Введение к работе
Актуальность темы исследований
Мембраны играют ключевую роль как в структурной организации, так и в функционировании всех клеток. Функционирование биомембран контролируется как их белковыми, так н липндными составляющими, преимущественно фосфолипидами. Получение и интерпретация структурной информации дает возможность понять связь между взаимодействием компонент мембраны и их функцией.
Среди мембранных белков хорошо известны такие структурные мотивы как трансмембранные и периферические а-спнрали, Р-бочонкн. В последнее время в качестве источника новых структурных мотивов, обеспечивающих связывание с мембранами, исследуются р-складчатые полипептиды, в частности, токсины из яда змей. Яд кобры Naja oxiana содержит цитотоксины и неиротоксины, обладающие общим структурным мотивом (Рис, 1). В данной работе были изучены цитотоксины I и Л (CTI и СТН) и нейротоксин II (NTH). Суммарное содержание этих токсинов в сухом яде составляет около 40 %. Эти токсины являются небольшими ( ~ 60 аминокислотных остатков) основными белками, так как они содержат 9—12 положительно заряженных аминокислотных остатков лизина и аргинина. Они характеризуются трехпетельной укладкой полипептидной цепи, формируемой тяжами антипараллелыюй р-структуры, стабилизированной 4-мя дисульфидными связями (Рис. 1). Хотя аминокислотные последовательности и структурный мотив цитотоксинов и нейротоксинов гомологичны, спектры их биологической активности существенно отличаются.
Цитотоксины проявляют гемолитическую и цитотоксическую активности, способны приводить к деполяризации мембран миофибрил. Некоторые цитотоксины проявляют кардиотоксическую активность при малых концентрациях, приводя к увеличению частоты сердцебиения, а при больших концентрациях могут вызывать остановку сердца. Исследуются токсические эффекты цитотоксинов на клетки опухоли. Предполагается, что различие в цитотоксической активности молекул связано не с деталями вторичной структуры белков, а со спецификой взаимодействия боковых цепей аминокислотных остатков с липидами. Было показано, что структура молекул цитотоксинов сохраняется при встраивании в липидное окружение. Связывание цитотоксинов с фосфолипидами определяет их способность приводить к лизису различных клеток. Предполагалось, что эти эффекты проявляются благодаря способности цитотоксинов взаимодействовать с липидами и биологическими мембранами посредством комбинации как электростатических, так и гидрофобных сил. В экспериментах с модельными липндными мембранами показано, что цитотоксины приводят к слиянию фосфолипидных везикул, изменению термотропных характеристик фосфолипидных мембран, индуцируют фазовое разделение в смесях анионных и цвиттерионных фосфолипидов. Данные исследования привели к делению цитотоксинов на Р- и S- типы, которые различаются присутствием пролина-31 (30) или серина-29 (28) в окончании второй петли (Рис. 1а). Тем не менее веб еще отсутствует понимание связи менаду способами взаимодействия цитотоксинов с липидами и функцией цитотоксинов в биомембране. Для прояснения этой связи было изучено связывание цитотоксинов CTII и CTI с фосфолипидами, исследовано влияние цитотоксинов на упаковку фосфолипидов в составе модельных мембран.
Неиротоксины из яда кобр являются высокоэффективными ингибиторами никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР). Мембранная же активность нейротоксинов, в отличие от цитотоксинов, изучена крайне слабо, хотя предполагается, что и для нейротоксинов мембраносвязанное состояние играет важную роль при взаимодействии с никотиновым ацетилхолиновым рецептором (нАХР). Поэтому представляет интерес детально исследовать взаимодействие нейротоксинов с мембранами, таким образом, получить информацию о мембраноактивном сайте молекулы токсина и его кооперативности с сайтом, блокирующем нАХР.
С.-Петербург
ОЭ 200gait/(ffiS
3.) 1 10 20 ЗО 40 SO 60
n І ^=^ ' І 1 ' '
СТІІ LKCKKLVPLF SKTCPAGKNL CYKMFMVAftP HVPVKRGCID VCPKSSLLVK YVCCNTDKCN
СТІ: LKCNKLVPIA YKTCPEGKNL CYKMFMMSDL TIPVKRGCID VCPKNSLLVK YVCCNTDRCN
NTH: LECHHQQSSQ PPTTKTCSGE TNCYKKWWSD HRGTIIERGC GCPKVKPGVN LNCCRTDRCN N
PlIC. 1
а) Аминокислотные последовательности трех токсинов из яда среднеазиатской кобры Naja oxiana. Для цитотоксинов жирным шрифтом выделены остатки пролина-30 и ссрина-28 в окончании второй петли. Дисульфидные связи показаны над аминокислотной последовательностью токсинов (вверху) и их пространственные структуры (внизу). Для цитотоксинов номера остатков указаны сверху, а для нейротоксина приведены под аминокислотной последовательностью, б, в, г) Ленточные представления структур молекул токсинов. Жёлтым цветом показаны дисульфидные связи (структуры взяты из PDB-банка: код 1СВ9 для CTII, 1RL5 для СП и 1NOR для NTH).
При исследовании липид/белковых взаимодействий важно получить структурно-динамическую информацию как о белке в связанном с мембраной состоянии, так и о характеристиках самой липидной мембраны особенно их изменениях вследствие взаимодействия с белком. В ЯМР спектроскопии в качестве модельных мембран используются липидные бислои, так как, обладая большим радиусом кривизны, они наиболее близки по своим характеристикам к биомембранам. При исследовании бислойных модельных мембран всё более широкое применение находит методика анализа 31Р-ЯМР спектров широких линий фосфолипидных дисперсий. С ростом стационарных магнитных полей современных ЯМР спектрометров всё большее значение приобретают эффекты ориентирования молекул фосфолипидов в магнитном поле спектрометра. Для анализа 31Р-ЯМР спектров таких систем необходима разработка эффективных и доступных научному сообществу методов анализа экспериментальных спектров. В диссертации представлены разработанные методики анализа 3|Р-ЯМР спектров, реализованные в виде доступной научному сообществу программы «P-FIT».
При ЯМР исследованиях белков, связанных с бислойной мембраной, по причине большого размера бислойных мембранных систем и, как следствие, замедления вращательной диффузии белка классические ЯМР методики высокого разрешения сталкиваются с трудностями из-за сильного уширения ЯМР сигналов в спектре белка.
Поэтому представляет интерес разработка подходов, позволявших преодолеть дашше ограничения и охарактеризовать состояние белка в связшшом с бислойной мембраной состоянии. В диссертации описаны предложенные в работе методики применения ЯМР спектроскопии высокого разрешения для характеристики связанного с липндным бислоем состояния белка.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы является определение характера изменений в лнпндной бислойной мембране вследствие взаимодействия с шгготоксинами (СТІ и СТО) и нейротокснном (NTH), а так же определение роли мембраносвязанного состояния нейротоксина II на этапе взаимодействия с никотиновым ацетнлхолнновым рецептором.
Методы исследования
В диссертационной работе использованы взаимодополняющие методики спектроскопии ЯМР, позволяющие охарактеризовать как индуцированные белком изменения в липидиой мембране, так и расположение белков при связывании с липндным бислоем.
Методика "Р-ЯМР спектроскопии широких линий использована для определения изменений в состоянии фосфолипидов вследствие взаимодействия с молекулами исследуемых токсинов.
Расположение молекул нейротоксина II при связывании с бислойной фосфолипидной мембраной определено с помощью гетероядерной спектроскопии ЯМР высокого разрешения, позволившей охарактеризовать изменения химических сдвигов сигналов белка вследствие связывания с мембраной.
Теоретические методики молекулярного моделирования использованы для детализации модели связывания белков с бислойной фосфолипидной мембраной.
Научная новизна работы
Полученные экспериментальные данные позволяют охарактеризовать различия встраивания токсинов CTI, СТН и NTH в бислойные фосфолипидные мембраны, роль поверхностной плотности заряда бислоя. Методами 'Н- и 3 Р- ЯМР определены области взаимодействия молекул цитотоксинов с бислойной анионной мембраной. Полученные экспериментальные данные согласуются с теоретическими данными по взаимодействию рассматриваемых токсинов с мембраной. При изучении связывания цитотоксинов с мембранами дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG) показано, что, встраиваясь в мембрану, они влияют как на ориентацию «головок» фосфолипидов, так и могут приводить к изменению еб упругих характеристик. При соотношениях белок/липид выше некоторой пороговой величины происходит разрушение бислойной упаковки липндов в мембране и образование изотропной фазы. Исследованы факторы, определяющие стехиометрию изотропной фазы и условия ее формирования. Таким образом, удалось проанализировать механизм взаимодействия цитотоксинов с их мишенью - липндным бислоем.
Исследовано влияние свойств липидиой мембраны на связывание NTH с бислоем. Методами 'Н-, 3|Р- и гетероядерной ЯМР спектроскопии изучено взаимодействие NTII с липидными мембранами, моделирующими нативное окружение нАХР, состава диолеилфосфатидилхолин(ооРС)/диолеилфосфатидилсерин(оорз)/холестерол(С1ю1)=3:1:1 и DOPS. При связывании NTH с бислоем, как и для случая цитотоксинов, нейротоксин влияет на характер упаковки липидов, однако не приводит к разрушению бислоя. Были получены и проанализированы кривые связывания NTII с липидиой мембраной, исследован характер встраивания молекул NTII в бислой. Получены данные, характеризующие изменения в упаковке и расположении фосфолипидов, вследствие связывания NTH. Методами гетероядерной ЯМР спектроскопии высокого разрешения с использованием 15N меченного NTH определён сайт связывания молекулы NTII с
липидным бислоем. ЯМР данные по расположению сайта связывания NTII с бислойиой лишщной мембраной дополнены теоретическими результатами молекулярного моделирования. Полученные данные позволяют предложить «механизм мембранного катализа» при поиске лигандом (NTH) мембранного рецептора (нАХР): 1) повышение концентрации положительно заряженного NTII у анионной мембраны согласно теории Гуи-Чапмена; 2) формирование «нужной» для связывания с нАХР ориентации NTII на мембране; 3) замена трёхмерного диффузионного поиска в растворе молекулой нейротоксина ацетилхолинового рецептора на более быстрый поиск посредством латеральной диффузии NTII в мембраносвязанном состоянии.
Научная и практическая ценность (
Научная значимость работы определяется новизной и важностью перечисленных выше результатов. Основные направления их практического использования таковы:
полученные модели взаимодействия трехпетельных токсинов с бислойными липидными мембранами, а так же роль этого взаимодействия в функционировании токсинов помогают понять молекулярные механизмы взаимодействия нейротоксина с нАХР, влияния цитотоксинов на предотвращение формирования тромбов в кровеносных сосудах (предотвращение сердечного приступа и инсульта), а также токсических эффектов яда кобр на различные клетки, в частности, клетки опухоли;
разработанные в диссертации методы анализа 3|Р-ЯМР спектров широких линий фосфолипидных дисперсий могут применяться для обработки экспериментальных спектров бислойных липосом с частичной ориентацией фосфолипидов в магнитном поле спектрометра, также позволяя получать дополнительную информацию об упругих характеристиках липидного бислоя;
использованные в работе подходы по применению гетероядерной спектроскопии ЯМР высокого разрешения могут быть использованы для построения модели связывания белков на биологических мембранах.
Апробация работы
Основные материалы, изложенные в диссертации, докладывались и обсуждались на семинарах в «Институте биоорганической химии» им. М. М. Шемякина и 10. А. Овчинникова, представлены па международных конференциях: VIII Международный Семинар по Магнитному Резонансу (Ростов-на-Дону, Россия, 2006), Международном Симпозиуме и Летней Школе «Ядерный Магнитный Резонанс в Конденсированной Материи» (Санкт-Петербург, Россия, 2005 г. и 2006 г.), Зимней Международной Молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, Россия, 2003 г. и 2005 г.). Полученные результаты докладывались также на XIV Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Крым, Украина, 2006).
Публикации
Основные результаты диссертации изложены в 3 статьях в реферируемых изданиях и 8 тезисах докладов, представленных на российских и международных научных конференциях.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, трёх глав, включая литературный обзор, результатов и обсуждения, заключения и выводов. Общий объем работы составляет 106 страниц, включая 33 иллюстрации, 1 таблицу и список литературы, содержащий 137 наименований.
