Введение к работе
Актуальность. В настоящее время достигнут значительный прогресс в исследовании механизмов, определяющих такие свойства мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) как высокий пролиферативный потенциал и способность к мультилинейной дифференцировке. Изучение этих аспектов физиологии ММСК имеет первостепенное значение как для понимания фундаментальных механизмов фунционирования этих клеток in vivo, так и в связи с перспективой их использования в области регенеративной медицины.
Исследования, направленные на выяснение того, как связанные с возрастом изменения на различных уровнях: организменном, тканевом, клеточном, влияют на реализацию основных свойств ММСК, являются единичными. Известно, что количество ММСК в костном мозге доноров и способность образовывать КОЕ-Ф линейно уменьшаются с возрастом (Caplan A.I. et al., 2009). При экспансии in vitro пролиферативная и колониеобразующая активность ММСК из костного мозга возрастных крыс уменьшается (Lepperdinger G, 2011), причем этот эффект характерен для ранних пассажей и не выявляется при длительном субкультивировании (Sethe S. et al., 2006; Schellenberg A. et al., 2011; Lepperdinger G., 2011). Остеогенный потенциал в таких клетках снижен, а адипогенный – повышен (Sethe S. et al., 2006). C другой стороны, группой Wagner W. (2009) не обнаружено отличий в пролиферативной и дифференцировочной активности между культивируемыми ММСК отдоноров в возрасте от 21 - 92 лет, а Григоряном А.С. и др. - у доноров от 18 до 70 лет (2009). Таким образом, попытки выявить возрастные особенности ММСК при их экспансии in vitro пока не позволили получить однозначные результаты, что может быть связано как с разнообразием используемых экспериментальных протоколов, так и с недооценкой роли физических факторов, таких как парциальное давление кислорода, для реализации свойств ММСК.
Во многих работах, в том числе и в нашей лаборатории (см. обзоры Буравкова Л.Б. и др., 2008; 2011), показано, что «физиологическая нормоксия» - близкое к тканевому содержание кислорода существенным образом меняет свойства ММСК. Использование in vitro низкого уровня О2, модулирующего «физиологическую нишу», может позволить получить принципиально новые данные относительно влияния возраста донора на свойства ММСК и их регенеративный потенциал. В частности, введение ММСК было успешно применено при дефектах хрящевой ткани, почечной недостаточности, повреждениях легких и других заболеваниях (Ponticiello M.S. et al., 2000; Rojas М. et al., 2005; Кухарчук А.Л. и др., 2004). При этом предварительное культированние клеток в гипоксической среде усиливало терапевтический эффект по сравнению с инфузией ММСК, культивируемых при 20% кислорода, что выражалось в увеличение ангиогенного потенциала клеток-предшественников (Im G.I. et al., 2001; Ефименко А.Ю. и др, 2010; Буравкова Л.Б.и др., 2012).
Исходя из вышеизложенного, целью данной работы являлось исследование влияния возраста крыс на морфофункциональные характеристики ММСК из костного мозга, культивируемых при различном содержании кислорода (5 и 20%), а также влияние на процесс репарации при введении этих клеток в зону экспериментального перелома трубчатой кости
Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Провести анализ репликативных особенностей культивируемых ММСК из костного мозга крыс разного возраста при 5% и 20% О2.
-
Изучить изменения доли «стареющих» клеток в популяции ММСК костного мозга крыс в зависимости от возраста животного и концентрации кислорода.
-
Проанализировать иммунофенотип культивируемых ММСК костного мозга (кмММСК) разновозрастных крыс при 20% и при 5% кислорода в газовой среде.
-
Оценить изменения остео- и адипогенного потенциала при культивировании кмММСК разновозрастных крыс в стандартных условиях и при 5% кислорода в среде.
-
Исследовать влияние введения аллогенных кмММСК молодых и старых животных на репарацию трубчатой кости после предварительной экспансии клеток в газовой среде, содержащей 20% или 5% кислорода.
Научная новизна работы
Впервые при исследовании влияния содержания кислорода и возраста животного на морфофункциональные характеристики кмММСК в первичной культуре, показано снижение пролиферативной активности по сравнению со стандартными методами культивирования, независимо от возраста животного.
Впервые установлено, что постоянное культивирование кмММСК животных старше 6 месяцев в среде, содержащей 5% кислорода, увеличивало пролиферативную активность и число КОЕ-Ф, снижало адипогенный потенциал при одновременном увеличении остеогенного потенциала и снижении доли X-gal-положительных («стареющих») клеток в популяции.
Показано увеличение коэффициента утолщения костной мозоли и содержания в ней ретикулофиброзной костной ткани после введения кмММСК, культивируемых при 5% кислорода, а также увеличение доли хрящевой ткани после введения ММСК из костного мозга молодой крысы.
Основные положения, выносимые на защиту
В условиях стандартного культивирования кмММСК в среде, содержащей 20% кислорода, с увеличением возраста крыс снижается пролиферативная активность, количества КОЕ-Ф и ранняя стадия индуцированной остеогенной дифференцировки при увеличении доли X-gal-положительных клеток в популяции и интенсивности адипогенеза.
При постоянном культивировании в среде, содержащей 5% кислорода увеличивается пролиферативная активность и число КОЕ-Ф, снижается доля X-gal-положительных клеток, подавляется индуцированный адипогенез при активации ранних этапов остеогенеза кмММСК старых животных
Введение в зону перелома трубчатой кости крыс кмММСК способствовало увеличению коэффициента утолщения костной мозоли и доли хрящевой ткани. Кроме этого увеличивалась доля новообразованной костной ткани при введении ММСК, культивируемых при 5% кислорода, по сравнению с введением клеток, культивируемых при 20% кислорода.
Научно-практическая значимость работы
Проведенные исследования продемонстрировали возможность получения в короткие сроки большего числа кмММСК, благодаря постоянному культивированию при 5% кислорода, независимо от возраста донора.
Разработан способ стимуляции процесса репарации трубчатой кости у млекопитающих, включающий введение в область перелома ММСК предкультивированных в газовой среде, содержащей 5% О2, 5% СО2, 90% N2. (Патент № 2404242, от 20 ноября 2010 г.).
Разработан способ изменения функциональных характеристик клеток-предшественников, выделенных из костного мозга возрастных крыс, включающий постоянное культивирование при пониженном содержании кислорода, который позволяет получить к третьему пассажу клеточную популяцию, обладающую свойствами популяции клеток молодых животных (Заявка о выдаче патента, дата поступления 08.06.2012, регистрационный № 2012123714).
Апробация работы
Результаты работы обсуждены на VI, IIX, IX Конференциях молодых учёных, специалистов и студентов, посвящённой дню космонавтики (Москва, 2007, 2009, 2010), на IV Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Москва, 2009), на Всероссийской научной школе-конференции для молодёжи "Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования" (Москва, 2009), на XXI Съезде физиологического общества им. Н.П. Павлова (Калуга, 2010), на IX Всероссийской научной школе-конференции: «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2011), на VI Российской конференции с международным участием: «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция», на II Всероссийской научной конференции молодых ученых “Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия” (Санкт-Петербург, 2012).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 7 тезисов и 1 глава в сборнике.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на _121_ страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 таблицами и 45 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, который включает 144 источника, в том числе 69 отечественных работ и 75 зарубежных.
