Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Саркомерные цитоскелетные белки семейства тайтина 9
1.1 Структура молекулы тайтина и его функции 9
1.1.1. Структура и функции молекулы тайтина в разных зонах саркомера 10
1.2 Структура и функции молекул С-белка, Х-белка и Н-белка 14
1.2.1. Структура С-белка 14
1.2.2. Структура Х-белка 17
1.2.3. Структура Н-белка 18
1.2.4. Функции С-белка, Х-белка и Н-белка 19
1.3 Белки семейства тайтина в норме, при адаптации и патологаи 20
Глава 2. Амилоидозы 22
2.1. Актуальность проблемы 22
2.2. История изучения амилоидозов 23
2.3. Современные представления о строении и формировании амилоидных фибрилл 24
2.4. Изучение амилоидных фибрилл invitro 29
2.5. Патологические проявления амилоидозов 33
Заключение 37
Цель и задачи исследования 39
И. Экспериментальная часть 40
Глава 3. Материалы и методы 40
3.1. Экспериментальный и клинический материал 40
3.2. Выделение и очистка белковых препаратов 40
3.2.1. Выделение и очистка миозина из скелетных мышц 40
3.2.2. Выделение и очистка миозина из сердечной мышцы 41
3.2.3. Очистка С-белка, Х-белка и Н-белка 43
3.2.4. Выделение тайтина из скелетных мышц 43
3.2.5. Выделение актина из скелетных мышц 44
3.3. Определение концентрации белковых препаратов 45
3.4. Проверка чистоты белковых препаратов 45
3.5. Условия формирования амилоидных фибрилл 46
3.6. Микроскопические исследования 47
3.6.1 Электронная микроскопия 47
3.6.2. Поляризационная и флуоресцентная микроскопия 47
3.7. Спектральные методы 48
3.7.1. Метод кругового дихроизма 48
3.7.2. Метод флуоресцентного анализа 48
3.7.3. Спектрофотометрический метод 48
3.8. Измерение АТФазной активности актомиозина 49
3.9. Исследование клеточной токсичности амилоидных фибрилл Х-белка 49
III. Результаты и обсуждение 51
Глава 4. Образование амилоидных фибрилл белками семейства тайтина 51
4.1 Электронно-микроскопическое изучение агрегационных свойств
молекул тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка скелетных мышц кролика...51
4.2. Электронно-микроскопическое изучение агрегационных свойств АР(25-35)-пептида в сравнении с агрегацией молекул Х-белка 57
4.3. Подтверждение амилоидной природы агрегатов, образуемых белками семейства тайтина (тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка) при их взаимодействии со специфическими красителями на амилоиды Конго красным и тиофлавином Т 58
4.4. Изучение вторичной структуры тайтина и белков его семейства
до и после образования амилоидных фибрилл 62
4.5. Скорость образования амилоидных фибрилл Х-белка 64
4.6. Образование амилоидных фибрилл С-белком миокарда человека
при ДКМП и С-белком миокарда кролика 66
Глава 5. Разрушение амилоидных фибрилл белков семейства тайтина 68
5.1. Разрушающее действие тетрациклина и фуллерена С6о на амилоидные
фибриллы Х-белка и АР(25-35)-пептида 68
Глава 6. Свойства амилоидных фибрилл белков семейства тайтина 73
6.1. Изучение влияния белков семейства тайтина в молекулярной форме и их
амилоидных фибрилл на АТФазную активность актомиозина in vitro 73
6.2. Исследование клеточной токсичности амилоидных фибрилл Х-белка 74
Заключение 78
Выводы 81
Финансовая поддержка работы 82
Список литературы
- Структура и функции молекул С-белка, Х-белка и Н-белка
- Современные представления о строении и формировании амилоидных фибрилл
- Выделение и очистка миозина из сердечной мышцы
- Электронно-микроскопическое изучение агрегационных свойств АР(25-35)-пептида в сравнении с агрегацией молекул Х-белка
Введение к работе
Амилоидозы - большая группа конформационных заболеваний, которая характеризуется отложениями белка в виде нерастворимых фибрилл в разных органах и тканях, образующихся в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белков (Tan & Perys, 1994; Uversky & Fink, 2004). Их накопление разрушает структуру и функционирование органов и тканей, приводя к болезни и летальному исходу. Амилоидные отложения найдены при болезни Альцгеймера, Паркинсона, диабете второго типа, наследственной амилоидной полинейропатии, системном амилоидозе и др. (Tan & Perys, 1994; Goedert, 2001; Dobson,2001).
Известно много белков, образующих амилоидные фибриллы, таких как тау-белок, Ар-пептид, ацилфосфатаза, миоглобин, амилин, транстиретин и другие (Guijarro et al., 1998; Chiti et al., 1999; Fandrich et al., 2001; Uversky & Fink, 2004). Несмотря на различие в белках-предшественниках амилоидов, образуемые ими амилоидные фибриллы имеют общие свойства: р-складчатую структуру с отдельными Р-слоями, ориентированными параллельно главной оси фибриллы; нерастворимость in vivo; специфическое связывание с красителями Конго красным и тиофлавином Т (Klunk et al., 1989; Krebs et al., 2005). Важно отметить, что белки-предшественники амилоидов претерпевают трансформацию типа "а-спираль - Р-складчатость", необходимую для образования амилоидных фибрилл (Uversky & Fink, 2004).
К сожалению, процессы, лежащие в основе аномальной агрегации белка и ее патологического проявления при болезнях, изучены еще недостаточно. Выяснение молекулярных механизмов амилоидозов, установление белковой природы депозитов и их свойств, развитие терапевтических методов лечения и предупреждения этих заболеваний, а также разработка их прижизненной диагностики являются актуальными задачами. Успешное решение этих задач во многом зависит от фундаментальных знаний амилоидогенеза: выяснения свойств амилоидов разных белков, знания факторов, регулирующих их образование и разрушение, их эффектов на жизнедеятельность разных клеток и т.д. В наибольшей мере это относится к мышечным амилоидозам как к наименее изученным. Амилоидные отложения найдены при кардиомиопатиях, миокардитах и миозитах в
мышцах и кровеносных сосудах, однако их белковая природа до сих пор неизвестна.
Данная работа посвящена изучению способности белков семейства тайтина формировать амилоидные фибриллы. В настоящее время известна большая группа белков семейства тайтина (тайтин, С-белок, Х-белок, Н-белок и другие), относящихся к саркомерным белкам поперечно-полосатых мышц позвоночных. Они связаны с миозин-содержащими (толстыми) нитями и составляют 15% от общего количества белка в саркомере. Хотя предположения о присутствии белков немиозиновой природы в структуре толстых нитей высказывались давно (Рере, 1967; Huxley, 1967; Hanson et al, 1971), до начала 70-х годов прошлого века природа этих белков была неизвестна. Обнаружение с помощью ДСН-гель-электрофореза С-белка и Х-белка в качестве минорных примесей в препаратах миозина (Starr & Offer, 1971), а также открытие тайтина (= коннектина) (Maruyama et al., 1977; Wang et al., 1979; Maruyama et al., 1981) стимулировали их выделение и изучение. С-белок в быстрых волокнах скелетных мышц и его изоформа Х-белок в медленных волокнах (Yamamoto & Moos, 1983; Starr & Offer, 1983) располагаются на поверхности толстых нитей с периодом 43 нм (Bennett et al., 1986; Soteriou et all., 1993), связываясь одновременно с тайтином и миозином. Тайтин является продольным элементом саркомерного цитоскелета поперечно-полосатых мышц позвоночных. До его открытия мышечное сокращение рассматривалось с позиции взаимодействия двух типов нитей: тонких (актин-содержащих) и толстых (миозин-содержащих), скользящих относительно друг друга (Huxley & Hanson, 1954; Huxley & Niedergerke, 1954). Обнаружение тайтина и выяснение его локализации позволило выдвинуть гипотезу о трехнитевой модели саркомера (Wang, 1984; 1985).
Исследования показали, что тайтин и белки его семейства могут выполнять много разных функций в саркомере. Предполагается, что они играют существенную роль в миогенезе при сборке толстых нитей и формировании структуры саркомера, участвуют в регуляции актин-миозинового взаимодействия при мышечном сокращении. Наличие 90% Р-складчатой структуры в этих белках создает возможность формирования ими амилоидов. Поэтому изучение способности белков семейства тайтина формировать амилоидные фибриллы представляет большой интерес в связи с их возможным участием в развитии
амилоидозов. Ранее при изучении агрегационных свойств белков, связанных в саркомере с миозиновыми нитями, было обнаружено, что один из них (Х-белок) образует in vitro спирально скрученные ленточные фибриллы (Bennet et al., 1985). Авторы указали на визуальное сходство этих структур с амилоидными фибриллами, образуемыми Ар-пептидом в мозге при болезни Альцгеймера. Однако разные структурные параметры фибрилл Х-белка заставили авторов сомневаться в этом предположении и, возможно, поэтому тестирование их на амилоидогенность не было проведено. Эти наблюдения и высокое содержание Р-складчатой структуры стимулировали наше исследование амилоидной природы агрегатов, образуемых Х-белком и другими саркомерными белками семейства тайтина.
Структура и функции молекул С-белка, Х-белка и Н-белка
С-белок впервые был выделен из скелетных мышц кролика (Offer et al., 1973). Его количество составляет около 2% от массы миофибрилл и около 4% от массы толстой нити. Молекула С-белка скелетных мышц кролика представляет собой короткую гибкую ниточку диаметром 2-4 нм и длиной 20-30 нм (Фрейдина и др., 1980; Bennett et al., 1985) и содержит одну полипептидную цепочку состоящую из семи иммуноглобулин-подобных (IgC2) и трех фибронектин-подобных (FnlH) глобулярных доменов по 90-100 аминокислотных остатков каждый (Einheber & Fischman, 1990; Furst et al., 1992; Okagaki et al., 1993; Weber et al., 1993) (рис. 3). Изоформа С-белка в сердечной мышце млекопитающих с молекулярным весом 150-155 кДа (Yamamoto & Moos 1983; Hartzell & Glass, 1984) содержит дополнительный IgC2 домен (Со), а также фосфорилируемые участки (Kasahara et al, 1994; Gautel et al., 1995; Yasuda et al., 1995). С-белок сердечной мышцы
Показана способность сердечного С-белка фосфорилироваться разными протеинкиназами в условиях in vivo и in vitro (Jeacocre & England, 1980; Hartzell & Titus, 1982; Hartzell & Glass, 1984; Hartzell, 1985; Lim et al., 1985; Gautel et al., 1995; Mohamed et al., 1998). Молекулярный вес С-белка скелетных мышц по данным ДСН-гель-электрофореза 135 кДа (Yamamoto & Moos, 1983; Starr & Offer, 1983), a по данным анализа нуклеотидной последовательности генов, кодирующих этот белок, составляет 128.1 кДа (Weber et al., 1993). Аминокислотный состав белка характеризуется довольно высоким содержанием пролина, что коррелирует с низким содержанием а-спирали в его молекуле. Методом седиментации показано, что С-белок связывается с высоким сродством с миозином (Callaway & Bechtel, 1981; Yamamoto & Moos, 1983). Электронно-микроскопические исследования подтвердили это связывание для С-белка: он декорирует реконструируемые миозиновые нити и паракристаллы легкого меромиозина (ЛММ) in vitro (Moos et al., 1975; Starr & Offer, 1978; Safer & Pepe, 1980; Фрейдина и др., 1980; Подлубная, 1981; Podlubnaya et al., 1990). Показана способность С-белка связываться с актином (Moos et al., 1976; Moos et al., 1978; Moos, 1981; Фрейдина и др., 1980) и тайтином (Koretz et al., 1993; Soteriou et al., 1993; Furst et al., 1992; Freiburg & Gautel, 1996). При снижении ионной силы ниже физиологических значений (\i 0.1) С-белок скелетных мышц кролика образует аморфные агрегаты (Фрейдина 1987).
К настоящему времени установлены участки связывания С-белка с другими саркомерными белками. В СООН-концевой части молекулы С-белка (IgC2 домен Сю) расположен участок связывания со стержневой частью миозиновых молекул (Okagaki et al., 1993; Alyonycheva et al., 1997; Gilbert et al., 1996; Gilbert et al., 1999). Между C8 и Сio доменами в молекуле С-белка расположен участок связывания с тайтином (Furst et al., 1992; Freiburg & Gautel, 1996). Участок связывания с актином находится на NH2- конце молекулы С-белка (Moolman-Smook et al., 2002; Squire et al., 2003).
Первоначальные электронно-микроскопические исследования локализации С-белка в psoas мышце кролика (Craig & Offer, 1976) и pectoralis major мышце цыпленка (Рере & Drucker, 1975) с помощью поликлональных антител показали, что этот белок локализуется на поверхности толстых нитей в середине каждой половины А-диска в семи полосах (5-11) с периодом 43 нм (рис. 1). В дальнейшем анализ поперечных криосрезов скелетных мышц кролика с помощью флюоресцирующих поликлональных антител (Starr et al., 1985; Bennett et al., 1986) показал, что С-белок локализован в третьей, а также с четвертой или пятой по одиннадцатую полосы в быстрых мышечных волокнах m. psoas и т. plantaris кролика. В медленных волокнах этих мышц, а также в m. soleus С-белок отсутствует (Bennett et al., 1986). Количество молекул С-белка, приходящееся на одну полосу локализации, по разным данным составляет от 2 до 4 (Offer et al., 1973; Morimoto & Harrington, 1974; Craig & Offer, 1976; Pepe & Drucker, 1979; Starr & Offer, 1982; Bennett et al., 1985; Moolman-Snook et al, 2002; Squire et al., 2003).
В настоящее время предметом дискуссий продолжает оставаться вопрос о периоде локализации С-белка и способе его упаковки в структуре толстых нитей. Одни авторы считают, что период локализации этого белка определяется упаковкой миозина в нити и равен -43 нм (Offer, 1972; Rome et al., 1973; Moos et al., 1975; Craig & Offer, 1976; Craig, 1977; Фрейдина и др., 1980; Шпагина и др., 1983; Dennis et al., 1984; Bennett et al., 1985; Podlubnaya et al., 1990). По мнению других авторов, период локализации С-белка превышает период упаковки миозина и составляет -44 нм (Sjostrom & Squire, 1977; Squire 1981). Вопрос о периодичности С-белка в толстых нитях тесно связан с вопросом о способе его упаковки в нитях. Предполагается, что С-белок локализован на поверхности ствола толстых нитей, охватывая их как обруч (Craig & Offer, 1976; Star & Offer, 1983; Moolman-Snook et al., 2002). Это предположение согласуется с данными о стабилизирующем эффекте С-белка на структуру миозиновых нитей (Фрейдина и др., 1980; Trinick & Cooper, 1980). Другие авторы допускают возможность того, что часть молекул С-белка упакована вдоль толстой нити (Koretz, 1979; Koretz et al., 1982; Squire, 1981; Malinchik & Lednev, 1992; Squire et al., 2003). Недавно была предложена новая модель упаковки С-белка в толстых нитях (Squire et al., 2003), которая объясняет различия в данных о периоде локализации С-белка. По мнению этих авторов СООН-концевые части молекул С-белка (с С7 по Сю домены) упаковываются вдоль толстой нити с осевым периодом повторения, равным 42.9 нм. NH2-KOHUbi молекул С-белка отходят от ствола толстой нити и связываются с тонкими нитями, что приводит к появлению на дифракционных картинах рефлексов, соответствующих периоду 43.4 нм.
Современные представления о строении и формировании амилоидных фибрилл
В настоящее время доказано, что амилоидные отложения имеют сложный состав, в котором фибриллярные и глобулярные белки связаны с полисахаридами. Кроме фибриллярного компонента (амилоидных фибрилл) амилоидные отложения содержит также гепарин, гепарин сульфаты, протеогликаны и другие компоненты. Эти вещества не образуют фибрилл ни в условиях in vivo, ни в условиях in vitro, но они могут влиять на морфологию амилоидных фибрилл, а также играть решающую роль в дальнейшем формировании отложений. Физико-химические особенности амилоида определяют его тинкториальные свойства, выявляемые при использовании красителя Конго красного, тиофлавина Т или S.
Таким образом, термин "амилоидоз" объединяет болезни, которые характеризуются отложением белковых масс, имеющих фибриллярную ультраструктуру и обладающих двойным лучепреломлением в поляризованном свете. Значительный прогресс в выяснении структурных свойств амилоидных фибрилл был сделан с помощью рентгеновской дифракции фибриллярного материала, выделенного из биологических тканей, а также сформированного in vitro (Blake et al., 1996; Blake & Serpell, 1996; Sunde & Blake, 1997). Эти исследования показали, что все амилоидные фибриллы имеют р-складчатую структуру с отдельными р-слоями, ориентированными параллельно главной оси фибриллы. Это означает, что белок-предшественник амилоидов, не имеющий такой структуры, подвергается молекулярным перестройкам.
На сегодняшний день известно около 20 белков, образующих амилоидные фибриллы in vivo и участвующих в патогенезе амилоидозов (таблица 2), а также белки, амилоиды которых изучены только in vitro (таблица 3) (Uversky & Fink 2004). Ар-пептид, инсулин, лизоцим, транстиретин, амилин, хантингтин, тау-белок, а-синуклеин, миоглобин, и другие различаются между собой по аминокислотным последовательностям, вторичным и третичным структурам. Однако, несмотря на это, образованные ими амилоидные фибриллы имеют Р-складчатую структуру. Эксперименты in vitro со многими белками показали, что перед образованием амилоидов структура их молекул должна претерпевать трансформацию типа «а-спираль - р-складчатость», что, как правило, требует жестких условий, несовместимых с условиями in vivo (низкие значения рН, высокие температуры, длительная инкубация, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п.). Белки-предшественники амилоидов могут иметь Р-структуру, или а-спираль или содержать как обе структуры. Переход растворимой формы прионного белка в фибриллярную сопровождается уменьшением содержания а-спирали и увеличением р-структуры. Ар-пептид при образовании амилоидных фибрилл также претерпевает трансформацию структуры от а-спирали к Р-структуре. Все эти данные указывают на то, что белки, вторичная структура которых представлена а-спиралью, претерпевают трансформацию типа "а-спираль - р-структура" до или во время образования фибрилл. Однако процесс фибрилообразования не всегда требует перехода а-спирали в Р-структуру. Так, белок транстиретин представляет
Процесс олигомеризации и фибриллообразования происходит при взаимодействии молекул белка за счет электростатических, водородных и гидрофобных взаимодействий с образованием димеров - начальных строительных блоков (рис. 4). Например, значительный вклад в фибриллогенез Ар-пептида вносят гидрофобные взаимодействия. Дальше димеры олигомеризуются в тетрамеры, октамеры и т. д. с образованием протофибрилл шириной 2-3 нм и длиной до 200 нм. Эти образования накапливаются в так называемой лаг-фазе, характерной для кинетики фибриллообразования. Окончание лаг-фазы связано с образованием протофибрилл ами фибрилл диаметром 7-8 нм. События, происходящие в лаг-фазе, представляют большой интерес, так как именно на этой стадии с помощью микроскопа можно наблюдать кинетику фибриллогенеза, а также морфологию постепенно формирующихся агрегатов (т. е. динамику процесса) (Zerovnik, 2002). Причем, один и тот же белок может образовывать амилоидные агрегаты разной морфологии, т. е. обладать полиморфизмом, как например, Ар(1-40)-пептид, который образует зрелые структуры разного типа (рис. 5), такие как "ветвящиеся", "спиральные" и "ленточные" (Goldsbury et al., 2000). Полиморфизм был показан и для других белков, таких как амилин (Goldsbury et al., 1997), кальцитонин (Bauer et al., 1995), инсулин (Jimenez et al., 2002).
Образование амилоидных фибрилл: (а) - нативная структура белка, (б) промежуточное состояние, в котором части полипептидной цепи находятся в ненативной конформации, (в) - полностью развернутое состояние, (г) образование межмолекулярного Р-слоя, опосредованное развернутыми областями приводит к олигомеризации белка, (д) -дальнейшее образование Р-складчатой структуры, (е) - образование протофибрилл, (ж) -формирование зрелых фибрилл (Jobansson, 2003).
Чемберлейн в 2000 г. показал, что фибриллы, образованные различными белками, обладают сходными структурными свойствами: все они образованы из протофибриллярных нитей, имеющих 2-5 нм в диаметре и содержащих от двух до пяти Р-слоев. При этом размеры протофибрилл никак не связаны с количеством аминокислотных остатков белка-предшественника фибриллообразования. Так протофибриллы SH3 домена, включающего 90 аминокислотных остатков, состоят из двух р-слоев, а лизоцим, состоящий из 130 аминокислотных остатков, образует протофибриллярные нити, содержащие четыре р-слоя (Chamberlain et al., 2000).
Выделение и очистка миозина из сердечной мышцы
Миозин миокарда выделяли по методу (Margossian, 1985) с модификациями. Из-за того, что миокард, по сравнению со скелетной мышцей, содержит большое количество соединительнотканных элементов, сократительные белки экстрагировались из миофибрилл (Solaro et al., 1971).
Получение миофибрилл. Миокард гомогенизировали в 4-кратном объеме (здесь и далее - относительно веса мышц) раствора «А» (0.3 М сахароза, 10 мМ имидазол-НС1, 2 мМ ЭГТА, 0.1 мМ PMSF, рН 7.0), гомогенат собирали центрифугированием 3-5 мин при 3-7 тыс. об./мин. Гомогенат промывали в 4 объемах раствора «В» (60 мМ КС1, 30 мМ имидазол-НС1, 2 мМ хлорид магния, 1 мМ ДТТ, азид натрия, рН 7.0), и центрифугировали 3-5 мин при 3-7 тыс. об./мин. Процедуру повторяли 4-5 раз до полной отмывки гомогената от крови. Для инактивации Са-зависимых протеаз гомогенат промывали в 4 объемах раствора «С» (раствор «В» с 2 мМ ЭГТА) и центрифугировали 3-5 мин при 3-7 тыс. об ./мин. Для удаления мембранных компонентов гомогенат в течение 10 мин инкубировали в 8 объемах раствора «D» (1% тритон Х-100 в растворе «В») и полученные таким образом миофибриллы собирали центрифугированием 3-5 мин при 3-7 тыс. обУмин. Миофибриллы отмывали от тритона 4-кратной промывкой в 8 объемах раствора «В» и собирали центрифугированием 3-5 мин при 3-7 тыс. обУмин.
Экстрагирование миозина. Доколоночный миозин экстрагировали из миофибрилл раствором «Е» (0.3 М КС1, 0.1 М КН2Р04, 50 мМ К2НР04, 10 мМ MgCl2, 10 мМ пирофосфат Na, 2 мМ АТФ, 1 мМ ЭГТА, 0.2 мМ PMSF, рН 6.5) из расчета на 1 грамм миофибрилл - 3.5 мл раствора, на льду в течение 3 часов и при постоянном перемешивании. Экстракт отделяли 10 мин центрифугированием при 7-Ю тыс. об./мин. Супернатант дополнительно осветляли 1 час при 100 тыс. обУмин. Актомиозин осаждали диализом (10-12 часов) против раствора «F» (10 мМ имидазол-НС1, 1 мМ ДТТ, азид натрия, рН 7.0) и центрифугированием 30 мин при 7-Ю тыс. обУмин. Осадок далее тщательно гомогенизировали в растворе «G» (40 мМ пирофосфат Na, 1 мМ ДТТ, азид натрия, рН 7.5) из расчета 5 мл на 1 мг, и диализовали 12 часов против раствора «G». Полученный доколоночный миозин перед хроматографией осветляли 40 мин при 100 тыс. обУмин.
Очистка миозина. Доколоночный миозин очищали методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-52 целлюлозе (Margossian, 1985). Носитель предварительно тщательно уравновешивали в растворе «Н» (20 мМ Na пирофосфат, 1 мМ ДТТ, азид натрия, рН 7.5). Колонку (LKB, диаметр - 1.5 см) набивали в расчете 1.5 мл суспензии носителя на 1 мг доколоночного миозина и промывали вышеуказанным раствором до рН 7.5 элюата. Доколоночный белок с концентрацией не более 5 мг/мл наносили на колонку и промывали раствором «Н» до схода фракции минорных белков, которые собирали для дальнейшей очистки (см. раздел 3.2.3.). Миозин элюировали 0-0.5 М градиентом хлорида калия, приготовленном на растворе «Н». Собирали фракции по 1-2 мл.
Х-белок, С-белок и Н-белок очищали по методу (Offer et al., 1973). Фракции Х-, С- и Н-белков, полученные при хроматографической очистке миозина скелетных мышц на колонке с носителем DEAE-Sephadex А-50, концентрировали сульфатом аммония до степени насыщения 2.08 М и осаждали центрифугированием в течение 1 часа при 3000 g. Осадок растворяли в буфере, содержащем 0.3 М КС1, 4.8 мМ К2НР04, 5.2 мМ КН2Р04, 0.1 мМ ДТТ, 0.1 мМ NaN3, рН 7.0, и диализовали против этого буфера до полного удаления сульфата аммония. Разделение белков проводили на колонке с гидроксиапатитом, уравновешенным в этом же буфере, для снятия белков с колонки использовали фосфатный градиент. Такая же процедура очистки применялась и для С-белка миокарда кролика и человека.
Тайтин из скелетных мышц кролика выделяли по методу (Soteriou et al., 1993) с модификациями. Мышцы гомогенизировали в 3-х кратном (по отношению к массе мышц) объеме раствора, содержащего 50 мМ КС1, 5 мМ ЭГТА, 1 мМ ЫаНСОз,, 1 мМ ДТТ, 0.1 мМ NaN3, рН 7.0. Для уменьшения деградации тайтина в процессе выделения в раствор добавляли набор ингибиторов протеаз: 1 мМ PMSF, 20 мкг/мл ингибитора трипсина, 10 мкг/мл леупептина.
Полученный мышечный гомогенат центрифугировали в течение 5-Ю минут при 2500 g. Супернатант отбрасывали, а процедуру промывки повторяли 5-6 раз. К промытому осадку добавляли 2-х кратный объем экстрагирующего раствора, содержащего 0.9 М КС1,2 мМ MgCl2, 2 мМ ЭГТА, 0.5 мМ ДТТ, 0.1 мМ NaN3, 1 мМ PMSF, 10 мМ имидазола-HCl, рН 7.0. Раствор также содержал 40 мкг/мл соевого ингибитора трипсина и 20 мкг/мл леупептина.
Электронно-микроскопическое изучение агрегационных свойств АР(25-35)-пептида в сравнении с агрегацией молекул Х-белка
Для многих амилоидогенных белков также характерна временная зависимость образования амилоидных фибрилл. Например, мышечная ацилфосфатаза способна формировать аморфные агрегаты после первых часов инкубации в присутствии трифлуороэтанола при рН 5.5 и температуре 25С, и только через 45 дней появляются пучки фибрилл (Chiti et al., 1999). А(3( 1-40)-пептид при рН 7.2, температуре 37С в присутствии 0.1% уксусной кислоты после 4 часов инкубации образует аморфные агрегаты и только после 48 часов - длинные фибриллы (Qahwash et al., 2003). Эксперименты со многими белками показали, что перед образованием амилоидов in vitro структура их молекул должна претерпевать трансформацию типа "а-спираль - Р-складчатость", что, как правило, требует жестких условий, не совместимых с условиями in vivo (низкие значения рН, высокие температуры, длительная инкубация, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п.). Согласно результатам нашего исследования, образование амилоидных фибрилл Х-белком происходит в мягких условиях (рН 7.0, температура 3-5С, ионная сила, близкая к физиологической) и быстрее, чем в случае мышечной ацилфосфатазы человека и АР(1-40)-пептида. Следует также отметить, что в отличие от других белков, наличие 90% Р-складчатой структуры у Х-белка способствует его быстрой агрегации в амилоидные фибриллы in vitro, что указывает на возможность быстрого роста его амилоидных депозитов in vivo.
Амилоидные депозиты нередко обнаруживаются в сердце и кровеносных сосудах при кардиомиопатиях и миокардитах. Особо следует отметить амилоидоз сердца (кардиологический амилоидоз), который, как утверждают медицинские специалисты (Сторожаков и др., 2000), к сожалению, не включается в схему дифференциального диагноза даже при резистентной к лечению сердечной недостаточности и диагностируется посмертно. Учитывая все перечисленное выше, мы решили проверить, может ли С-белок, выделенный из сердца пациента с дилатационной кардиомиопатией, образовывать амилоидные фибриллы. Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) - заболевание миокарда неизвестной этиологии, диагностирующееся по расширению (дилатации) левого, правого или обоих желудочков. Нарушается систолическая функция желудочков, возможно развитие застойной сердечной недостаточности, часто наблюдается нарушение ритма желудочков и предсердий. В ходе развития ДКМП сердце постепенно, но необратимо, теряет свою функциональную активность (Хубутия, 2001; Шумаков и др., 2003). Наши исследования показали, что в разных растворах (ЗО мМ КС1, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.01 М К-фосфат, рН 7.0; 30 мМ СаС12, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 30 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 30 мМ MgCl2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 50 мМ MgCl2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.15 М глицин-КОН, рН 7.0) С-белок миокарда человека образует аморфные агрегаты и пучки линейных фибрилл длиной до 3 мкм и шириной до 500 нм (рис. 22 Г). пучки фибрилл С-белка миокарда кролика, сформированные в растворе, содержащем 0.01 М К-фосфат, рН 7.0, и в 0.03 М СаС12, 10 мМ имидазола, рН 7.0 (В); Г - пучки фибрилл С-белка миокарда человека при ДКМП, сформированные в растворе, содержащем 0.03 М СаС12, 10 мМ имидазола, рН 7.0. Негативное окрашивание 2% раствором уранилацетата. Шкала 100 нм. С-белок миокарда кролика в тех же условиях образует аморфные агрегаты и пучки линейных фибрилл длиной более 2 мкм и шириной до 500 нм (рис. 22 А-В). Амилоидная природа фибрилл С-белка миокарда человека и кролика была подтверждена поляризационной и флуоресцентной микроскопией, а также спектральными методами при взаимодействии их с Конго красным и тиофлавином Т (Марсагишвили и др., 2006).
Таким образом, с помощью разных специфических тестов мы показали, что белки семейства тайтина способны формировать амилоиды in vitro. Дальнейшие наши исследования были направлены на тестирование токсических свойств амилоидов этих белков, на поиск подходов к их разрушению и предотвращению их образования.
Для выяснения возможных подходов к разрушению амилоидных фибрилл, образуемых белками семейства тайтина, нами было проведено in vitro тестирование эффекта тетрациклина и фуллерена на структуру их фибриллярных агрегатов. Мы показали, что антибиотик тетрациклин разрушает фибриллы, формируемые белками семейства тайтина. На электронно-микроскопических снимках видны фрагменты фибрилл Х-белка после действия тетрациклина, длиной 24-64 (рис. 23) нм и отдельные молекулы Х-белка. Действие тетрациклина на фибриллы X-белка подобно его действию на амилоиды Ар-пептида и тау-белка при болезни Альцгеймера, на депозиты хантингтина при болезни Хантингтона, а также на амилоидные фибриллы прионного белка (Forloni et al., 2001). Рис. 23. Электронные микрофотографии спирально скрученных ленточных фибрилл Х-белка (А) сформированных в растворе, содержащем ЗО мМ KCI, 10 мМ имидазола, рН 7.0, а также фрагментов фибрилл Х-белка (Б) и его молекул (В) после действия тетрациклина. Весовое соотношение белка и тетрациклина 1:1. Негативное окрашивание 2% раствором уранилацетата. Шкала 100 нм.
В последнее время фуллерены рассматривают как лекарственные препараты (Пиотровский и др., 2006), в том числе и при лечении нейродегенеративных болезней (Lee et all., 2006). Невизуальным методом показано ингибирующее влияние фуллерена на фибриллогенез АР(11-25)-пептида и АР(1-40)-пептида т vitro (Kim & Lee, 2003). Рис. 24. Структура фуллерена С60. Молекула имеет форму правильного усеченного икосаэдра, в котором атомы углерода располагаются на сферической поверхности в вершинах 20 правильных шестиугольников и 12 правильных пятиугольников так, что каждый шестиугольник граничит с 3 шестиугольниками и 3 пятиугольниками, а каждый пятиугольник граничит только с шестиугольниками. Вследствие этого каждый атом углерода в молекуле Сбо находится в вершинах двух шестиугольников и одного пятиугольника и принципиально неотличим от других атомов углерода. Диаметр молекулы С6о равен примерно 0.71 нм (и это при молекулярной массе 720 дальтон).
Методом электронной микроскопии in vitro мы впервые продемонстрировали антиамилоидогенную способность фуллерена С60 по отношению к фибриллам АР(25-35)-пептида и Х-белка.
Добавление фуллерена С6о к спирально скрученным лентам Х-белка в весовом соотношении 1:2 приводило к их декорации сферическими агрегатами фуллерена, уменьшению длины и ширины лент. Сформированные фибриллы X-белка имеют осевую периодичность -60-70 нм и ширину -40 нм, а при связывании с фуллереном ширина уменьшается до 10 нм (рис. 25 Г). Более того, в присутствии фуллерена С60 Х-белок в молекулярной форме не формировал амилоидных фибрилл (рис. 25 В). Мы также обнаружили, что добавление фуллерена С60 к амилоидам АР(25-35)-пептида в молярном отношении 1:6 и инкубация их в течение 24 часов при 37С приводит к декорации лент сферическими агрегатами фуллерена, уменьшению их длины и количества по сравнению с контролем (рис. 26 Д). Короткие узкие (-5 нм в диаметре) протофибриллы АР(25-35)-пептида также появляются в таких образцах. В этом случае не наблюдается свободных агрегатов фуллерена, они все связаны с короткими лентами и протофибриллами. Увеличение количества фуллерена, добавленного к амилоидам А(3(25-35)-пептида (молярное отношение 15:6), приводит к увеличению количества протофибрилл Ар(25-35)-пептида, декорированных сферическими частицами фуллерена С6о (рис. 26 Е, Ж).
Похожие диссертации на Изучение амилоидных свойств саркомерных белков семейства тайтина
