Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 3-Ю
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11 -25
Ионные механизмы компенсации гипоксического ацидоза и 11-19
лактоза
Деэнергизация, гликолиз и гликогенолиз в гипоксических 19-23
условиях
Молекулярно-генет ические нарушения пр и гипоксии 23-25
ПРОТОКОЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ЭКСПЕРИМЕНТА 26-35
Протоколы перфузии изолированного сердца крысы Wistar 26-29
Проточная нормоксическая перфузия изолированного сердца. 26
Проточная гипоксическая перфузия изолированного сердца. 26-29
Введение вещества на фоне проточной перфузии. 29 Методы измерения интегративныххарактеристик 30-32
Измерение амплитуды и частоты сокращения изолированного 30-31 сердца.
Измерение концентрации лактата в пробах постперфузионной 31-32 жидкости.
Электронно-зондовый микроанализ 32-35
Подготовка лиофилизированных криосрезов 32-33
Параметры электронно-зондового микроанализа 33-34
Расчет концентрации элементов 34-35 РЕЗУЛЬТАТЫ 36-42 ОБСУЖДЕНИЕ 43-75 Стандартизация условий экспериментальной гипоксии и 43-54 анализа
Количественный электронно-зондовый микроанализ. 43-45
Деэнергизация кардиомиоцита, моделируемая в условиях 46-54
гипоксической перфузии (без глюкозы) изолированного сердца.
Изменение концентрации элементов (Na, СІ, К) в мышечной 55-74
клетке изолированного сердца при гипоксии
Анализ изменения Na/K баланса в мышечной клетке 55-62 изолированного сердца при гипоксии.
Анализ изменения концентрации хлора в мышечной клетке 62-67 изолированного сердца при гипоксии.
Анализ изменения в мышечной клетке концентрации рубидия- 67-75 маркера потока внеклеточного калия в миоцит.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 76
ВЫВОДЫ 77-78
ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 79-103
Введение к работе
Возможность коррекции гипоксических изменений предполагает обратимый переход мышечной клетки в новое физиологическое состояние. В частности, предполагается, что наличие сдвигов в активности специфичных механизмов ионного транспорта позволяет миоциту переживать гипоксию. Для такого предположения есть основания,, если исходить из того, что жизнь возникла и длительное время развивалась в среде с низким содержанием кислорода. В этот период эволюции возникли и закрепились механизмы адаптации клетки к гипоксическим условиям.
В какой степени эволюционно-обусловленные перестройки ионтранспортирующих систем способны проявить себя в современных условиях представляется одной из интригующих проблем миологии (Booth et al., 2002). При условии, что такие древние механизмы сохранились, они могут актвизироваться в экстремальных физиологических ситуациях и при патологических состояниях, для которых характерно понижение уровня кислорода в ткани. Известно, что быстрые и выраженные проявления гипоксии обусловлены деэнергизацией кардиомиоцита, которая сопровождается уменьшением концентрации АТФ в цитозоле и накоплением в нем протонов и анионов лактата (Allen, Orchard, 1987). К "спящим" механизмам, которые в гипоксических условиях непосредственно реагируют на снижение энергетического статуса миоцита можно отнести модификацию Na/K-АТФазы
4 (Pogorelov et al., 1999; Rodriguez et al., 2002) и систему пассивного транспорта калия: АТФ-зависимый калиевый канал (Noma, 1983); Na -зависимый калиевый канал (Kameyama et al., 1984; Niu, Meech, 2000); кислород- зависимый калиевый канал: Ко2 (Conforti et al,, 2000). Условия работы всего энергозависимого комплекса, ответственного за транспорт ионов калия при гипоксии, рассмотрены ранее (Silverman, Stern, 1994; Pierce, Czubryt, 1995; Погорелов и др., 2002; Погорелов и др., 2003).
В гипоксических условиях активизируются также и процессы, чья активность направлена на компенсацию гипоксического ацидоза и лактоза. В их ряду: Na+-H+ обмен (Lazdunsky et al., 1985; Karmazyn et ah, 1999); Na+-HCC>3 симпорт (Camilion de Hurtado et al., 1995; Korichneva et al., 1995; Camilion de Hurtado et al., 1996a); СГ-ОН" обмен и СІ -H симпорт (Hun, Vaughan-Jones, 1997); СГ-НСОз" обмен (Linn et al., 1995); 2CI"/Na+/K+ симпорт (Ramasamy et al., 2001); K-Cl симпорт (Case, 1972); Lact"-H+ симпорт (Leeks, Halestrap, 1978); Lact'-K+ симпорт (Kleber, 1983; Kleber, 1984; Lindinger et al., 1996); Lact'-Cl" и Lact -НС03 обмен (Halestrap, McGivan, 1979).
Перечисленные выше системы адаптации кардиомиоцита к гипоксической деэнергизации включают перенос протонов и ионов натрия, калия и хлора через цитоплазматическую мембрану, что приводит к изменению ионного гомеостаза клетки. Изменение баланса основных внутриклеточных элементов (К, Na, СІ) не только описывает интегративную активность систем компенсации
5 1 гипоксической деэнергизации, но и индуцирует молекулярно-генетические '* изменения в мышечной клетке сердца. Поэтому для понимания механизмов, лежащих в основе адаптации кардиомиоцита к условиям гипоксии, актуальным является анализ изменения во времени концентрации натрия, хлора и калия на * фоне нарастающей деэнергизации.
В настоящее время хорошо отработана методика измерения внутриклеточного рН (Camilion de Hurtado et al., 1995; CamiHon de Hurtado et al., 1996; Schafer et al., ч 2000). Однако не ясно, в какой степени гипоксический ацидоз и лактоз связаны с с изменением баланса основных цитоплазматических ионов (Na, СІ, К); не понятно соотношение активного и пассивного транспорта калия в системе t адаптации миоцита к гипоксии. Прямого ответа на поставленные вопросы не было получено из-за отсутствия адекватного метода определения концентрации элементов (Na, СІ, К) в отдельной морфологически идентифицированной клетке t в ткани. Решение данной проблемы стало возможным после развития t электронно-зондового микроанализа (Goldstein et al., 1992) и криогенных методов подготовки срезов ткани для электронной микроскопии (Echlin, 1992; ' . Warley, 1997). Указанные подходы позволили разработать прямой метод t, измерения концентрации натрия, хлора и калия в цитоплазме мышечной клетки в ткани сердца ex vivo (Pogorelov et al., 1991).
