Введение к работе
Актуальность темы. В течение последних десяти лет широкое применение получили бесклеточные системы продукции рекомбинантных белков. Наиболее распространены и интенсивно изучаемы два типа бесклеточных систем: бактериальная, работающая на основе фракции S30 из Е. coli, и эукариотическая на основе экстракта из зародышей пшеницы (WGE - wheat germ extract). На сегодняшний день выходы целевых белков в этих системах достигают нескольких миллиграммов с миллилитра реакционной смеси, что дает возможность получать белковые объекты в количествах, позволяющих проводить биологические, биохимические и биофизические исследования. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции. Во-первых, в такой системе синтезируется в основном целевой продукт, во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также агентов, позволяющих удерживать синтезируемый полипептид в растворе, и, в-третьих, можно проводить синтез белков, селективно меченных по определенным аминокислотным остаткам стабильными или радиоактивными изотопами.
Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса. Мутации в их аминокислотной последовательности во многих случаях приводят к возникновению и развитию ряда нервных заболеваний. Изучение этих объектов затруднено в связи с тем, что мембранные белки довольно сложно получить в растворимой форме в достаточных количествах, так как они обладают функциональной активностью и нативной структурой только в мембранном (или мембраномоделирующем) окружении. Поэтому, при продукции в клетках эти белки в большинстве случаев выпадают в осадок и накапливаются в тельцах включения. В бесклеточной системе данную проблему можно решить, добавляя в трансляционную смесь мембраномоделирующие частицы, такие как мицеллы детергентов, липосомы, липид-белковые нанодиски.
Для некоторых структурных исследований с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) требуются белки, меченные стабильными изотопами 13С и/или ,5N по определенным аминокислотным остаткам. Получение селективно меченых белков при клеточной экспрессии часто затруднено из-за возможного перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтеза подобные механизмы перераспределения метки отсутствуют, что позволяет добиться большой селективности включения меток.
Таким образом, исследование принципов работы и способов применения бесклеточных систем для синтеза белков с целью их последующего изучения является актуальной задачей молекулярной биологии, биотехнологии и биофизики.
Цели и задачи исследования. Целями исследования являлись изучение и оптимизация работы бесклеточных систем, оценка влияния определенных агентов
на выход целевого продукта в бесклеточных системах, разработка эффективных систем продукции определенных белков. В качестве модельных объектов были выбраны: зеленый флуоресцирующий белок из Aequorea victoria (GFP), фермент дигидрофолатредуктаза из Escherichia coli (ДГФР), пептидогликан-связывающий белок человека Tag7, внеклеточный домен никотинового ацетилхолинового рецептора человека <х7 типа (а7ВД) и вольт-сенсорный домен потенциалозависимого К+ канала KvAP из археи Aeropyrum Pernix (ВСД-KvAP). Для достижения заданных целей было необходимо выполнить следующие задачи:
Оптимизировать работу бесклеточных систем на основе экстрактов из Е. coli и зародышей пшеницы для максимального увеличения выхода целевых белков.
Изучить формирование полисом как функциональных белоксинтезирующих единиц в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы.
Изучить влияние ряда детергентов на синтез белков в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы на примере GFP и ДГФР.
Продемонстрировать применимость детергентов для получения белков в растворимой форме в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы на примере Tag 7.
Разработать эффективную систему продукции а7ВД на основе бактериальной бесклеточной системы.
Продемонстрировать возможность получения селективно меченых мембранных белков в бактериальной бесклеточной системе для структурных исследований методом ЯМР на примере ВСД-KvAP.
Научная новизна и значимость работы. Все результаты, изложенные в данной диссертационной работе, были получены впервые.
Изучено формирование полисом как функциональных белоксинтезирующих единиц в оптимизированной бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы.
Изучено влияние ряда неионных детергентов на бесклеточную систему на основе экстракта из зародышей пшеницы.
Подобраны условия синтеза радиоактивно меченого пептидогликан-связывающего белка человека Tag7 в растворимой форме в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы.
На основе бактериального экстракта разработана эффективная бесклеточная система продукции а7ВД в функционально активной форме.
Разработана эффективная система продукции ВСД-KvAP с использованием бактериальной бесклеточной системы. Подобраны условия получения селективно меченого белка, а также условия его ренатурации.
Изучение процесса формирования полисом в бесклеточной системе из зародышей пшеницы открывает перспективы для более детального понимания процесса биосинтеза белка у эукариот. Результаты исследования влияния детергентов на пшеничную бесклеточную систему позволяют использовать её в практических целях, например, для синтеза мембранных белков в растворимой форме. Разработка эффективных систем продукции доменов ионных каналов
позволяет получать белковые объекты, в том числе селективно изотопно-меченые варианты, в количествах, достаточных для структурных исследований. Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 8-й международной конференции «РНК-белковые взаимодействия» (Московская область, 2006), международной конференции «Структура, функции и биосинтез белка» (Пущино, 2007), 33-м конгрессе Европейских биохимических сообществ (Афины, Греция, 2008), XVI международном симпозиуме «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Украина, 2008), XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективы направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008), 4-ой международной конференции Европейского нейрохимического общества «Успехи в изучении молекулярных механизмов неврологических заболеваний» (Лейпциг, Германия 2009), заочной электронной конференции Российской академии естествознания «Технологии живых систем» (2009), международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва, 2009). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 1 статья в зарубежном журнале и 1 статья в отечественном журнале
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах
машинописного текста, состоит из введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждения), а также заключения и выводов.
Работа проиллюстрирована рисунками, содержит таблиц. Библиографический
указатель содержит источников.
