментальным исследованием, направленным на выяснение механизма фотолиза мероцианина 540 и изучение иммуномодулирующих свойств его фотопродуктов Отдельные ее положения имеют прямое практическое приложение для совершенствования ФДТ. Исследование спектральных свойств МЦ540 и закономерностей его фотолиза позволяют предложить оптимальные условия для получения продуктов фотоокисления МЦ540, обладающих иммуносупрессорными свойствами
Внедрение в практику. Результаты, полученные в ходе исследования, внедрены в исследовательскую деятельность кафедры медицинской и биологической физики и кафедры фармакологии педиатрического факультета ГОУ ВПО "РГМУ" Росздрава
Положения, выносимые на защиту.
1. Скорость фотолиза мероцианина 540 увеличивается в водно-солевых растворителях, которые способствуют агрегации данного красителя.
Продукты фотолиза мероцианина 540 способны влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo
Иммуносупрессорное действие продуктов фотоокисления мероцианина 540 является системным и обусловлено активацией клеток с супрессорным потенциалом
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Пироговской студенческой научной конференции (2004, Москва), Ш Съезд биофизиков России (2004 г, Воронеж), 1st International Conference Skin & Environment (Moscow-St Petersburg, Russia, 2005), IV Съезде фотобиологов России (2005 г, Саратов)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 121 страницах, содержит 41 рисунок, 7 схем, 1 таблицу Состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", " Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы " Список литературы включает 168 источников
