Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Квазицилиндрические поверхности 8
1.2. Мембранные тубулярные структуры в биологических системах 11
1.3. Эндоцитоз 16
1.4. Экзоцитоз в адипозных (жировых) клетках 20
1.5. Транспортные свойства тубулярных структур 24
1.6. Модельные системы для исследования тубулярных структур 26
1.7. Тубулярные структуры из БЛМ (мембранная трубка) 28
1.8. Энергетика и механизмы формирования клеточных тубулярных структур 30
Глава 2. Материалы и методы 34
2.1. Реактивы 34
2.2. Формирование бислойных липидных мембран 35
2.3. Липидный состав мембран ' 36
2.4. Формирование мембранной трубки/нанотрубки из БЛМ 36
2.5. Флуоресцентная видеомикроскопия МТ и НТ 41
2.6. Флуоресцентная видеомикроскопия переноса микрообъектов через НТ 42
2.7. Измерение электрической проводимости МТ и НТ 43
2.8. Измерение электрической проводимости мембраны МТ/НТ 44
2.9. Численное нахождение формы, энергии и критических параметров МТ 45
2.10. Сопоставление формы МТ с катеноидом 48
2.11. Определение радиуса, энергии и критических параметров НТ 49
2.12. Компьютерное моделирование формы МТ/НТ в среде Surface Evolver 51
2.13. Клетки IC-21 - мышиные макрофаги 51
2.14. Эндоцитоз флуоресцентных микросфер из микропипетки 52
2.15. Измерение адмитанса мембранного фрагмента 53
2.16. Адипозные (жировые) клетки 59
2.17. Конфокальная микроскопия адипозных клеток 60
2.18. Метод нарушенного полного внутреннего отражения (нПВО) 61
2.19. Обработка и анализ изображений 63
Глава 3. Результаты и обсуждение 68
3.1. Изменение формы МТ при растяжении и коллапсе 68
3.2. Проводимость МТ 71
3.3. Описание МТ моделью несимметричного катеноида 74
3.4. Квазицилиндрическая мембранная нанотрубка 76
3.5. Проводимость НТ 78
3.6. Кусочно-непрерывное описание формы НТ 81
3.7. Изменение проводимости ТС при переходе МТ-НТ 84
3.8. Бистабильность ТС - бифуркационные переходы МТ-НТ 86
3.9. ТС при эндоцитозе (мембранные перешейки) 88
3.10. ТС при экзоцитозе GLUT4 содержащих везикул 94
Основные результаты и выводы 100
Приложение 102
Литература 103
- Мембранные тубулярные структуры в биологических системах
- Модельные системы для исследования тубулярных структур
- Формирование мембранной трубки/нанотрубки из БЛМ
- Описание МТ моделью несимметричного катеноида
Введение к работе
Мембранные тубулярные структуры (ТС) широко распространены в
биологических системах. Микротрубочки, стенки которых образованы
фосфолипидной мембраной, встречаются в строении множества
внутриклеточных органелл, являются основой таких структур, как клеточные
отростки, подии и др. [23,29,35,48,54]. Более того ТС выполняют важные
транспортные функции по обмену веществ между внутриклеточными
компартментами, участвуют в процессах деления и слияния мембран и,
предположительно, играют важную роль в таких процессах как эндо- и
экзоцитоз [3,12,18,35,38]. Поэтому исследование механических и транспортных
свойств мембранных тубулярных структур является одной из приоритетных
задач биофизики мембран. ч
В настоящее время активно изучается проблема создания искусственных сетей из тубулярных мембран (tubular membrane networks). Для создания биореакторов и моделирования клеточных биохимических процессов необходима разработка методов формирования систем взаимосвязанных компартментов [27,43]. Однако до сих пор остаются малоисследованными свойства простейших мембранных трубочек. Не исследованы их структурные
перестройки, транспортные свойства, проницаемость для различных веществ, и не выяснена роль липидного бислоя во всех этих процессах [29,53].
Исследования мембранных тубулярных структур, существующих в клетках, существенно затруднены многокомпонентностью и сложностью системы, присутствием огромного количества белков и других веществ, активно взаимодействующих с мембраной. Поэтому приоритетным направлением является создание модельных систем, позволяющих исследовать мембранные ТС в отсутствии клеточных факторов.
Существующие на данный момент методики формирования мембранных трубочек обладают существенными ограничениями и недостатками. Так модельные системы, основанные на липосомах, ограничены использованием растворов с очень малой ионной силой [43,76]. Искусственные гигантские липосомы оказываются не стабильными при физиологических условиях и, следовательно, не позволяют изучать взаимодействия мембраны с клеточными белками. Мембранные тубулярные структуры, выделяемые из клеток, содержат большое количество примесей и обладают неконтролируемым липидным составом. Более того, все известные на данный момент модельные системы не позволяют напрямую исследовать их транспортные свойства, измерять проницаемость и исследовать влияние механических свойств липидного матрикса на свойства ТС.
7 В данной работе было проведено исследование мембранных тубулярных
структур в модельных и клеточных системах. В модельной системе была
разработана оригинальная методика формирования ТС из БЛМ, позволяющая
воспроизводимо формировать как микроскопические мембранные трубки (МТ),
так и нанотрубки (НТ) с радиусом до нескольких нанометров. Сочетание
электрических измерений с флуоресцентной видеомикроскопией позволяло
регистрировать форму МТ и одновременно исследовать динамику
проводимости в процессе коллапса и перехода в НТ.
На клеточной системе были осуществлены исследования ТС, формируемых при эндо- и экзоцитозе (т.н. мембранных перешейков - МП). На линии перитонеальных макрофагов IC21 была исследована динамика проницаемости МП в процессе эндоцитоза, и, в частности, при фагоцитозе полистереновых микросфер. Регистрация событий эндоцитоза осуществлялась на малых участках клеточных мембран в условиях регистрации тока в режиме фиксации потенциалов (метод patch-clamp, конфигурация cell-attached) [36,75] в сочетании с техникой определения адмиттанса [56,58,75]. На адипозных (жировых) клетках была исследована латеральная проницаемость МП, формируемых при слиянии специальных везикул, содержащих мембранный белок GLUT4 [9,87]. Была использована флуоресцентная микроскопия в сочетании с методикой нарушенного полного внутреннего отражения [2,100].
Мембранные тубулярные структуры в биологических системах
До последнего времени практически единственным методом, позволяющим изучать строение клеточных субъединиц, являлась электронная микроскопия. Огромный набор данных, полученный просвечивающей (ПЭМ) и сканирующей электронной микроскопией (СЭМ) позволил достаточно детально описать множество сложнейших клеточных структур. Последние достижения в этой области, а именно, томографическая реконструкция набора полутонких срезов [23], просвечиваемых под серией углов, дала возможность воссоздавать трехмерное строение отдельных клеточных органелл с разрешением до нанометра. В результате, было показано, что многие объекты, разрешавшиеся с помощью ПЭМ, как отдельные везикулы или сферические мембранные образования, на самом деле, соединяются мембранными трубочками, а иногда и просто являются срезами тубулярных мембранных структур [23,48]. Так было восстановлено объемное изображение мультивезикулярного тельца (multi vesicular body - MVB), изменяющее текущее представление о строении MVB. Скопления мембранных пузырьков и крупных цистерн, ранее считавшиеся замкнутыми и независимыми, оказались связанными сетью мембранных ТС [48].
Предположительно, соединяющие мембранные ТС позволяют оперативно смешивать и разделять внутренние объемы мембранных цистерн без энергоемкого цикла слияния-деления мембран [70]. Данная гипотеза позволяет развить принципиально новый подход к пониманию внутриклеточного везикулярного транспорта, а также к объяснению механизмов функционирования клеточных структур, имеющих сложно разветвленное
Накопление флуоресцентного GFP-Rabl белка в тубулярных доменах (ТС) в центре Гольджи, потенциально участвующих в ретроградном внутриклеточном транспорте, (а) - GFP-Rabl в центральных структурах, связанных с Гольджи, клетки PC 12. (с) - накопление Rabl в глобулярных элементах Гольджи; рецепторы p58/ERGIC-53 в ТС отсутствуют, клетки ВНК-21. (е) - Аккумуляция Rabl содержащих ТС и формирование сети из ТС в клетках PC 12 под действием бафиломицина-А 1, ингибирующего ретроградный транспорт между ЭР и Гольджи. Стрелками показаны глобулярные компартменты. Sunnemd et al., Current Opinion in Cell biology, 2003. строение [96,43]. Однако методы электронной микроскопии ограничены описанием статической структуры объектов. Для понимания механизмов формирования мембранных ТС, изучения их механических свойств и функций необходимо применение других биофизических методов, позволяющих регистрировать динамическое поведение ТС. Так для выяснения механизма регуляции направленного транспорта макромолекул через ТС необходимо изучение влияния градиента натяжения и липидного потока на микрообъекты, находящиеся внутри ТС [43,120].
В работе [23] было показано, что в некоторых случаях в процессе эндоцитоза везикула не претерпевает полного отделения от цитоплазматической мембраны, а остается связанной с ней тонкой ( 20нм) и длинной (500нм и более) мембранной трубочкой (Рис. 1.3). Гипотеза, предполагающая формирование мембранных ТС в процессе эндоцитоза была предложена в работе [18,38]. Также были обнаружены целые комплексы (membrane networks) из мембранных ТС и квазизамкнутых везикул, связанных с цитоплазматической мембранной. Характерно, что во всех местах перегиба ТС, мембрана была покрыта клатрином (clathrin). Клатрин является хорошо изученным фибриллярным белком, основной функцией которого считают создание белкового капсида эндоцитозных везикул [116,119]. Адсорбция клатрина на мембрану приводит к локальному изменению геометрии липидного бислоя или к формированию т.н. окаймленной ямки ("coated pit") [62,118].
Скорость такого конститутивного эндоцитоза обычно очень велика: фибробласт поглощает примерно 1% своей плазматической мембраны в минуту, фагоцит в 3 раза больше [107]. Многие эндоцитозные пузырьки и транспортные везикулы окружены со стороны цитоплазмы каймой (окаймленные пузырьки) они по видимому образуются путем отпочковывания окаймленных участков плазматической мембраны (окаймленных ямок). Мембрана окаймленных пузырьков содержит клатрин, фибриллярный белок, образующий чехол на цитоплазматической поверхности везикулы [119].
Адипозные клетки играют ключевую роль в переработке и запасание глюкозы в организме животного и человека [9,115]. Транспорт глюкозы в клетку и наружу осуществляется семейством специальных трансмембранных белков - глюкозо-транспортеров (Glucose transporters или GLUT) [9,60]. GLUT белки являются пассивными переносчиками глюкозы и, когда встроены в мембрану, осуществляют транспорт глюкозы по градиенту концентрации. Транспортеры глюкозы синтезируются, практически, в каждой клетке организма, однако от клетки к клетке разнятся модификации этих белков и их содержание в мембране [87]. Изоформы GLUT1, GLUT2, GLUT3 и т.д. являются тканеспецифичными белками и имеют гомологию порядка 50-75% [9]. Однако наиболее важным представителем этого семейства считают изоформу GLUT4, встречающуюся в адипозных и мышечных клетках [60]. Транспорт глюкозы осуществляемый GLUT4 сильнее всего подвергается регуляции инсулином. Нарушения, связанные с работой данной системы лежат в основе возникновения диабета второго рода или т.н. инсулин-резистентости [9,87].
Модельные системы для исследования тубулярных структур
Особый интерес представляет возможность изучения свойств ТС на модельных системах. Правомерность использозания модельных систем (БЛМ, липосомы) для исследования свойств биологических мембран была доказана для различных клеточных процессов [97,123,124]. До сих пор исследования механических свойств липидных мембран активно велось по двум независимым направлениям. В качестве модельных мембран использовались либо липосомные системы [21,27,44], либо бислойные липидные мембраны (БЛМ)[51,52,65,97]. В обеих областях был накоплен огромный экспериментальный и теоретический материал. В модельных системах с липосомами большое количество работ было посвящено изучению механических свойств мембранных тяжей или тетеров («tethers»). Сам феномен формирования мембранных тяжей был описан впервые в 1980-ых [123]. Впоследствии было разработано значительное количество экспериментальных методик по формированию тетеров [15,27,124]. Все эти методики основываются на точечном воздействии на мембрану, т.е. тетер, буквально, вытягивается из исходной липосомальной либо клеточной мембраны [15,37]. Данные методики нашли большое применение для исследования механических свойств как искусственных так и клеточных мембран. В экспериментах по вытягиванию тетера были получены точные значения локального модуля изгиба жидких бислоёв [123] и эта методика позволила впоследствии провести измерения нелокального модуля изгиба [124]. Кроме того, с помощью вытягивания мембранных тетеров был измеряй коэффициент трения скольжения между двумя монослоями [123]. Некоторые исследователи предполагают, что тетеры имеют такое же строение, как и мембранные нанотрубки, т.е. являются полыми тубулярными структурами, стенки которых образованы липидной бислойной мембраной [27].
Тубулярные структуры из БЛМ (мембранная трубка). Особый интерес представляет изучение свойств мембранных тубулярных структур, сформированных из бислойной липидной мембраны. К настоящему времени опубликовано всего несколько работ, посвященных формированию и коллапсу модельных ТС. В работах [52,65] было показано, что при слиянии бислойных липидных мембран (БЛМ), сформированных на двух горизонтальных отверстиях, расположенных параллельно и коаксиально, образовывалась мембранная трубка (МТ), по форме совпадающая с квазицилиндрическим перешейком, образованным из мыльной пленки. Необходимо отметить, что в этой системе мембрана МТ находится под сравнительно большим натяжением (1 - 5дин/см), определяемым распределенными по отверстиям липидными резервуарами - т.н. менисками [51]. В работе [67] была исследована стабильность МТ, сформированной аналогичным образом при слиянии БЛМ. Было показано, что при удлинении либо приложении трансмембранной разности давлений, превышающей определенное критическое значение МТ, как и в случае мыльной пленки, происходит коллапс, т.е. ТС переходит в две плоские пленки (мембраны).
В работе [67] по исследованию взаимодействия двух полусферических БЛМ в процессе слияния формировалась макроскопическая МТ (размеры миллиметра). В этой работе было впервые показано, что форма МТ описывается уравнение y(x)=a cosh(x/a) - уравнением катеноида. Было также показано, что аналогично цилиндрическим мыльным пленкам, МТ существует только в определенном диапазоне длин, а именно при длине L LK 1.325 R, где R радиус отверстия на котором формировалась исходная БЛМ. При длине L LK МТ становилась нестабильна и происходил коллапс - трубка за время порядка 10"3с сужалась и претерпевала разрыв, оставляя на отверстиях две несвязанных плоских БЛМ. Такое поведение феноменологически очень напоминает деление цилиндрических мыльных пленок [79,59], разрыв струи жидкости (т.н. «Релеевская неустойчивость») и критическое поведение других структур, форма которых определяется минимизацией энергии поверхностного натяжения и описывается катеноидом [8,10,82,124].
Механизмы формирования тубулярных мембранных структур под действием различных клеточных белков, (верхний рис.) - Деформации мембраны, связанной с цитоскелетом. (средний рис.) - Формирование ТС моторными белками, (нижний Рис.) - Формирование отростков и псевдоподий под действием цитоскелетных белков. Khashayar Farsad and Pietro De Camilli, Current Oppinion in Cell Biology, 2003. мембраны. Однако до сих пор исследования МТ на модельных системах проводились без учета теории упругости мембран. Не применялась теория упругости мембран и для исследования стадии деления МП при везикуляции, хотя было неоднократно показано влияние липидного состава на протекание процесса эндоцитоза [16,28,32]. Поэтому применение теории упругости мембран к исследованию структурных перестроек мембранного перешейка и сравнение с экспериментальными данными, полученными на модельных и клеточных системах, является актуальными, и, возможно, позволит углубить понимание механизмов таких клеточных процессов, как эндоцитоз.
Формирование мембранной трубки/нанотрубки из БЛМ
Было разработано два вида экспериментальных ячеек для формирования МТ из БЛМ. Ячейка первого типа (Рис.2.1) использовалась для флуоресцентной микроскопии больших МТ (характерные размеры 60-200мкм), при этом исходная мембрана формировалась на вертикальном срезе тефлоновой трубки (диаметр 200мкм). К мембране подводилась стеклянная пипетка (диаметр кончика 10-60мкм), подведение и контакт с мембраной контролировались визуально с помощью микроскопа. После формирования плотного контакта мембраны со стеклом фрагмент мембраны под пипеткой (пэтч) разрушался импульсом отрицательного гидростатического давления. При отведении пипетки образовывалась мембранная трубка, связывающая тефлоновое отверстии и кончик пипетки. Для перемещения пипетки (изменения длины МТ) использовался механический микроманипулятор Motion Controller 860-С2 (NewPort, США), с минимальным шагом 2 мкм. (характерные размеры 1-Юмкм) и использовалась исключительно для электрических измерений. В этом случае мембрана формировалась на горизонтальном отверстии в тефлоновой пленке (R=25-100MKM).
Использовались стеклянные микропипетки малого диаметра (0.5-5мкм), которые вытягивались из капилляров (WPI, США) на программируемой микрокузнице (Sutter Instruments, США). Микропипетка подводилась вертикально с помощью пьезо-манипулятора a-Drive Controller ESA-CSA (NewPort, США) с шагом 0.1 мкм. Контакт с мембраной контролировался по изменению электрического сигнала (см.$ 2.7. Электрические измерения). После формирования плотного контакта мембраны со стеклом (сопротивление контакта ГОм) пэтч прорывался либо скачком гидростатического давления, либо импульсом напряжения (200мВ). При отведении микропипетки формировалась МТ.
Как было обнаружено в работе Melikyan et al., 1984 [65], мембранная трубка при растяжении более некой критической длины, дестабилизируется. При этом считалось, что происходит разрыв МТ, т.е переход в две плоских мембраны, покрывающих граничные отверстия. Однако нами было показано, что вместо разрыва МТ, происходит быстрая ( мс) трансформация мембранной трубки в нанотрубку (НТ, диаметр 10-100нм в зависимости от липидного состава), с трудом поддающуюся визуализации оптическими методами. Таким образом, растяжение МТ до критической длины позволяло формировать в нашей системе НТ (Рис.2.3).
Во всех экспериментах механические манипуляции (изменение длины МТ/НТ) проводились таким образом, что МТ/НТ всегда соединяла два коаксиальных отверстия. Особенностью методики Мюллера-Рудина формирования БЛМ является то, что на тефлоновом отверстии остаются т.н. мениски, содержащие раствор липида в высокомолекулярном неполярном растворителе (в наших экспериментах использовался сквален).
Методика формирования мембранной трубки (МТ) и нанотрубки (НТ) из бислойной липидной мембраны (БЛМ). Первая стадия -формирование плотного контакта микропипетки с БЛМ и разрыв мембраны под пипеткой. Вторая стадия - отведение микропипетки и формирование МТ, увеличение площади происходит за счет притока липида из мениска (резервуары на краях отверстия). Третья стадия - при растяжении МТ до критической длины (LK) происходит коллапс МТ и формируется НТ. зависимости от липидного состава). Поэтому при вытягивании мембранной трубки и изменении ее длины не происходит деформаций растяжения/сжатия мембраны и механические свойства БЛМ (площадь на молекулу, натяжение и изгибная жесткость) остаются неизменными.
Флуоресцентная видеомикроскопия МТ и НТ. Для регистрации формы МТ и визуализации НТ был использован метод флуоресцентной видеомикроскопии. Схема экспериментальной установки представлена на Рис.2.1. Установка состояла из инвертированного флуоресцентного микроскопа (Leitz Flouvert, Германия), источника света (ртутной лампы), CCD-камеры (PTI 1С-ПО, США) и видеомагнитофона. В отдельных экспериментах изображение сразу оцифровывалось с помощью платы видеозахвата (Matrox Meteor, США) и записывалось на диск компьютера. Использовались следующие объективы: 32х 0.6NA; 20х 0.4NA и 10х 0.2NA. Применение объективов большой числовой апертуры было невозможно из-за особенностей ячейки, требующей наличия фокусного расстояния не менее 2мм. Для возбуждения и регистрации флуоресценции (родамин 550/590) использовалась ртутная лампа и соответствующий набор оптических фильтров (Omega, США): excitation filter ВР550/20, dichroic mirror 570LP, emission filter BP590/20.
MT/HT, содержащая 2-5 мольных процентов флуоресцентного зонда родамин-ДОФЭ, формировалась, как описано в пункте 2.4. Диафрагма микроскопа устанавливалась так, чтобы максимально уменьшить засветку от большой мембраны. Однако при малых длинах МТ/НТ превалирующий сигнал флуоресценции от большой мембраны приводил к перегрузке CCD-камеры и появлению неоднородного фона. МТ/НТ удлинялась квазистационарно посредством микроманипулятора так, что мембрана всегда успевала принять равновесную форму. При этом регистрировалось как флуоресцентное изображение МТ/НТ, так и показания микроманипулятора (длина МТ/НТ).
Описание МТ моделью несимметричного катеноида
Для случая симметричных граничных условий было подтверждено, что форма МТ описывается катеноидом [59,67,82]. В случае несимметричных граничных условий (разные радиусы колец Rj и R2) было показано, что форма МТ также описывается уравнением, аналогичным катеноиду, но только с двумя параметрами. Решением его является несимметричный катеноид, y(x)=a cosh[(x-b)/a], удовлетворяющий граничным условиям: y(xj)=Ri; y(x2)=R2," xi+X2=L. Сравнение формы и геометрических параметров МТ с расчетными, (а)-График образующей несимметричного катеноида (R2/Ri=2, L=1.8Ri). Точками обозначены экспериментальные значения, полученные с цифрованного изображения МТ с граничными условиями: R.2=60MKM, RI=30MKM, L=55MKM. Все значения нормированы на меньший радиус - Rj. (б) - зависимость расчетной критической длины катеноида (LK) от граничных условий Rj и R2, точками показаны среднее значение для МТ с заданными соотношениями R2/R1. Каждая точка соответствует пяти и более опытам. Отрезками показано среднеквадратичное отклонение. Возможность описания формы МТ несимметричным катеноидом было проверена для различных липидных составов (ДФФХ, ДОФХ:ДОФЭ, ДНФХ и др.) и для МТ с характерными размерами от 200мкм до 1мкм. Таким образом, было впервые показано, что в общем случае для произвольных граничных условий и различного липидного состава форма МТ описывается несимметричным катеноидом. При этом форма и критические параметры МТ определяются исключительно граничными условиями и не зависят от механических свойств мембраны и молекулярных особенностей составляющих ее липидов.
Было показано, что при L Ьк МТ переходит в исключительно тонкую тубулярную структуру с поперечным размером (диаметром) порядка десятка нанометров. Было установлено, что при этом сохраняется бислойная структура и цилиндрическая топология мембранной поверхности. Полученная структура была названа «мембранной нанотрубкой» (НТ). Исходный малый диаметр НТ не позволял визуализировать НТ даже с использованием высокочувствительной флуоресцентной микроскопии. Только эмпирически найденные модификации липидного состава (смесь холестерина с лизолипидами) позволили увеличить равновесный диаметр НТ до значений порядка 200нм и получить ее флуоресцентное изображение (Рис.3.5).
Рис.3.5. Флуоресцентное изображение нанотрубки увеличенного диаметра. Липидный состав: ОФХ:ОФЭ:холестерин=30:30:40, с добавкой 2% родамин-ДОФЭ. Стрелкой показано положение микропипетки. Тефлоновое отверстие и большая мембрана, с которой связана НТ слева, вырезаны диафрагмой микроскопа для уменьшения фоновой флуоресценции. Фоновые неоднородности удалены с помошью «Rolling-ball» алгоритма программы ImageJ (см. 2.19. Обработка и анализ изображений). Масштаб 5мкм.
Было показано, что при квазистационарном удлинении НТ остается стабильной при любой длине. При уменьшении длины менее LK НТ также оставалась стабильной. И лишь по достижении L=lK« LK НТ теряла устойчивость и переходила обратно в МТ, имеющую форму катеноида.
Для регистрации малых значений проводимости НТ, прикладываемое к электродам напряжение увеличивалось с 20 до ЮОмВ, коэффициент усиления пэтч-кламп усилителя переключался с 1 на 10мВ/пА. Сразу после коллапса МТ пьезоконтроллер останавливался, так что НТ имела длину, равную критической длине МТ. Проводимость НТ из ДФФХ длиной 5мкм сразу после коллапса составляла 40±10 пСм (N=53) (Рис.З.ба). Уровень проводимости (40±10) пСм при неподвижной микропипетке сохранялся на протяжении десятков секунд. Таким образом, НТ, полученная в результате коллапса мембранного перешейка, являлась стабильной мембранной структурой с проводящей полостью внутри, заполненной электролитом.
При отведении микропипетки проводимость НТ плавно уменьшалась. На Рис.3.6а стрелками указаны моменты начала и конца движения микропипетки. Экспериментальная зависимость проводимости НТ от ее длины хорошо описывалась гиперболическим законом, т.е. проводимость обратно пропорционально длине НТ (Рис.3.6а). Такое изменение проводимости НТ соответствовало ее удлинению без существенного изменения в диаметре.
Кусочно-непрерывное описание формы НТ. Поверхность НТ на краях должна удовлетворять граничным условиям: y(xi)=Ri; y(x2)=R2, где Ri и R2»r. Рис.3.8. Кусочно-непрерывное описание формы НТ. Линиями показаны места сшивки «катеноидальных крыльев» с цилиндрической областью, її и 12 -фиксированные длины катеноидальных крыльев, определяемые граничными условиями (Ri; R2) и радиусом цилиндрической области (г). її и 12 составляют порядка нескольких г и соответственно много меньше Ri и R2. Варьирование расстояния между границами отражается только на изменении длины цилиндрической области (1).
Для этого было предложено кусочно-непрерывное описание, в котором цилиндрическая поверхность гладко сшивалась с катеноидальными «крыльями» (Рис.3.8), заданными уравнением: у(х)= r cosh(x/r); ll=r arccosh(RI/r); l2=r arccosh(R2/r). Такая сшивка обеспечивает минимум суммарной энергии натяжения и изгиба, т.к. катеноид - минимальная поверхность с нулевой суммарной кривизной. При этом разрыв в месте сшивки испытывает только вторая производная, хотя при этом скачком меняется и средняя кривизна поверхности.
Преимуществом данного аналитического кусочно-непрерывного описания является возможность легко находить критическую длину 1К для НТ: lK= li+l2 = r {arccosh(Ri/r)+arccosh(R2/r)}. Из этой формулы видно, что 1К имеет близкую к логарифмической зависимость от отношения (R/r) и, следовательно, даже для больших Л; и /?2 по сравнению с г, критическая длина 1К будет порядка г. Это также объясняет, почему после коллапса МТ не возможно визуально разрешить форму мембраны в области, где цилиндрическая часть НТ сшивается с плоской мембраной, так как длина переходной области тоже г. Адекватность кусочно-непрерывного описания была подтверждена компьютерным моделированием с использованием среды Surface Evolver. Для набора граничных параметров (Ri и R2) и для различных соотношений коэффициента поверхностного натяжения и модуля изгибной жесткости были найдены поверхности с минимальной энергией.
