Введение к работе
Актуальность темы. Основная функция свертывания крови - остановка кровотечения при нарушении целостности сосудистого русла, вызываемого как внешним повреждением, так и различными внутренними микротравмами, постоянно возникающими в организме. Система свертывания крови представляет собой сложную сеть биохимических реакций, однако большая ее часть является регуляторной, управляющей для главной реакции свертывания - образования фибрина и его полимеризации. Именно эта реакция превращает кровь в гель, закрывающий место повреждения и останавливающий кровопотерю. Смысл существования всей остальной системы свертывания в том, чтобы этот переход был осуществлен при строго определенных условиях и строго определенным образом: при наличии сильного активирующего сигнала, в месте повреждения, не распространяясь за его пределы, образуя плотный сгусток, быстро затыкая дыру. При этом не нужно забывать, что система свертывания функционирует в довольно сложных условиях: вязкая кровь течет по сосуду, в котором на стенке имеется область, активирующая свертывание. В зоне, граничащей с ней, происходят начальные реакции свертывания, активируются ферменты, которые с диффузией и переносом потоком проникают в соседние области. Появляется сгусток, практически непроницаемый для потока; сгусток изменяет форму течения жидкости. Как будет вести себя система свертывания в таких условиях? Какие факторы будут управлять образованием сгустка? Что будет решать - произойдет остановка кровотечения или нет? Данная работа - попытка ответить на эти вопросы, основанная на компьютерном моделировании, подкрепленном in vitro экспериментами. В силу большой сложности и многоступенчатости системы свертывания, эта работа ограничена исследованиями фазы начального появления сгустка.
На текущий момент имеется ряд работ, посвященных математическому моделированию свертывания крови в потоке. В них показано, что поток ухудшает образование сгустка: при сильном потоке свертывание может не начаться. Однако, использованные в части работ феноменологические и редуцированные модели свертывания не позволяют сделать заключений о том, какие механизмы в системе свертывания крови обеспечивают ее чувствительность к потоку. В других работах используются детальные, но не верифицированные модели свертывания, и не проводится исследования функций различных реакций системы свертывания крови.
В данной работе был применен новый подход в использовании математического моделирования для исследования сложных биохимических систем. За основу была взята детальная модель свертывания плазмы крови, разработанная в лаборатории физической биохимии системы крови ГНЦ РАМН. Данная модель описывала реакционно-диффузионную систему, в которой свертывание активировалось при контакте с поврежденной поверхностью сосуда. Эта модель давала количественное согласие с множеством in vitro экспериментов. Она была модифицирована, чтобы описывать образование сгустка в условиях потока. После этого исправленная модель использовалась как инструмент исследования системы свертывания.
Использование математической модели позволяло проводить такие численные эксперименты, которые в принципе невозможно провести in vitro, как, например, отключение переноса потоком отдельных факторов свертывания, или изменение скорости определенных реакций, в которых участвует фермент. Такой подход позволял выяснять роль отдельных реакций в формировании нужного ответа системы, находить механизмы, регулирующие проведение свертывания в различных условиях.
Цель работы: изучить механизмы, определяющие влияние потока плазмы крови на начальные этапы образования фибринового сгустка. Задачи исследования:
Основываясь на детальной реакционно-диффузионной модели свертывания крови, разработать двумерную модель свертывания, учитывающую поток, изменяемый образующимся сгустком.
Детально разобрать процесс формирования сгустка (полимеризации фибрина); построить его in vitro модель и провести ее экспериментальную верификацию; выяснить, в каких режимах может протекать полимеризация фибрина.
Используя данные о режимах полимеризации фибрина, исследовать первоначальное образование сгустка в условиях потока, выяснить механизмы, отвечающие за регуляцию данного процесса.
Предложить схему проведения in vitro экспериментов для верификации гипотезы о механизме, определяющем чувствительность плазменной системы свертывания крови к скорости потока плазмы крови.
Научная новизна. В первой части работы построена новая математическая модель полимеризации фибрина, в которой учтены двухступенчатая активация фибриногена; образование комплексов фибрина с фибриногеном и частично активированным фибрином; формирование протофибрилл и их латеральная
агрегация с образованием оптически плотных фибрилл. Для верификации модели была проведена серия in vitro экспериментов. С помощью модели предсказано существование порога в образовании сгустка, выраженного в том, что ненулевые количества активированного фибрина в присутствии фибриногена не образуют сгустка. Был предложен механизм, отвечающий за подобное поведение системы полимеризации фибрина: обратимое формирование комплексов фибриногена и полуактивированного фибрина с олигомерами фибрина задерживает рост последних и не позволяет им образовывать сгусток в течение времени расчета. Во второй части работы разработана оригинальная двумерная детальная модель свертывания в потоке, учитывающая, что образующийся сгусток является непроницаемым для потока и тем самым меняет его форму. С помощью этой модели было исследовано влияние потока на свертывание плазмы крови; было продемонстрировано, что поток может увеличивать время инициации свертывания, причем зависимость времени инициации свертывания от сдвиговой скорости потока имеет нелинейный характер, что подтверждается экспериментальными данными. Было выяснено, что ингибирующее действие потока связано с переносом активного фактора Ха и тромбина, и предложена гипотеза, что это может быть связано с ослаблением и полным выключением петли положительной обратной связи активации внешней теназы фактором Ха (вызванным уменьшением концентрации фактора Ха из-за его переноса потоком). Предложен ряд экспериментов по проверке этой гипотезы.
Научно-практическое значение. Полученные результаты, свидетельствующие о наличии порога при полимеризации фибрина, могут иметь значение для клинических и биохимических исследований, связанных со свертыванием крови, его патологиями и методами их лечения. Построенная модель полимеризации фибрина может стать частью большой модели свертывания, учитывающей не только плазменное свертывание, но и тромбоцитарное. Разработанная модель свертывания плазмы крови в потоке может быть использована для анализа механизмов действия препаратов, влияющих на свертывание, в условиях, приближенных к физиологическим. Открытый с ее помощью эффект влияния потока на протекание некоторых реакций свертывания может быть важен при разработке новых лекарственных средств, стратегий их использования.
Положения, выносимые на защиту:
Построена детальная in virto модель полимеризации фибрина, проведена ее экспериментальная верификация.
С помощью разработанной модели полимеризации фибрина предсказано пороговое поведение образования фибринового сгустка.
Разработана детальная двумерная модель свертывания плазмы крови в потоке, учитывающая влияние образующегося сгустка на форму течения.
Показано, что эффект ингибирования свертывания потоком вызывается вымыванием активного фактора Ха и связанным с этим ослаблением и полным выключением петли положительной обратной связи активации внешней теназы - комплекса, инициирующего свертывание.
Апробация работы состоялась 16 сентября 2009 г. на заседании проблемной комиссии № 6 "Биохимия, биофизика и реология крови" в Гематологическом Научном Центре РАМН.
Материалы диссертации докладывались на первой международной конференции "Математическая Биология и Биоинформатика" (Пущино, октябрь 2006), на XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Geneva, Швейцария, июль 2007), на 11th International School-Conference of young scientists in Puschino (Пущино, октябрь 2007), на международной конференции Modeling of Blood Diseases (Lyon, Франция, ноябрь 2007), на 53rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research (Wein, Австрия, февраль 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 тезисов в сборниках трудов 9 конференций и 1 статья.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 — описания экспериментальных и теоретических результатов, и главы 4 — обсуждения результатов), выводов, двух приложений (состоящих из уравнений разработанных моделей) и библиографического указателя, включающего 116 источников. Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф. Атауллаханов Ф.И.).
