Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ ПЕРВАЯ Обзор литературы
1.1 Особенности действия природных антиоксидантов 12
1.2 Химическое строение и биологическое действие тирозола 18
1.3 Химическое строение аналогов и гомологов тирозола 19
1.4 Химическое строение серусодержаших антиоксидантов 20
1.5 Современные представления о механизме свободнорадикального окисления 21
1.6 Взаимосвязь между структурой и антиоксидантным действием фенолов 24
1.7 Современные представления о механизмах синергизма и антагонизма в совместном действии антиоксидантов 31
ЧАСТЬ ВТОРАЯ Собственные исследования
2.1 Материалы и методы исследований
2.1.1 Хемилюминесцентный метод определения ингибирующей активности фенольных антиоксидантов 35
2.1.2 Манометрический метод 3 7
2.1.3 Иодометрический метод 3 8
2.1.4 Метод ИК-спектроскопии 39
2.1.5 Метод стационарного фотолиза 40
2.1.6 Реактивы и их очистка 42
2.2 Исследование ингибирующих свойств новых серусодержащих пространственно затрудненных фенолов
2.2.1 Характеристика модельных систем окисления, используемых для изучения ингибирующих свойств фенолов различного строения 44
2.2.2 Доказательство химической природы ингибирования окисления новыми синтетическими соединениями фенольной природы 45
2.2.3 Ингибирующая и антирадикальная активность серусодержащих антиоксидантов 48
2.2.4 Изучение антиоксидантной активности серусодержащих антиоксидантов 54
2.2.5 Изучение возможности разрушения гидропероксидов в присутствии серусодержащих антиоксидантов 62
2.3 Исследование антиоксидантной активности тирозола, его гомологов и аналогов различной степени экранированности
2.3.1 Изучение взаимосвязи между антирадикальной активностью фенолов, степенью их экранированности и строением заместителей в орто- и пара-положении 65
2.3.2 Антиоксидантная активность фенольных ингибиторов различного химического строения 70
2.4 Изучение активности феноксильных радикалов фенольных антиоксидантов различного строения
2.4.1 Кинетика расходования антиоксидантов в условиях стационарного фотолиза. Роль степени экранированности ОН-группы фенола 78
2.4.2 Изучение кинетики расходования антиоксидантов в присутствии субстратов разной степени ненасыщенности 85
2.4.3 Анализ взаимосвязи ингибирующего действия и активности радикалов антиоксидантов различного химического строения 93
2.5 Кинетика сочетанного ингибирующего действия а- токоферола с синтетическими пространственно затрудненными фенолами
2.5.1 Кинетические эффекты сочетанного действия а-токоферола с дибунолом и новыми синтетическими серусодержащими антиоксидантами СО-3 и СО-4. 96
Обсуждение результатов 105
Выводы 122
Список литературы 124
- Современные представления о механизме свободнорадикального окисления
- Доказательство химической природы ингибирования окисления новыми синтетическими соединениями фенольной природы
- Изучение взаимосвязи между антирадикальной активностью фенолов, степенью их экранированности и строением заместителей в орто- и пара-положении
- Анализ взаимосвязи ингибирующего действия и активности радикалов антиоксидантов различного химического строения
Современные представления о механизме свободнорадикального окисления
В настоящее время установлено иммуномоделирующее действие а-ТФ. Показано, что витамин Е стимулирует иммунный и гуморальный клеточный ответ как на тимусзависимые, так и на тимуснезависимые антигены, тормозит продукцию супрессоров, усиливает активность клеток-киллеров /80/. Имеются данные о противоопухолевой активности а-ТФ, которая может быть связана с его иммуномоделирующим действием /167/.
Описан феномен онкотропии а-ТФ /75, 131/, когда опухолевая клетка усиленно поглощает витамин Е. Полагают, что кумулирование а-ТФ опухолевой клеткой обеспечивает ее высокую устойчивость, а также способствует пролиферации. Известно, что а-ТФ способен модулировать каскад арахидоновой кислоты, контролируя при этом активность липооксигеназы на пути образования липоксинов и лейкотриенов /119/.
Показано, что витамин Е ингибирует окисление липопротеидов низкой плотности и проявляет высокую эффективность в профилактике и терапии атеросклероза/158, 175,176, 195,196/.
В липидах биологических мембран наряду с а-ТФ присутствует р-каротин (провитамин А). Недостаток витамина А в организме приводит к нарушению роста и развитию так называемой ксерофтальмии /52, 67/ В настоящее время существуют данные о действии Р-каротина как АО /56, 59, 60, 94, 173, 174, 182, 201, 204/ Известно, что в концентрациях свыше 1 моль % в мембране Р-каротин обладает выраженными АО свойствами /174/. Провитамин А содержит в боковой цепи систему сопряженных двойных связей и относится к полиенам. Известно, что такие соединения, являются акцепторами радикалов разных типов. Взаимодействие со свободными радикалами протекает преимущественно по механизму присоединения по месту двойной связи. Активность каротиноидов в реакции с пероксильными радикалами (к7 = 104 М" хс" ) /56/ сравнима с действием синтетических фенольных АО, но уступает а-ТФ (к7 = 3,3 х 106 М"1 х с"1) практически в 100 раз. Показана способность каротина взаимодействовать с синглентным кислородом /221/. Установлено, что при высоких концентрациях действие р-каротина существенно уменьшается вплоть до инверсии /66, 94, 95, 96, 177/.
Помимо ингибирующего действия отмечена способность р-каротина влиять на генетический аппарат клетки /168, 211/. Курсовой прием небольших доз каротина стимулирует гуморальный и клеточный иммунитет /83/. Высокие дозы каротиноидов, напротив, вызывают развитие обратимого состояния иммунодепрессии /93, 134, 186/. Показано, что употребление курильщиками больших количеств Р-каротина в течение длительного времени приводит к стимуляции развития опухоли и увеличению смертности от рака легкого /134, 136,202,207,229/.
К биоАО также относят витамины группы К, представляющие собой нафтохиноны с боковыми цепями изопреноидного строения различной длины. Недостаточность витамина К на уровне организма проявляется прежде всего в нарушении процесса свертывания крови из-за утраты способности синтезировать белок протромбин. При этом установлено, что, биохимические признаки К-витаминной недостаточности устраняются введением в организм о ТФ /105/. Биологическое действие витамина К не исчерпывается его участием в качестве кофактора в системе свертывания крови. Витамин К оказывает влияние на ряд мембранных ферментов. Показано, что дефицит витамина К оказывает существенное модифицирующее влияние на активность спектринзависимой АТФ-азы эритроцитов, активность растворимой менадионредуктазы печени, снижается сродство Na-, К-АТФ-азы эритроцитов к специфическому ингибитору уабаину, уменьшается уровень цитохрома Р-450 микросом печени /105/.
Восстановленные формы витамина К проявляют in vitro достаточно высокую антирадикальную активность (к7=5,8х106 М" хс !), сравнимую по величине с АРА а-ТФ /110/.
К веществам хиноидной структуры, входящим в систему природных антиоксидантов, относится убихинон (коэнзим Q). Впервые убихинон был открыт Мортоном. Позднее Крейн и Грин показали, что убихинон функционирует как переносчик электронов в цепи дыхательных ферментов. Боковая цепь убихинона в тканях человека и других млекопитающих состоит из 10 пятиуглеродных изопреновых единиц (коэнзим Qto). В работах /73, 74, 100, ПО/ приведены данные об антирадикальной активности (АРА) убихинонов. Показано что, значительной активностью в отношении пероксильных радикалов обладают только восстановленные формы биоАО. Величина к-j коэнзима Qj0 составляет 3,3х105 IVr xc"1, что на порядок ниже константы для а-ТФ. Необходимо отметить, что наличие, длина и степень ненасыщенности боковой цепи не оказывает существенного влияния на АРА убихинонов /73, 110/.
Биологическое действие коэнзима Q, как и ТФ, кроме АО активности проявляется при выполнении ряда присущих ему специфических функций. Коэнзим Q обладает выраженными антигипоксическими свойствами и способностью восстанавливать функционирование дыхательной цепи /69,156, 198/. Антимутагенная активность убихинона проявляется в широком диапазоне концентраций, инверсии действия при применении его высоких концентраций не происходит /27/. Методом ЯМР показана возможность взаимодействия полярных фрагментов Q)0 и фосфолипидов, что приводит к снижению температуры фазового перехода мембраны /133/. Существуют данные о том, что окисленные формы убихинона независимо от длины боковой цепи уменьшают жесткость мембран /159, 160/. Различные формы УХ способны связываться с активными центрами ферментов и влиять на их активность /168/. Убихинон и его производные, участвуя в процессах образования пероксида водорода, могут воздействовать на уровень активности АТФ-азной системы митохондрий /141/. Показана антицитолитическая актиность убихинона /23/.
Таким образом, приведенные данные показывают, что в организме эффективно функционируют ряд природных веществ, обладающих антиоксидантными свойствами.
Доказательство химической природы ингибирования окисления новыми синтетическими соединениями фенольной природы
Известно, что в последние годы интерес к серусодержащим аналогам фенолов достаточно велик и связан с перспективами применения их в качестве мембранопротекторов и АО. Наиболее известен пробукол, применяющийся в практике антиоксидантотерапии, а также в качестве гиполипидемического средства /70, 102-104, 195/. В настоящее время исследуются ряд новых производных пробукола /81/.
Целью настоящей работы явилось изучение антирадикальной активности и механизма ингибирующего действия ряда новых серусодержащих стерически затрудненных аналогов пробукола, синтезированных в НИОХ СО РАН.
Изучение активности изучаемых АО проводили в сравнении с известными природными (а-ТФ) и синтетическими (дибунол и пробукол) ингибиторами окисления.
При анализе особенностей структуры изучаемых соединений (рис. 1) можно видеть, что все вещества относятся к экранированным фенолам и отличаются природой заместителя в пара-положении к гидроксильной группе. Соединение I аналогично по своему строению дибунолу, но в пара-положении вместо метильной группы содержит группу -SH, непосредственно связанную с бензольным кольцом. Структура II также включает меркапто-группу, отделенную от фенольного ядра пропильным радикалом. Таким образом, соединение I является тиофенолом, а соединение II - тиоспиртом. Вещества под условными названиями СО-3 и СО-4 относятся к сульфидам и представляют собой удвоенную структуру соединения И. В пробуколе (V) фрагменты молекулы сходны по строению с I и разделены между собой 2,2-изопропенильным радикалом.
В группе указанных веществ хемилюминесцентным методом изучена антирадикальная активность. Эффективность метода хемилюминесценции (ХЛ) отмечается многими авторами /14, 50, 108, 126/. Данный метод основан на изменении кинетики свечения, возникающего при инициированном окислении углеводородов в присутствии АО. Основной кинетической характеристикой тормозящего действия ингибиторов является константа скорости взаимодействия ингибитора окисления с пероксильными радикалами (к7).
В данном разделе представлены результаты изучения антирадикальной активности синтетических серусодержащих фенолов, аналогов пробукола, а так же проведен сравнительный анализ kj исследуемых соединений с известными природными (а-ТФ) и синтетическими (дибунол) ингибиторами окисления.
На рис. 3 приведены типичные кинетические кривые хемилюминесценции кумола в присутствии исследуемых АО. Видно, что ХЛ-кривые состоят из двух участков, резко различающихся по скорости нарастания свечения. Первый участок является S-образной зависимостью с периодом индукции, пропорциональным количеству введенного АО. На втором участке относительная интенсивность свечения монотонно повышается до исходного уровня IQ. Установлено, что зависимость изменения интенсивности ХЛ не подчинялась уравнению Штерна-Фольмера, что свидетельствовало о химической природе тушения.
Показано, что все изучаемые вещества проявляют антирадикальную активность (табл. 1). Сопоставление величины константы к7 для СО-3, СО-4 и пара-меркаптофенола показывает, что несмотря на различия в структуре величина к7 фенолов и бисфенолов сравнима между собой и оценивается значениями равными 1,3x104 М хс"1, 1,3x104 NT xc"1 и 1,2x104 М хс"1 в упомянутом выше ряду соответственно. При этом размер констант мало отличается от значения к7 дибунола, равного 1,4x104 IVr xc"1. Таким образом, для фенолов с разными заместителями в пара-положении к ОН-группе (метильной, меркапто-, сульфидной и дисульфидной) значения антирадикальной активности практически совпадают. К этой же группе примыкает соединение (И), представляющего собой "половинку" бисфенолов СО-3, СО-4. Соединение II является одновременно фенолом и тиоспиртом, у которого, в отличие от СО-3 и СО-4, -SH-группа свободна. Оказалось, что для него значение к7 незначительно выше, чем для упомянутых выше фенолов (табл. 1). Создается впечатление, что на величину к7 не влияет природа заместителя в пара-положении к -ОН-группе. Однако, сопоставление значений к7 для упомянутых выше фенолов и соединения III, не имеющего заместителей в пара-положении, свидетельствует об обратном. Для незамещенного фенола наблюдается снижение величины к7 более чем в 2 раза (табл.1). Из анализа представленных на рис. 1 химических структур АО видно, что по своей природе заместители, находящиеся в пара-положении, являются электронодонорами (заместителями 1 рода), которые, как известно, увеличивают величину антирадикальной активности (к7) ингибиторов /17, 88/. Полученные нами данные подтверждают это положение.
Для пробукола, представляющего собой бисфенол с пара-заместителем, отличного от СО-3, СО-4 строения, значение константы ниже в 2,6 раза по сравнению с ними (табл. 1), что также можно объяснить влиянием заместителя. Считали целесообразным сравнить антирадикальную активность серусодержащих фенолов и природного АО - а-токоферола (а-ТФ). Сопоставление значений ку показывает, что АРА а-ТФ выше практически в 270 раз (табл. 1). Таким образом, а-ТФ в сравнении с изучаемыми пространственно затрудненными серусодержащими фенолами наиболее эффективно взаимодействует с пероксильными радикалами.
Изучение взаимосвязи между антирадикальной активностью фенолов, степенью их экранированности и строением заместителей в орто- и пара-положении
Исследуемые соединения были объединены в группы, отличающиеся между собой природой заместителей в орто- и пара-положениях или их количеством.
Была изучена АРА неэкранированного АО - тирозола (соединение VII) и его аналогов различной степени экранированности: 2-трет.бутил-4-(2/-гидроксиэтил)фенола (XI) и 2,6-дитрет.бутил-4-(2/-гидроксиэтил)фенола (XII), определены значения констант скорости взаимодействия с пероксильными радикалами гомологов тирозола - гидроксибензола и -4-(3;-гидроксипропил)фенола (VIII) (см. формулы фенолов указанного ряда рис. 1).
При анализе структуры тирозола и его аналогов можно видеть, что данные соединения имеют одинаковый заместитель в пара-положении и отличаются между собой степенью экранированности -ОН-группы. При исследования кинетики изменения интенсивности ХЛ было показано, что все изучаемые фенолы оказывают ингибирующее действие на процесс окисления модельного субстрата. Установлено, что в ряду фенолов возрастающей степени экранированности (см. формулы) значения констант kj близки между собой и составляют (0,93-0,97)х104 ІУҐхс"1 (табл. 4). Таким образом, можно заключить, что количество третично-бутильных заместителей в орто- положении практически не влияет на антирадикальную активность АО. Следует отметить, что для орто-гидроксиаурола в литературе приводится значение константы (к7 =1,05x104 М хс"1), сравнимое с тирозолом /181/. По всей вероятности, не только алкильный, но и гидроксильный заместитель, находящийся в орто-положении, не оказывает заметного влияния на величину к7.
Этот тезис может быть проиллюстрирован на примере сопоставления значения к7 неэкранированных и пространственно замещенных фенолов: гидроксибензола, 2,6-дитрет.бутилфенола, п.-крезола и 2,6-дитрет.бутилкрезола (см. формулы фенолов рис 1.).
Можно видеть, что для пространственно затрудненных фенолов по сравнению с их неэкранированными аналогами сохраняется тот же порядок константы к7. Введение двух третично-бутильных заместителей приводит к увеличению абсолютного значения константы лишь в 1,8 -1,7 раза (фенол и 2,6-дитрет.бутилфенол, п.крезол и 2,6-дитретбутилкрезол).
Анализ показывает, что наиболее значимое влияние на размер константы оказывает введение метальной группы в пара-положение. Так, при сравнении попарно: (фенола и п. крезола), (2,2-дитрет.бутилфенола и 2,6-дитрет.бутил.п.метилфенола -дибунола) видно, что метильная группа в пара-положении способствует увеличению значения к7 в 3,2 раза (табл. 4). Таким образом, наиболее тесная взаимосвязь существует между значением к7 и природой заместителя в пара-положении.
В связи с вышеизложенным представляло интерес проследить характер изменения величины к7 в ряду гомологов тирозола, отличающихся строением заместителей в пара положении. Был проведен сравнительный анализ в ряду неэкранированных фенолов, имеющих в пара-положении заместители, отличающиеся как строением, так и длиной цепи (количеством метиленовых групп) (см. формулы соединений указанного ряда рис 1.). Показано, что незамещенный гидроксибензол имеет наиболее низкое значение к7 (0,24х104 МГ хс"1) (табл. 4). С введением в пара-положение гидрокси- и метоксигруппы (электронодоноры) величина константы существенно возрастает (в 21 и 54 раза соответственно). Соединение 2,6-дифениланизол было отнесено к ряду неэкранированных фенолов в связи с особенностями пространственной организации фенильных заместителей. Исследуемый нами 2,6-дифениланизол, имеет плоскую структуру. В отличие от него, третично-бутильные заместители, как известно, располагаются перпендикулярно плоскости фенольного ядра, создавая тем самым, дополнительные стерические препятствия для взаимодействия ОН-группы с пероксильными радикалами. Таким образом, повышение реакционной способности 2,6-дифениланизола по сравнению с дибунолом можно объяснить на основе представлений о его пространственной организации (табл. 4).
На примере сопоставления АРА фенола и тирозола видно, что с введением в пара-положение заместителя (Р-этанола) величина к7 возрастает в 4,2 раза, что, как можно заметить, несколько выше, чем при введении метильной группы (3,2 раза). У гомолога тирозола (производное у-пропанола) при дальнейшем удлинении цепи величина к7 остается практически на том же уровне (табл. 4). Таким образом, удлинение цепи заместителя в пара-положении не влияет на значение константы к7.
Полученные в настоящей работе результаты подтверждают данные литературы о существовании взаимосвязи между к7 АО и строением заместителя в пара-положении /17, 36, 88, 127/. Электронодоноры способствуют увеличению антирадикальной активности АО. Так, гидрохинон к7 (1,5x105 М" с"1) в реакции с пероксильными радикалами в 60 раз более активен, чем фенол /127/. Сопоставление АРА гидрохинона и исследуемых нами феноло-спиртов, у которых вторая -ОН-группа находится на разном удалении от бензольного кольца, показывает, что по мере снижения возможности я-р-сопряжения значение константы снижается (табл. 4). Сравнение к7 производных тирозола и а-ТФ показывает, что последний значительно более активен в реакции с пероксильными радикалами (практически в 360 раз).
Анализ взаимосвязи ингибирующего действия и активности радикалов антиоксидантов различного химического строения
В целях стабилизации окисления пищевых и косметических масел, основ фармпрепаратов все более широко используют синергические композиции, которые могут состоять из нескольких ингибиторов окисления, взаимно усиливающих действие друг друга, а также включать АО и вещество -синергист. Последний, как правило, не проявляет самостоятельного ингибирующего действия, однако в его присутствии эффективность ингибитора значительно возрастает. Использование эффектов синергизма позволяет получать высокоэффективные композиции и при этом существенно снижать абсолютные количества АО, уменьшая тем самым негативные последствия длительного применения высоких доз фенолов.
В литературе описано проявление эффектов синергизма в действии смесей а-ТФ с фосфолипидами /15, 16, 94, 95, 170, 171/, аскорбиновой /140, 169, 210, 226/ и другими органическими кислотами /127/, Р-каротином /223/, алифатическими аминами /68/, дибунолом /78/, флавоноидами /222/.
Возможность синергизма в действии АО до настоящего времени выявлялась эмпирическим путем. Несмотря на имеющиеся классификации синергизма отсутствуют надежные критерии, позволяющие на основании представлений о химическом строении составляющих прогнозировать возможность аддитивности, синергизма или антагонизма в их совместном действии. Необходимость разработки и экспериментального обоснования гипотез, связывающих эффективность и химическое строение синергических композиций не вызывает сомнения и может послужить теоретическим инструментом прогнозирования действия бинарных смесей и разработки новых способов стабилизации легкоокисляемых соединений. В настоящей работе предпринято изучение взаимосвязи между химическим строением и эффективностью совместного действия смеси синтетических пространственно затрудненных фенолов различного строения.
В настоящем разделе исследованы закономерности сочетанного действия а-ТФ с ингибиторами разного химического строения, общностью структуры которых является наличие двух трет.бутильных заместителей в положениях, соседних с фенольным гидроксилом. Изучали ингибирующее действие смесей а-ТФ с известным АО - дибунолом и новыми серусодержащими пространственно затрудненными бисфенолами, условно обозначаемыми СО-3 и СО-4 (формулы соединений приведены на рис. 1).
В исследуемых композициях менялись абсолютные концентрации и соотношения компонентов. При этом количественно оценивали действие индивидуальных АО и их бинарных смесей. Для установления характера сочетанного действия двух ингибиторов сопоставляли между собой простую сумму периодов индукции отдельных компонентов (аддитивное действие) (Ех,) и брутто эффективность их смеси ("СНЕСЛИ в результате сочетания ингибиторов получали выигрыш в периодах индукции (Дх) по сравнению с аддитивным действием АО, т.е. (ті їх,), то в совместном действии ингибиторов констатировался эффект синергизма. В случае если совместное действие двух АО было меньше, чем сумма эффектов ингибирования индивидуальных веществ (Ех, ХЕ), то можно было судить о проявлении антагонизма в действии АО. Эффект синергизма оценивали в абсолютных единицах по разности Дх=Х-Ідь либо в относительных - Дх/Ххіх 100,%.
В главе 1 при изучении антирадикальной активности новых серусодержащих АО было показано, что СО-3 и СО-4 значительно уступают по величине к7 а-ТФ (более чем в 250 раз), их активность сравнима с дибунолом. Таким образом, в смеси указанных АО с а-ТФ последний является наиболее активным ингибитором (табл. 1).
Было установлено, что СО-3 и СО-4 в отличие от дибунола способны разрушать гидропероксиды, при этом СО-4 (дисульфид) более эффективен, чем СО-3, являющийся сульфидом (рис. 8).
Действие смеси а-ТФ с указанными АО сопоставлялось с их прогнозируемым аддитивным эффектом, проявляющимся при использовании ингибиторов порознь (рис. 26). Сравнительное исследование эффективности смесей а-ТФ с указанными пространственно затрудненными фенолами в широком диапазоне их концентрации показало, что кривые носят экстремальный характер, тогда как для индивидуальных АО те же зависимости были прямо пропорциональными (рис. 26). На рис. 26 легко установить области, в которых в действии бинарной смеси АО проявляется синергизм или антагонизм. Данные рис. 26 были обработаны и представлены в координатах (AT/ETJ ), % - концентрация синтетического АО (рис. 27). Были получены сложные бимодальные кривые (рис. 27), при анализе которых видно, что действие смеси АО значительно более эффективно в области низких концентраций. С её увеличением действие смеси а-ТФ со всеми АО независимо от их строения приобретает антагонистический характер.
Обращает внимание, что для смесей а-ТФ с СО-3 и дибунолом совместное действие в области низких концентраций практически аддитивно (антагонизм не превышает 5%) (рис. 27, кривая 2,3). При этом указанная область для композиции а-ТФ с дибунолом существенно выше, чем с СО-3. Для смесей а-ТФ с СО-4 при низких концентрациях проявляется только синергизм (рис. 27). Антагонизм в действии а-ТФ со всеми изучаемыми АО констатируется в области высоких концентраций (рис. 27).
