Введение к работе
Актуальность проблемы. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК), или мезенхимальные стромальные клетки-предшественники являются стволовыми клетками взрослого организма, которые локализуются в костном мозге, жировой ткани, а также в ряде других тканей и органов. Эти клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом, являются самообновляющейся популяцией клеток, поддерживающих свое недифференцированное состояние, а также способны к дифференцировке в определенные типы клеток под действием дифференцировочных стимулов [Fridenstein A.J. et al., 1976; Caplan A.I., 1994; Prockop D.J., 1997, 2003; Bruder S.P. et al., 1997; Pittenger M.F. et al., 1999; Bianco P. et al., 2001; Barry F.P. et al., 2004; Fibbe W.E., 2002; Grove J.E. et al., 2004; Wagner W. et al, 2005]. В свою очередь, мультипотентяость МСК определяет выполняемую ими уникальную функцию формирования, поддержания и репарации тканей, а также лежит в основе современных технологий тканевой инженерии. В связи с этим, со времен открытия этих клеток А.Я. Фриденштейном интерес к ним непрерывно растет, однако все большее число работ ставит новые вопросы в отношении функционирования МСК in vivo и in vitro.
Одним из таких вопросов является функциональное состояние клеток-предшественников в условиях пониженного содержания кислорода. Парциальное давление кислорода во внеклеточной среде, обуславливающее концентрацию внутриклеточного кислорода, является одним из существенных факторов, определяющих жизнедеятельность любой клетки, в том числе, стволовой. Поддержание этого параметра в узких пределах является важнейшим компонентом гомеостаза и необходимо для предупреждения в клетке повреждений различного характера. Наиболее частым нарушением постоянства газового состава среды является снижение парциального давления кислорода во внеклеточной среде, или гипоксия. МСК могут оказываться в условиях пониженного содержания кислорода, обусловленного экзогенными факторами, рядом патофизиологических механизмов, а также ограниченным кровоснабжением имплантированных систем доставки клеток-предшественников (носителей) в место повреждения при применении современных репаративных технологий. Пониженное содержание кислорода может оказывать модифицирующее влияние на характеристики мезенхимальных стромальных клеток-предшественников, отражающие их морфофункциональное состояние, такие как их жизнеспособность, способность к пролиферации, дифференцировочный потенциал, а также морфологические и иммунофенотипические показатели, что, в свою очередь, может влиять на протекание репаративпых процессов в ткани. В противовес долгой истории изучения гипоксии на
организменном уровне, гипоксическое воздействие на культивируемые клетки исследовано значительно меньше. В частности, работы, посвященные воздействию пониженного содержания кислорода на культивируемые МСК, немногочисленны, затрагивают какие-либо отдельные характеристики клеток-предшественников, а их результаты зачастую противоречивы [Lennon D.P. et al, 2001; Salim A. et al., 2004; Ren H. et al., 2006; Pacary E. et al., 2006; Malladi P. et al., 2006; Lin Q. et al., 2006]. Таким образом, дальнейшее комплексное исследование функционального состояния мезенхимальных стромальных клеток-предшественников в условиях пониженного содержания кислорода является актуальной задачей клеточной биологии.
Цель исследования: изучение влияния пониженного содержания кислорода на морфо-функциональное состояние мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс на разных этапах культивирования.
Задачи исследования:
Отработка метода получения и культивирования мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в условиях пониженного содержания кислорода.
Морфологическая, иммунофенотипическая и функциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс на различных этапах культивирования.
Исследование влияния пониженного содержания кислорода в среде культивирования (5% СЬ) на морфологию, пролиферативную активность, жизнеспособность, иммунофенотип и остеогенный и адипогенный дифференцировочный потенциал мезенхимальных стромальных клеток предшественников костного мозга крыс на начальных этапах культивирования.
Изучение влияния пониженного содержания кислорода в среде культивирования (5% Ог) на морфологию, пролиферативную активность, жизнеспособность, иммунофенотип длительно культивируемых мезенхимальных стромальных клеток предшественников костного мозга крыс.
Оценка влияния пониженного содержания кислорода в среде культивирования (0% О2) на морфологию, пролиферативную активность, жизнеспособность, иммунофенотип и остеогенный и адипогенный дифференцировочный потенциал мезенхимальных стромальных клеток предшественников костного мозга крыс на начальных этапах культивирования.
Научная новизна. Проанализировано влияние пониженного содержания кислорода (5% () на комплекс характеристик МСК костного мозга крыс, которые в своей совокупности отражают морфофункциональное состояние клеток-предшественников. Показано, что на начальных этапах культивирования (1-4 пассажи) МСК костного мозга крыс гипоксия снижает степень их морфологической гетерогенности, стимулирует пролиферацию, оказывает цитопротекторный эффект, а также модулирует ранние этапы их остеогенной, но не адипогенной дифференцировки при сохранении характерного для МСК иммунофенотипа.
Впервые при длительном культивировании (более 20 пассажей) мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс выявлена субселекция морфологически гомогенных линий клеток со стабильным иммунофенотипом, пролиферативной активностью и различным остеогенным дифференцировочным потенциалом, и оценено влияние гипоксии (5% Ог) на полученные культуры МСК. Показано, что эффекты гипоксии на морфологию, пролиферацию и жизнеспособность длительно культивируемых клеток-предшественников варьируют, однако в любом случае гипоксия не приводит к стимуляции их пролиферативной активности и изменению характерного для МСК иммунофенотипа.
Впервые при исследовании влияния аноксии на комплекс характеристик мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс выявлены временные пределы их устойчивости к аноксическому воздействию, а также механизмы повреждения клеток в условиях аноксии. Показано, что в условиях 96-часовой аноксии в культурах МСК костного мозга крыс сохраняется морфология и иммунофенотип клеток, их способность к пролиферации, а также возможность начальных этапов остеогенной и адипогенной дифференцировки. При этом в культурах не происходит значительного увеличения количества поврежденных клеток, а имеющее место повреждение обусловлено апоптозом, в то время как при более длительном аноксическом воздействии основным повреждающим механизмом становится некроз.
Научно-практическая значимость работы. Показано стимулирующее влияние гипоксии на пролиферацию и жизнеспособность мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс, что может быть использовано для наращивания массы клеток-предшественников, сохраняющих свои морфофункциональные свойства при использовании технологий тканевой инженерии. Подана и зарегистрирована заявка на патент № 2007119977 от 30.05.2007.
Полученные данные о сохранении ряда морфофункциональных характеристик мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в условиях
96-часовой аноксии расширяют представления об устойчивости клеток-предшественников, в частности, к значительному снижению концентрации кислорода в среде.
Основные положения, выносимые на защиту: 96-часовое воздействие гипоксии (5% 02) оказывает стимулирующее влияние на мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс на начальных этапах культивирования (1-4 пассажи), что выражается в снижении степени гетерогенности культур МСК, стимуляции их пролиферации, цитопротективном действии, сохранении характерного для МСК фенотипа, а также торможении начальных этапов дифференцировки в остеогенном направлении, что может рассматриваться как сохранение их менее коммитированного состояния
Мезенхимальные стромальные клетки-предшественники из костного мозга крыс представляют собой клеточную популяцию, чрезвычайно устойчивую к значительному понижению содержания кислорода в среде, что подтверждается сохранением их морфологии, фенотипа, жизнеспособности, способности к пролиферации, а также возможностью дифференцировки, хотя и менее эффективной, в условиях аноксии, поддерживаемой в течение нескольких суток.
Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на IV, V и VI конференциях молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2005, 2006, 2007); 4-й Всероссийской конференции с международным участием "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 2005); VI Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток" (Звенигород, 2005); 2-й Международной конференции "Стратегии в тканевой инженерии " (Вюрцбург, Германия, 2006); 8-м Международном конгрессе Международного общества по адаптивной медицине (Москва, 2006); Всероссийском симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 2006).
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 работы в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН "Космическая физиология и биология" 21.06.2007 г. Работа выполнена при поддержке программы ОБН РАН "Физиологические механизмы регуляции внутренней среды и организации поведения живых систем" и контракта в рамках программы ФЦНТП (2002 - 2006 гг.).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, заключения, списка литературы. Текст диссертации изложен на 161
странице машинописного текста, сопровождается 27 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 224 источника, из них 40 на русском и 184 на иностранном языке.
