Введение к работе
Актуальность проблемы. Утрата способности клеток сердечной мышцы млекопитающих к самообновлению, присущему костным рыбам и амфибиям, которые полностью восстанавливают объем и функцию сердца при удалении 20% миокарда (Poss, 2007), является непреодолимым препятствием для полноценной регенерации поврежденного сердца. Уже через несколько дней постнатального развития у млекопитающих наблюдается полное прекращение пролиферации и остановка клеточного цикла кардиомиоцитов (Claycomb, 1992). Установлено, что в сердце происходит переключение гиперплазии на гипертрофию между третьим и четвертым днями после рождения животного (McGill, Brooks, 1995; Li et al., 1996). Долгое время существовало мнение, что дальнейший рост сердечной мышцы идет за счет увеличения объема кардиомиоцитов (гипертрофии), а не их числа, и сердце рассматривалось как окончательно дифференцированный орган, не способный к самообновлению (MacLellan, Schneider, 2000; Di Felice et al., 2009).
Однако в последние годы появились данные о наличии в сердце млекопитающих регенерационного потенциала. Так, в поврежденном миокарде человека было обнаружено присутствие незрелых пролиферирующих клеток, показана репликация миоцитов, кариокинез, цитокинез и очаги спонтанных миокардиальных регенераций (Beltrami et al., 2001). Установлено, что миокард однодневной мыши способен к полному восстановлению структуры и функции после 15% резекции левого желудочка, но эта способность утрачивается уже к концу первой недели жизни (Porrello et al., 2011). Более того, в литературе описано существование нескольких типов сердечных стволовых клеток (СК) и клеток-предшественников кардиомиоцитов (ПК), способных к самообновлению и дифференцировке в кардиомиоциты: Sca-1+ СК (Oh et al., 2003), c-kit+ СК (Beltrami et al., 2003), Isl1+ резидентные ПК (Laugwitz et al., 2005) и SP клетки (Side population cells) (Pfister et al., 2005). Выявлено также образование клеточных кластеров в культуре, или «кардиосфер», из тканей взрослого сердца мыши и человека (Messina et al., 2004).
Дальнейший поиск и изучение свойств сердечных стволовых клеток является одной из самых актуальных проблем физиологии миокарда. Имеющиеся в настоящее время данные о морфофункциональных свойствах СК сердца, факторах, регулирующих их самообновление и направленную кардиодифференцировку, фрагментарны и недостаточны (Parmacek, Epstein, 2005; Anversa et al., 2006). Более того, получение чистых популяций сердечных стволовых клеток, применяемое в работах многих авторов, приводит к изолированию СК из их естественного микроокружения и к потере необходимых сигналов и факторов, ответственных за самообновление и дифференцировку СК.
Проблема разработки клеточных технологий для регенерации сердца до сих пор остается нерешенной (Behfar et al., 2010; Malliaras, Marbn, 2011). В связи с этим существует острая необходимость создания новых клеточных моделей миокарда, которые позволили бы детально изучить все этапы пролиферации и дифференцировки сердечных СК и ПК в условиях, приближенных к их нативному микроокружению. Использование таких моделей будет способствовать развитию представлений о физиологии сердечных стволовых клеток и позволит расширить клинические подходы к лечению заболеваний сердца.
Решение проблемы регенерации сердечной ткани также связано с поиском путей снижения функциональных нарушений в условиях ишемии/реперфузии, когда значительно усиливается образование активных кислородных радикалов (АКР) (Литвицкий и др., 1994). Одной из наиболее действенных мер является введение экзогенных соединений, которые ингибируют либо сами АКР, либо источники их генерации. В этой связи создание клеточных тест-систем, позволяющих проводить скрининг антиоксидантных препаратов, способствовало бы наиболее быстрому подбору оптимальных кардиопротекторов.
Цель диссертационной работы - функциональная характеристика зрелых кардиомиоцитов, а также резидентных стволовых клеток и клеток- предшественников кардиомиоцитов сердца новорожденных и взрослых крыс в первичной культуре.
Задачи:
-
Изучить морфофункциональные свойства клеток миокарда неонатальных крыс.
-
Выявить резидентные стволовые клетки и клетки-предшественники в культуре клеток миокарда новорожденных крыс и охарактеризовать их пролиферацию и дифференцировку.
-
Оценить степень зрелости популяции клеток, развивающихся в кардиомиоцитарном направлении, по формированию у них электромеханического сопряжения.
-
Установить способность стволовых клеток и клеток-предшественников кардиомиоцитов к пролиферации, кардиодифференцировке и спонтанному сокращению у взрослых крыс в условиях первичной культуры.
-
Изучить антиоксидантную активность макромолекулярной системы, синтезированной на основе декстрана и феноксана в условиях экспериментального окислительного стресса на модели зрелых неонатальных кардиомиоцитов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
В первичной культуре сердечных клеток новорожденных крыс имитируются поведение и закономерности функционирования клеток миокарда, имеющие место в интактном сердце в первые дни после рождения крысы.
-
В культуре клеток сердечной мышцы новорожденных крыс происходит пролиферация резидентных стволовых клеток и клеток-предшественников с образованием клонов. Направленная кардиодифференцировка этих клеток в составе колоний приводит к формированию популяции зрелых кардиомиоцитов, способных к спонтанному сокращению.
-
В культуре клеток миокарда взрослых крыс имеет место пролиферация резидентных стволовых клеток и клеток-предшественников с формированием колоний, но полной кардиодифференцировки этих клеток не наблюдается.
-
Создана in vitro модель регенерационного кардиомиогенеза, позволяющая изучать процессы пролиферации и дифференцировки сердечных стволовых клеток и клеток-предшественников и in vitro модель зрелых неонатальных кардиомиоцитов, которая может служить в качестве тест-системы для скрининга лекарственных препаратов.
Научная новизна работы. Впервые в культуре клеток миокарда новорожденных крыс линии Wistar детально изучены физиологические свойства кардиомиоцитов на протяжении восьми-десяти дней культивирования и выявлены закономерности их функционирования. Установлено, что в культуре имитируются процессы прекращения деления и перехода от гиперплазии к гипертрофии клеток миокарда, происходящие в интактном сердце млекопитающих в первые дни после рождения. Это позволяет рассматривать ее в качестве модели для изучения прекращения пролиферации кардиомиоцитов.
Впервые in vitro охарактеризован процесс формирования спонтанно сокращающихся колоний кардиомиоцитов, образованных из резидентных стволовых клеток c-kit+- и Sca+-типов и клеток-предшественников Isl1+-типа, и представлено доказательство кардиомиогенной дифференцировки резидентных кардиопредшественников в первичной культуре клеток неонатального миокарда крыс. Данный процесс имитирует регенерационный кардиомиогенез от резидентной клетки-предшественника до формирования колоний зрелых сокращающихся кардиомиоцитов.
В условиях первичной культуры клеток миокарда взрослых крыс выявлена пролиферативная активность резидентных стволовых клеток (c-kit+, Sca+, Isl1+), но установлена их сниженная способность к кардиомиогенезу.
Показана адекватность использования модели зрелых неонатальных кардиомиоцитов крыс в качестве тест-системы для скрининга антиоксидантных препаратов. Впервые выявлено кардиопротекторное действие синтезированной макромолекулярной системы (МСАО) на основе декстрана и феноксана (Д+Ф).
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные существенно расширяют представления о физиологии зрелых кардиомиоцитов и резидентных стволовых клеток сердца млекопитающих. Научно-практическая значимость работы заключается, прежде всего, в том, что модель резидентных стволовых клеток и кардиопредшественников имитирует регенерационный кардиомиогенез, а модель зрелых неонатальных кардиомиоцитов предоставляет широкие возможности для изучения физиологии зрелых кардиомиоцитов. В связи с этим предложенные клеточные модели могут быть использованы в исследованиях по проблеме регенерации сердечной мышцы, при скрининге лекарственных (кардиотропных) препаратов, а также при разработке новых методов клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на ХХ форуме физиологов России (Москва, 2007), II Съезде общества клеточной биологии (С.-Петербург, 2007), конференции «Focus on Microscopy 2007» (Испания, 2007), Russian-Norwegian symposium “Myocardial protection: molecular, pathophysiological and clinical aspects” (Russia, 2008), VII Европейском биофизическом конгрессе (Италия, 2009), XXI всероссийском съезде Физиологического общества (Калуга, 2010), Европейском кардиологическом конгрессе (Швеция, 2010), а также на Санкт-Петербургском физиологическом обществе (2009), проблемной комиссии ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова (2010), III Съезде физиологов СНГ (Ялта, 2011) и др.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы, из них - две статьи в Российских рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, одна статья в сборнике работ, 20 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 141 страницах машинописного текста, иллюстрирована 38 рисунками и двумя таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы, состоящего 174 источника, из них 141 иностранных.
