Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Организация и функционирование клеточных сетей в гиппокампе в постнатальном периоде развития 9-18
1.2. Са2+ сигнализация в нейронных сетях 19-33
1.3. Са2+ сигнализация в глиальных сетях 33-40
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1 Объект исследования 41
2.2. Схема экспериментов in vitro 41-45
2.3. Приготовление переживающих срезов мозга 45-46
2.4. Функциональный флуоресцентный Са2+ имиджинг 46
2.4.1. Методика введения флуоресцентных зондов внутрь клеток 46-47
2.4.2. Методика визуализации и регистрации Са2+ активности клеток срезов мозга 47
2.4.3. Методика оценки Са2+ осцилляций по данным функционального флуоресцентного имиджинга 47-48
2.5. Методика фармакологического анализа 48-49
2.6. Метод кросс - корреляционного анализа 49-50
2.7. Методика статистической обработки 50
Глава 3. Результаты исследования и обсуждение 51
3.1. Исследование динамики спонтанных Са2+ осцилляций клеток срезов гиппокампа крыс раннего (P5-8, P14-16) и позднего (P21-25)
постнатального периода развития 51-54
3.2. Исследование параметров спонтанных Са2+ осцилляций клеток срезов гиппокампа крыс раннего (P5-8, P14-16) и позднего (P21-25)
постнатального периода развития при температуре перфузионного раствора 24С и 35С 54
3.2.1. Са2+ активность клеток СА3 поля срезов гиппокампа крыс раннего P5-8 постнатального периода развития при температуре перфузионного раствора 24С и 35С 54-57
3.2.2. Са2+ активность клеток СА3 поля срезов гиппокампа крыс раннего P14-16 постнатального периода развития при температуре перфузионного раствора 24С и 35С 57-59
3.2.3. Са2+ активность клеток СА3 поля срезов гиппокампа крыс раннего P14-16 постнатального периода развития при температуре перфузионного раствора 24С и 35С 60-63
3.3. Исследование Са2+ активности клеток СА3 поля срезов гиппокампа крыс раннего (P5-8, P14-16) и позднего (P21-25) постнатального периода развития при нарушении проведения возбуждения в нейронной сети с помощью блокады потенциал - зависимых натриевых каналов тетродотоксином 63-70
3.4. Исследование Са2+ активности клеток СА3 поля срезов гиппокампа крыс позднего (Р21-25) постнатального периода при воздействии возбуждающих нейротрансмиттеров (АТФ, L- глутамат) 70-76
3.5. Анализ вклада различных рецепторов и каналов в формирование спонтанной Са2+ активности клеток СА3 поля срезов гиппокампа крыс позднего (P21-25) постнатального периода 76-82
Заключение 83-85
Выводы 86-87
Приложение 1 88-91
Список сокращений 92-94
Список литературы 95-
- Са2+ сигнализация в нейронных сетях
- Функциональный флуоресцентный Са2+ имиджинг
- Исследование параметров спонтанных Са2+ осцилляций клеток срезов гиппокампа крыс раннего (P5-8, P14-16) и позднего (P21-25)
- Исследование Са2+ активности клеток СА3 поля срезов гиппокампа крыс раннего (P5-8, P14-16) и позднего (P21-25) постнатального периода развития при нарушении проведения возбуждения в нейронной сети с помощью блокады потенциал - зависимых натриевых каналов тетродотоксином
Са2+ сигнализация в нейронных сетях
потенциалов, увеличиваются Гиппокамп или аммонов рог (hippocampus, cornus Ammonis) - парное образование в головном мозге позвоночных, расположен в глубине височных долей мозга и является основной структурой лимбической системы. Морфологически гиппокамп представлен стереотипно повторяющимися модулями, связанными между собой и с другими структурами. Модульное строение обусловливает способность гиппокампа генерировать высокоамплитудную ритмическую активность. Связь модулей создает условие циркулирования активности в гиппокампе при обучении. При этом возрастает амплитуда синаптических нейросекреция клеток гиппокампа, число шипиков на дендритах его нейронов, что свидетельствует о переходе потенциальных синапсов в активные. Многочисленные связи гиппокампа со структурами как лимбической системы, так и других отделов мозга определяют его многофункциональность.
Нейроны гиппокампа отличаются выраженной фоновой активностью. В ответ на сенсорное раздражение реагирует до 60% нейронов гиппокампа. Особенность строения гиппокампа, взаимосвязанные модули обусловливают цикл генерирования возбуждения в нем, что выражается в длительной реакции (до 12 с) нейронов на однократный короткий стимул [15,16].
У крыс в процессе эмбриогенеза образование пирамидных клеток происходит на 16-19 день внутриутробного развития в вентрикулярной зоне коры, из которой происходит миграция клеток в радиальном направлении в область гиппокампа [17–20]. В поле СА1 гиппокампа образование пирамидного слоя происходит на 20 день эмбриогенеза, а в поле СА3- на 22 день, однако небольшое количество пирамидных клеток мигрируют до процесса рождения. Развитие гранулярных клеток зубчатой фасции происходит позднее, примерно 85% этих клеток образуются после рождения [21]. Интересной особенностью области зубчатой фасции является сохранение у гранулярных клеток нейрогенеза у взрослого организма. Кроме того группой Soriano в 1986 году, было обнаружено, что в гиппокампе образование ГАМКергических клеток происходит раньше пирамидных клеток. Интернейроны возникают в вентрикулярной зоне конечного мозга и мигрируют трансгенциально по отношению к развивающейся коре и их «прибытие» сопутствует образованию зачатка гиппокампа [19,21]. Исследования на крысах [22] и на приматах [23] показали, что функциональные ГАМКергические синапсы формируются раньше глутаматергических, как в интернейронах, так и в пирамидных нейронах гиппокампа. Работами группы Hennou в 2002 году было продемонстрировано, что в переживающих срезах гиппокампа крыс Р0 5% интернейронов не имело функциональных синапсов, 17% - имело только ГАМКергические синапсы, а 78% - ГАМКергические и глутаматергические синапсы. Созревание синаптической афферентации в пирамидных нейронах происходит позже, чем в интернейронах. Так 80% пирамидных нейронов поля СА1 среза гиппокампа крысы Р0 не имело функциональных синапсов, 10% - имело только ГАМКергические синапсы, 10% -ГАМКергические и глутаматергические синапсы [22]. До образования функциональных синапсов незрелые пирамидные нейроны гиппокампа обладают существенной ГАМКа-рецептор опосредованной тонической проводимостью [24]. Хотя ГАМК является основным тормозным медиатором в ЦНС взрослого организма, ее возбуждающее действие было обнаружено у незрелых нейронов [25]. Дальнейшие исследования в этой области показали, что в гамкэргической передаче существует онтогенетический сдвиг, характерный для развивающихся нейронов [25]. Также следует отметить, что внутриклеточная концентрация Cl- у незрелых нейронов выше, чем у зрелых, что можно объяснить работой ГАМКа рецепторов. У незрелых нейронов значение потенциала покоя составляет -15 mV, в процессе созревания нейронов внутриклеточная концентрация Cl- уменьшается, что приводит к более отрицательным значениям потенциала покоя у взрослых клеток [26]. Деполяризующее действие, опосредованное работой ГАМКа рецепторов медиирует трансмиссию, что является общей чертой незрелых нейронов гиппокампа [22,23,25,27], неокортекса, гипоталамуса, мозжечка и спинного мозга [25]. ГАМКергическая деполяризация часто активирует потенциал-зависимые Са2+ токи, которые влияют на развитие нейронов [23,28,29].
Трофическое действие ГАМК включает синтез ДНК миграцию и морфологическое созревание отдельных нейронов и синаптогенез. До функционального созревания синапсов ГАМК оказывает свое действие через тоническую активацию ГАМКа рецепторов [30]. Нейротрофический фактор мозга (BDNF) является важным медиатором трофических эффектов ГАМК. Кроме того при удалении Mg2+ блока NMDA рецепторов ГАМКергическая деполяризация может вызывать пластические изменения в синапсах. Во взрослом мозге внеклеточная концентрация ГАМК регулируется Na+ зависимым захватом [31,32]. Основным транспортером ГАМК в нейронах является GAT-1 который экспрессируется преимущественно в аксонах и пресинаптических окончаниях ГАМКергических интернейронов. Кроме того, GAT-1 экспрессируется в глии [33]. Исследования на крысах [34], мышах, кроликах и приматах [23], показали, что наличие гигантских деполяризующих потенциалов (ГДП) являются общей эволюционной особенностью клеток незрелого гиппокампа млекопитающих. Сетевые события отражающие ГДП также называются «популяционными берстами», «гигантскими ГАМКергическими потенциалами» и «ранними сетевыми осцилляциями» [35]. ГДП легко детектируется при регистрации полевых потенциалов, а также они связаны с внутриклеточными берстами потенциалов действия и Сa2+ осцилляциями [36].
Функциональный флуоресцентный Са2+ имиджинг
Было проведено исследование динамики спонтанных кальциевых осцилляций клеток срезов гиппокампа крыс раннего (P5-8, P14-16) и позднего (P21-25) постнатального периода развития. Температура, солевой и газовый состав перфузионного раствора были постоянными во всех экспериментах. В экспериментах был использован раствор нормального Рингера осмолярностью 290 мОсм, температура перфузионного раствора составляла t=35 С. В результате проведенных экспериментов были зарегистрированы спонтанные Са2+ осцилляции, проанализировано их количество за минуту и их длительность в нейронах и астроцитах поля СА3 гиппокампа, сводные данные представлены в гистограммах (рис. 4) и таблице (Приложение 1, табл. 1).
Было показано, увеличение длительности и уменьшение количества Са осцилляций пирамидных нейронов и интернейронов при переходе от раннего этапа постнатального развития к позднему. Длительность Са осцилляций астроцитов так же увеличивалась в процессе постнатально онтогенеза, а изменение частоты имело сложный характер. Так при сравнении животных младшей возрастной группы (Р5-8) с животными Р14-16 наблюдалось увеличение количества астроцитарных Са осцилляций, а при сравнении с группой Р21-25 показано значительное снижение до значений ниже уровня показанных у животных младшей возрастной группы.
Уменьшение количества Са осцилляций при переходе от раннего постнатального периода к позднему обусловлено формированием и усложнением синаптически связанных нейронных сетей и переходом электрических синапсов в химические. Переходным периодом является 14-16 день постнатального развития, когда у клеток начинается образование химических синапсов, к 21 дню -наблюдается полностью сформированная нейронная сеть. В отсутствии афферентации, в условиях среза, эта сеть является молчащей, поэтому внешние проявления активности сети, выражающиеся в Са2+ активности клеток, очень низкие. Кроме того, при рассмотрении особенностей возраст-зависимой Са2+ сигнализации следует учитывать, что в процессе эмбриогенеза крыс представлены только каинатные и метаботропные рецепторы глутамата, остальные типы рецепторов появляются только на 5-7 день постнатального развития. А максимальная вовлеченность глутамат и АТФ - активируемых рецепторов в Са2+ сигнализацию наблюдается на 20-25 день постнатального развития [103,104, 118, 124, 130,146]. Электрически связанная сеть является малоконтролируемой, возбуждение свободно распространяется по сети, вовлекая в работу все клетки, что проявляется в высокой Са2+ активности клеток гиппокампа крыс раннего постнатального периода развития. Кроме того, высокая Са2+ активность клеток гиппокампа крыс раннего постнатального развития может быть связана с деполяризующим действием ГАМК на данном этапе онтогенеза. Так, группой ученых во главе с Ben-Ari в 1989 году при исследовании онтогенеза пирамидных нейронов CA3 поля срезов гиппокампа крыс было показано, что переход к гиперполяризующему действию ГАМК происходит на 5-6 день постнатального развития животного. Сетевые события, связанные с ГАМК - опосредованными ГДП исчезали к 12 дню постнатального развития крыс. А недавними исследованиями было показано, что переход от возбуждающего действия к ингибирующему ГАМКергических потенциалов происходит примерно к 14 дню постнатального развития. Важно отметить, что в процессе развития появление ГДП совпадает с формированием ионотропной глутаматергической передачей в пирамидных нейронах CA3 поля гиппокампа [23,34]. Было показано, что ионотропная глутаматергическая передача, опосредована в основном работой AMPA рецепторов и имеет решающее значение для генерации ГДП. Таким образом, в процессе постнатального развития гиппокампа можно выделить несколько этапов, влияющих на формирование клеточных сетей.
В срезе гиппокампа крыс позднего этапа постнатального развития спонтанная Са2+ активность низкая с связи с отсутствием активной нейронной сети. В этом случае спонтанные Са2+ осцилляции, вероятно, обусловлены в основном метаболической активностью клеток. Для проверки данной гипотезы были проведены эксперименты с изучением влияния температуры перфузионного раствора на Са2+ активность клеток СА3 поля срезов гиппокампа крыс, так как известно, что температура регулирует скорость внутриклеточных метаболических процессов.
Было проведено исследование изменений спонтанных Са2+ осцилляций клеток срезов гиппокампа крыс раннего (P5-8) постнатального периода развития в зависимости от температуры перфузионного раствора. Солевой и газовый состав перфузионного раствора были постоянными во всех экспериментах. В экспериментах был использован раствор нормального Рингера осмолярностью 290 мОсм, температура перфузионного раствора составляла t=24С и t=35 С. Методом конфокальной флуоресцентной микроскопии были получены изображения поля СА3 гиппокампа крыс раннего постнатального развития (Р5-8) (рис. 5).
Рисунок 5. Конфокальные изображения поля СА3 гиппокампа крысы Р(5), полученные с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM 510 DuoScan. Флуоресценция Sulforhodamine 101 (650-710 нм) и Oregon Green-488 BAPTA 1AM (500-530 нм). Идентификация клеток: желтые клетки - астроциты, зеленые нейроны. Масштаб 20 мкм.
В результате проведенных экспериментов были зарегистрированы спонтанные Са2+ осцилляции, проанализировано их количество за минуту и их длительность в нейронах и астроцитах поля СА3 гиппокампа (Приложение 1, табл. 2). На рисунке 6 представлены гистограммы, отражающие изменения количества Са2+ осцилляций и их длительности в зависимости от температуры перфузионного раствора, при которой регистрировалась активность клеток.
Исследование параметров спонтанных Са2+ осцилляций клеток срезов гиппокампа крыс раннего (P5-8, P14-16) и позднего (P21-25)
В результате проведенных исследований было показано, что параметры Са2+ осцилляций клеток СА3 поля срезов гиппокампа изменяются в зависимости от периода постнатального развития крыс. Уменьшение количества Са2+ осцилляций с возрастом обусловлено формированием и усложнением синаптически связанных нейронных сетей, переходом электрических синапсов в химические. Переходным периодом является 14-16 день постнатального развития, а на 21 день -наблюдается полностью сформированная нейронная сеть. Электрически связанная сеть является малоконтролируемой, возбуждение свободно распространяется по сети, вовлекая в работу все клетки, что проявляется в высокой Са2+ активности у клеток гиппокампа крыс младшей возрастной группы. В срезе гиппокампа зрелого мозга спонтанная Са2+ активность низкая с связи с отсутствием активной нейронной сети. В этом случае спонтанные Са2+ осцилляции, были обусловлены в основном метаболической активностью клеток, что было показано в экспериментах с изучением влияния температуры перфузионного раствора на Са2+ активность клеток.
Чтобы доказать роль нейронных сетей в формировании спонтанных Са2+ осцилляций в клетках поля СА3 срезов гиппокампа разных возрастных групп, были проведены эксперименты с блокадой проведения возбуждения в нейронных сетях с помощью блокатора потенциал-зависимых натриевых каналов тетродотоксина (1 мкМ). Нами было показано, что в раннем периоде постнатального онтогенеза Са2+ активность нейронов полностью зависела от активности нейронной сети и резко снижалась при нарушения проведения сигнала по нейронной сети, в которой нейроны связаны электрическими синапсами. Спонтанная Са2+ активность клеток гиппокампа животных средней возрастной группы так же зависела от сетевой активности, существующей за счет частичной сохранности электрических синапсов на данном этапе развития, поэтому добавление тетродотоксина так же уменьшало количество Са2+ осцилляций в нейронах. Снижение астроцитарной Са2+ активности в группе Р14 является ответной реакцией астроцитов на активность нейрональной сети, что доказывает наличие нейрон-глиальных взаимосвязей с 14 дня постнатального развития. Отсутствие эффекта тетродотоксина на спонтанную Са2+ активность клеток группы Р 21-25, объясняется отсутствием спонтанной активности нейронной сети в СА3 поле среза гиппокампа, в которой нейроны связаны химическими синапсами. Соответственно мы не наблюдали и изменения астроцитарной Са2+ активности. Кроме того, была исследована структура нейронных сетей, в результате чего было показано, что в раннем постнатальном периоде существует строгая синхронизация активности пирамидных нейронов и интернейронов, за счет формирования стабильной нейронной сети при условии проведения возбуждения через электрические синапсы. Астроциты на данном этапе развития в общую функциональную сеть не вовлечены. В зрелой сети нарушение проведения возбуждения по аксонам практически не влияло на Са2+ активность клеток, так как спонтанная сетевая активность в условиях среза отсутствует. Дальнейшие исследования были направлены на изучение Са2+ активности клеток поля СА3 срезов гиппокампа крыс позднего (Р21-25) постнатального периода развития. Для изучения механизмов спонтанных Са2+ осцилляций в нейронах и астроцитах зрелой сети были проведены эксперименты с добавлением возбуждающих нейротрансмиттеров - АТФ и L-глутамата. Было показано, что при сохранении проведения возбуждения в зрелой нейронной сети, АТФ и L-глутамат зависимая активация синаптической передачи приводит к значительному повышению Са2+ активности в сети, что отражалось в наличии синхронизации между клетками при добавлении возбуждающих нейротрансмиттеров. Кроме того, была исследована роль рецепторов и каналов, работа которых приводит к увеличению внутриклеточной концентрации Са2+ в клетках. Проведенные эксперименты показали, что в возникновении Са2+ осцилляций в нейронах большую роль играют ионотропные и метаботропные рецепторы глутамата и потенциал зависимые Са2+ каналы L-типа. А полное исчезновение Са2+ осцилляций в клетках поля СА3 наблюдалось только при регистрации активности клеток в бескальциевом растворе.
Таким образом, в результате проведенного исследования было показано, что изменения Са2+ активности клеток поля СА3 гиппокампа крыс, происходящие в процессе постнатального развития, напрямую связанны с функционированием нейронных сетей и метаболическим состоянием клеток. Са2+ сигнализация в зрелом мозге - это сложный многокомпонентный процесс, вовлекающий различные рецепторные системы, способные к взаимозамещению при нарушении нормального функционирования одной или нескольких из них.
Исследование Са2+ активности клеток СА3 поля срезов гиппокампа крыс раннего (P5-8, P14-16) и позднего (P21-25) постнатального периода развития при нарушении проведения возбуждения в нейронной сети с помощью блокады потенциал - зависимых натриевых каналов тетродотоксином
Следующим этапом нашей работы явилось изучение различных молекулярных механизмов, обуславливающих спонтанную Са2+ активность в клетках. Была исследована роль ионотропных и метаботропных рецепторов глутамата, потенциал зависимых Са2+ каналов L-типа, пуринергических рецепторов, рецепторов инозитол три фосфата и рианодина, TRPC каналов, а также митохондриального Na+/Ca2+ обменника, работа которых приводит к увеличению внутриклеточной концентрации Са2+ .
Для изучения вклада каналов и рецепторов в генерацию Са2+ осцилляций нейронов и астроцитов поля СА3 срезов гиппокампа крыс позднего (Р21-25) постнатального развития, в перфузионный раствор добавлялись блокаторы и антагонисты, с целью исключения участия исследуемых молекулярных механизмов в Са2+ активности клеток (табл. 6).
В результате проведенных экспериментов было проанализировано изменение количества Са осцилляций в минуту и их длительность в нейронах и астроцитах поля СА3 гиппокампа при добавлении блокаторов и антагонистов, сводные данные представлены в таблице 7.
В. Рисунок 20. Относительное изменение количества Са2+ - осцилляций в (А) пирамидных нейронах, (Б) интернейронах, (В) астроцитах поля СА3 гиппокампа крыс Р21-25. По оси ординат – относительное изменение количества Са2+ осцилляций в %; по оси абсцисс – параметры регистрации Са2+ активности клеток при добавлении в перфузионный раствор веществ: (1) MK-801, 20 мкМ; (2) CNQX, 20 мкМ; (3) MCPG, 20 мкМ; (4) Verapamil, 100 мкМ; (5) TNP-ATP triethylammonium salt, 20 мкМ; (6) Suramin hexasodium salt, 100 мкМ; (7) 2-APB, 100 мкМ; (8) Dantrolene, sodium salt, 30 мкМ; (9) CGP 37157, 10 мкМ; (10) - регистрация при добавлении в перфузионный раствор всех вышеперечисленных веществ (11) бескальциевый перфузионный раствор. Пунктирная линия - контрольные значения Са2+ активности при регистрации с добавлением в перфузионный раствор ТТХ, 1 мкМ. р критерий Стьюдента, n=150.
Было показано, что при добавлении в перфузионный раствор антагониста NMDA рецептора- MK-801, происходит снижение количества Са2+ осцилляций в клетках поля СА3 гиппокампа крыс: в пирамидных нейронах на 30%, в интернейронах на 28%. При применении CNQX- антагониста AMPA и каинатных рецепторов Са2+ активность пирамидных нейронов уменьшалась на 31%, а интернейронов на 21%. Добавление в перфузионный раствор антагониста метаботропных глутаматных рецепторов приводило к снижению количества Са 2+ осцилляций на 30% только у пирамидных нейронов. Блокатор потенциал-зависимых Ca2+ каналов Verapamil влиял на активность пирамидных нейронов и интернейронов, которая выражалась в снижении Са2+ активности клеток на 45% и 30%, соответственно.
При регистрации Са2+ активности клеток в перфузионном растворе, содержащем все исследуемые блокаторы и антагонисты наблюдалось снижение количества Са2+ осцилляций у пирамидных нейронов и интернейронов на 70%, у астроцитов на 53%. Полное исчезновение Са2+ осцилляций у клеток происходило при регистрации в бескальциевом перфузионном растворе.
Проведенные эксперименты показали, что в возникновении Са2+ осцилляций в пирамидных нейронах большую роль играют ионотропные и метаботропные рецепторы глутамата и потенциал зависимые Са2+ каналы L-типа. В генерацию Са2+ осцилляций в интернейронах вносят большой вклад ионотропные рецепторы глутамата и потенциал зависимые Са2+ каналы L-типа. При оценке вклада данных рецепторов и каналов в генерацию Са2+ осцилляций в астроцитах, достоверно значимых различий показано не было. Так же было показано значительное снижение Са2+ активности клеток при регистрации с добавлением в перфузионный раствор блокаторов и антагонистов всех исследуемых каналов и рецепторов. Выбор набора исследуемых каналов и рецепторов был обусловлен, тем, что в работе группы ученых, во главе с Nakamura N.H. было показано, что экспрессия рецепторов к остальным нейротрансмиттерам (ацетилхолину, серотонину, глицину) в гиппокампе составляет менее 10% от общего уровня [109].
Большое влияние рецепторов глутамата на Са2+ активность клеток было обусловлено преобладанием их экспрессии в гиппокампе, что так же было продемонстрировано в работах группы Nakamura N.H. Однако снижение Са2+ активности клеток более, чем в 2 раза происходило только при добавлении в перфузионный раствор «смеси» используемых блокаторов и анагонистов, что позволяет говорить о сложной организации Са2+ сигнализации во взрослой клеточной сети. Таким образом, Са2+ сигнализация в зрелом мозге - это сложный многокомпонентный процесс, вовлекающий различные рецепторные системы, способные к взаимозамещению при нарушении нормального функционирования одной или нескольких из них.
