Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Структурные и функциональные особенности потенциалзависимых ионных каналов . 10
Калиевые каналы 15
Бактериальный канал kcsa 16
Натриевые каналы 18
Бактериородопсин 20
Функциональные особенности потенциалзависимых ионных каналов 24
Активация потенциалзависимых каналов 27
Глава 2 Квантово-химические методы 31
Базисные ряды орбиталей 43
Теория функционала плотности 48
Поверхность потенциальной энергии 58
Точность квантово-химических расчетов и временные затраты 62
Глава 3 Определение возможности переноса протона 65
Обсуждение результатов 16
Выводы 86
Глава 4 Модель активации потенциалзависимых ионных каналов 88
Математическое описание системы 105
Заключение 112
Выводы 117
Приложение 118
Список литературы 121
- Функциональные особенности потенциалзависимых ионных каналов
- Точность квантово-химических расчетов и временные затраты
- Определение возможности переноса протона
- Модель активации потенциалзависимых ионных каналов
Введение к работе
Каждая живая клетка окружена мембраной, которая играет активную роль в осуществлении процессов клеточного метаболизма и поддержании жизнедеятельности клетки. Среди различных функций биомембран транспортная может быть названа главнейшей: избирательный перенос малых молекул и ионов обеспечивает активный обмен клетки и ее органелл с окружающей средой и определяет эффективность процессов рецепции, образования биопотенциалов, передачи нервного возбуждения и т.п. Вот почему изучение функциональных структур мембран, обеспечивающих перенос зарядов, в частности - ионов, представляет большой интерес.
Ионные каналы представляют собой тетрамерные интегральные белки, находящиеся в липидном бислое и опосредующие транспорт ионов через мембрану. Вопросы функционирования ионных каналов составляют ключевую проблему в биофизике мембранных процессов, нейро физике и важнейшую прикладную задачу для новейших биотехнологий.
Наибольший интерес исследователей привлекают
потенциалзависимые ионные каналы, открываемые изменением электрического поля, которые играют основную роль при генерации и проведении нервного импульса за счет изменения мембранного потенциала нервного волокна. Для исследования механизма работы потенциалзависимых каналов в настоящее время используются самые современные физические, биологические и компьютерные методы, так как построение адекватной биофизической модели функционирования ионных каналов, -коррелирующей с их молекулярной структурой, позволит предсказать физические и биологические особенности их поведения в процессе работы.
Потенциалзависимые ионные каналы функционально представляют собой интегральный белок канальной структуры, встроенный в липидную биомембрану и образующий в ней пору. Также в структуре имеется механизм, обеспечивающий специфичность канала по отношению к различным ионам и управляющее устройство, которое открывает и закрывает ионный канал в зависимости от знака и величины потенциала - так называемый "воротный механизм". Потенциалзависимые каналы отличаются высокой избирательностью для ионов и активируют проводимость (открывание) ворот канала в ответ на электрический или химический импульс. И если проблема селективной проводимости ионов через мембрану была подробно исследована в последние годы, то вопрос о том, каким образом ионный канал активирует проводимость ионов и переходит из закрытого состояния в открытое до сих пор остается без ответа.
Основной трудностью на пути исследователей является то, что для
ответа на вопрос о механизме активации ворот чрезвычайно важно
знать пространственную молекулярную конфигурацию канала (его
четвертичную структуру), которая для эукариотических клеток до сих
пор не исследована в силу своей сложности. И хотя первичная
молекулярная структура, т.е. полная аминокислотная
последовательность, в настоящее время установлена для большого числа ионных каналов, знание первичной структуры канала мало способствует пониманию механизмов его функционирования. В последние годы, в связи с развитием компьютерной техники, исследователями было предпринято большое число попыток описать процесс открывания ионных каналов, но так как четверичная структура ионных каналов не известна, то адекватного биофизического объяснения этот процесс до сих пор не получил. В то же время экспериментально установлено, что процесс открывания потенциал зависимых ионных каналов определяется изменениями в протонной подсистеме канала и показано, что воротный ток определяется движением протонов в канале. Поэтому для понимания механизма, приводящего к открыванию потенциал зависимого ионного канала, очень важными являются исследования процесса протонного
транспорта в ионных каналах. Построение модели переноса протонов в поре потенциалзависиыого ионного канала и изучение структурных изменений канала в процессе протонного транспорта является главной задачей данной работы. На основе полученных данных предложена новая модель, описывающая механизм открывания ворот (гейтинга - от англ. *'gating") потенциалзависимых ионных каналов, включающая в себя полное теоретическое описание его молекулярного механизма.
Так как точная пространственная конфигурация ионных каналов эу карно г не известна, для изучения их функционирования были привлечены аналогичные каналы бактериальных клеток. Бактериальные каналы содержат только центральную часть соответствующей структуры потенциалзависимого канала, что существенно облегчает исследование их пространственной структуры с помощью рентгенографических методов. Использование бактериальных аналогов является оправданным, так как установлено, что аминокислотная последовательность сегмента ионного канала, отвечающего за процесс гейтинга, консервативна для различных каналов. В данной работе в качестве модельной системы использовался бактериальный потенциалзависимый калиевый канал из Streptomyces lividans KcsA (1BL8), трехмерная структура которого впервые была определена в 1998 году Родериком МакКинноном и его коллегами из Рокфеллеровского университета (The Rockefeller University). В данной работе также исследовано влияние водной среды на перенос протонов в канале и на процесс гейтинга.
Для решения поставленной задачи были использованы два типа теоретических подходов: дискретный, т.е. подход, основанный на постулатах квантовой химии и континуальный, т.е. основанный на законах физики сплошных и коидепсировапных сред, включая солитонный подход для описания механизма транспорта протонов и теорию сегнетоэлектрических фазовых переходов, сопряженных с движением зарядов.
Квантово-химические расчеты проводились с использованием программных средств Gaussian98, HyperChem и др, на компьютерном сервере Compaq Alpha с 2 процессорами EV6 (Sity Colledge of NewYork,
NewYork, USA) и Linux кластере с 24 процессорами Pentium III, 1GHz (кластер Путинского научного центра, г.Пущино, Моск.обл., Россия). При расчетах с помощью программы Gaussian 98 использовался метод B3LYP теории функционала плотности и базисное множество 6-311G**.
Работа над моделями непрерывной среды проводилась компьютерными методами расчета движения зарядов в солитонах на рабочей станции Pentium IV.
Использование одновременно двух теоретических методик позволило обосновать механизм активации воротного механизма канала, в котором деполяризация мембраны преобразуется в перенос протона, что приводит в конечном итоге к открыванию канала. Предложенный механизм открывания канала подтверждается имеющимися экспериментальными результатами и позволяет понять многие особенности, наблюдаемые экспериментально (например, величину воротного тока), которые до сих пор было трудно объяснить исходя из имеющихся теоретических моделей.
Функциональные особенности потенциалзависимых ионных каналов
Ионные каналы описываются в терминах своей ионной проницаемости и механизма открывания. Эти два аспекта функционирования ионных каналов концептуально различаются и изучение молекулярной структуры каналов [78-79] показывает, что те части канала, которые ответственны за гейтинг, физически отделены от тех, которые обеспечивают избирательность каналов.
Работа Но да [66] по изучению Na+ каналов положила начало изучению первичной структуры потенциал зависимых ионных каналов и их функций. Структурная матрица гомологичных доменов является единым структурным блоком как для Na+ так и для К+ каналов, а также и для большого семейства относящихся к ним ионных каналов, в частности циклических, контролируемых нуклеотидами, каналов; Са2+ активированных каналов; trp-подобных Са2+ каналов и т.д.
Потенциал зависимая активация ионных каналов происходит, как было установлено в [80], из-за направленного наружу движения воротных зарядов в ответ на изменение электрического поля мембраны. Исследования [81,82] показали, что в течении процесса активации с помощью Na+ канала через мембрану проходят примерно 12 зарядов. Сегмент S4 " содержит повторяющийся мотив; положительно заряженные аминокислотные остатки разделяются двумя гидрофобными остатками и создают цилиндрический а-геликс с распределенными по спирали положительными зарядами, как это показано на рисунке.
Отрицательное трансмембранное электрическое поле удерживает эту структуру внутри клетки в вертикальной позиции. Модель гейтинга как "скользящего" или "закручивающегося" геликса, предложенная [83] и [84], предполагала, что эти положительные заряды стабилизируются в трансмембранном окружении путем формирования соответствующих им ионных пар с отрицательно заряженными остатками. Деполяризация мембраны, как полагали, позволяла сегменту S4 трансмембранное движение по спирали и тем самым инициировала конформационные изменения, которые и открывали канал. Однако эта модель основана на предположении, что перескок заряженных групп должен происходить через всю толщу мембраны за очень короткое время, а это представляется маловероятным.
В тоже время позднейшие исследования [85] подтверждают, что именно движение положительных зарядов в S4 сегменте играют ключевую роль в процессе гейтинга. Эксперименты проведенные Янгом, Джорджом и Хорном [86] показали, что три положительно заряженных аминокислотных остатка в S4 сегменте становятся доступными вне клетки во время открывания канала. Это движение, оказалось, находится в прекрасном соответствии с теорией движения 12 зарядов по 4-м S4 сегментам во время открывания Ма+ канала. Янг предположил, что S4 сегменты движутся в специальных каналах, которые являются настолько узкими, что за счет малой подвижки S4 позволяют перенос воротных зарядов через энергетический барьер.
Трансмембранное движение сегментов S4 так же было обнаружено в К+ каналах и было измерено при помощи ко валентных меток замещенных цистеиновых остатков [87] и при помощи индуцирования протонного транспорта путем замены гистидиновых остатков в геликсе [88]. Гистидиновые остатки могут давать дополнительный протон при физиологическом значении рН. Таким образом, трансмембранное движение S4 геликса потенциально может служить источником протонного тока. Экспериментально этот протонный ток был зарегистрирован Старасом [89]. Им установлено, что в потенциал зависимых ионных каналах открывание поры инициируется движением заряженных частиц, которые и производят воротный ток. Для исследования реорганизации структуры в сегменте S4 основные остатки были заменены гистидином, после чего производили регистрацию воротного тока. Измерения воротного заряда совместно с рН растворителя обнаружили потенциалзависимые изменения в способности гистидина сольватировать протоны. Результаты эксперимента [90] доказали, что в сегменте S4 заряды в течение гейтинга проходят через всю область электрического поля.
Проведенные Ча эксперименты [91] по резонансному переносу энергии между флюорофорамн, ковалентно прикреплеными к определенным аминокислотным остаткам в различных областях К+ канала, также подтвердили конформационные изменения, происходящие в сегменте S4 во время процесса гейтинга,
В дополнение к указанным экспериментам, Лейчтаг [92] показал, что мутации аргинина в сегменте S4 нарушают способность канала отвечать на изменения напряжения. Так что, предположительно, молекулы аргинина способны переводить протон или последовательность протонов. (Амплитуда наблюдаемого воротного тока соответствует току переноса 3 протонов в одном S4 сегменте.) В исследованиях Стараса также показано, что если два последних аргинина в S4 сегменте мутируют до гистидина, то переноса протонов не происходит, в то время как мутация других аминокислотных остатков не приводит к такому результату.
Точность квантово-химических расчетов и временные затраты
Степень строгости ССП расчета, а точнее - его сложности, может быть различной: в вычисления с разной степенью полноты можно включить возбужденные электронные конфигурации, а можно ограничиться и методом Хартри-Фока (т.е. однодетерминантным приближением). Число базисных функций, используемых при неэмпирическом .расчете, также может быть различным. Все определяется целью расчета и имеющимися компьютерами. Ясно, что чем более высокого уровня расчет, тем более точные результаты могут быть получены с его помощью. Ошибки всех неэмпирических квантовохимических методов возрастают при использовании "коротких" базисных наборов. Следующие оценки точности расчета методом ХФ справедливы для органических молекул при базисе, не хуже чем DZP или 6-31G : 1 длины связей определяются с точностью 0.01-0.02А (для элементе- и металлоорганических соединений несколько хуже); 2 электронная плотность -10%, длины связей и валентные углы - 1 3 энергии конформационных переходов 2 ккал/моль; 4 частоты колебаний для большинства ковалентных связей, следующие из метода ХФ, систематически завышены на 10-12 % из-за пренебрежения электронной корреляцией и энгармонизмом (очень низкие частоты колебаний имеют более высокие ошибки): шкалирующий множитель 0.89 ± 0.01 позволяет получить прекрасное согласие с экспериментом; 5 энергии нулевых колебаний 1 ккал/моль; 6 присоединение/отщепление протона (с использованием смешанного базиса, с включением аниона) — 10 ккал/моль (в газовой фазе); 7 реакции атомизации и гомолитического разрыва связи описываются с большой ошибкой (25-40 ккал/моль); 8
В работах [154,155] было установлено, что метод B3LYP/6-31G(d) позволяет получить энергии активации нитрометана, нитроэтана, а также ряда - галогеннитрометанов, весьма близкие к экспериментальным значениям энергии активации газофазного распада соответствующих веществ. Метод B3LYP/6-3 1++G(df,p) дает минимальные ошибки в определении энтальпий образования реагентов и возможных продуктов пиролиза простых нитросоединений. В случае нитрометана и нитроэтана максимальное различие вычисленных и экспериментальных значений энтальпий образования не превышает 3.5 ккал/моль, а средняя ошибка в наборе из 40 соединений составляет менее 2 ккал/моль Неэмпирический метод Хартри-Фока и его расширение за счет различных способов учета электронной корреляции реализован в нескольких компьютерных программах, нашедших повсеместное распространение. Это, прежде всего программы GAUSSIAN [152], GAMESS и CADPAC. В таблицах 2 и 3 представлены данные о необходимом времени для вычислений энергии системы (sinle point energy calculation). Время работы дано для систем СН4 (таблица 2) и С5Н]2 (таблица 3), рассчитанных на различных уровнях теории, использующей диапазон наборов базисных функций. Все данные даны в отношении ко времени расчета, используемого для самой короткой работы для каждой системы [153].
Вычисления выполнены с помощью программы Gaussian 98. Время расчетов изменяется в зависимости от архитектуры компьютера, но таблицы, тем не менее, хорошо иллюстрируют относительную стоимость различных типов вычислений. Заметно, что имеется весьма небольшое изменение в CPU времени для различных задач. Однако большинство этих задач настолько малы, что почти не требуют затрат машинной памяти. Большее число молекул может дать хорошее приближение к типичным проблемам зависимости времени вычислений от величины задачи. Вторая таблица показывает данные для С5Н12 задачи, которая является более представительной в плане времени, которые требуют расчеты реальных задач. Все представленные в таблицах задачи рассчитывались на машине Cray Т-94 компьютерной системе. Как видно из таблицы для системы, содержащей 5 атомов углерода, требуется от 6 секунд до 16 часов работы на системе Cray. В рамках общей задачи построения модели процесса активизации потенциалзависимого ионного канала важным вопросом являлось определение возможности протонного транспорта вдоль поры потенциалзависимого ионного канала, в частности, вдоль заряженного трансмембранного сегмента К+- канала. Этот трансмембранный сегмент, согласно современным представлениям, имеет прямое отношение к процессу активации потенциалзависимых каналов. Его особенностью является наличие в структуре молекул аргинина/лизина в каждой четвертой позиции. Считается, что возможный перенос протона происходит вдоль аминокислотных остатков, выстилающих внутреннюю поверхность поры канала, за счет перехода протона от одной молекулы аргинина к другой. Так как в поре канала всегда присутствует вода, то представлялось необходимым поместить несколько молекул воды на пути переноса протона. Хотя расстояние между соседними молекулами аргинина в канале точно не известно, однако, согласно рентгенографическим исследованиям оно не превышает 6А. Для выполнения поставленной задачи была построена модель, в которой между двумя молекулами аргинина, расположенными друг от друга на расстоянии от 4 до 7А, помещали несколько молекул воды (от 1 до 4). Одна из молекул аргинина имела излишний протон в ЫНз + группе. В таблице 4 показаны все системы и их конфигурации, которые были исследованы в данной работе.
Определение возможности переноса протона
Из-за того, что для расчета энергии полной системы, состоящей из двух молекул аргинина и нескольких молекул воды, включающей как минимум 54 атома, потребовалось бы слишком большое время, система была упрощена: молекулы аргинина были обрезаны до участков, непосредственно участвующих в процессе переноса протона - групп гуанидина. Для вычисления использовались следующие квантов о-химические методы: 1) для первичной оптимизации геометрии системы использовался полуэмпирический метод РМЗ - метод параметризации 3 , который достаточно аккуратен в расчете геометрии водородных связей и в то же время выполняется сравнительно быстро, 2) в остальных случаях прн расчетах использовался гибридный метод функционала плотности B3LYP (Веске 3 term» Lee Yang, Parr), который имеет форму: где не локальные корреляции предоставлены LYP выражением и VWN -функционал III. А, В,С - константы, определенные Бэке [154] для удовлетворения базису G1. Расчеты проводились с использованием пакета программ Gaussian-98, Предварительное исследование процесса выполнялось полуэмпирическим квантово-химическим методом РМЗ с помощью программы HyperChem. Оптимизированные структуры использовались как исходные данные для поиска энергетических характеристик системы- Если указанный алгоритм терпел неудачу, применялись другие способы определения начального приближения. Все найденные на поверхности потенциальной энергии экстремумы были идентифицированы как минимумы вычислением частот колебаний. Структуры, вычисленные методом РМЗ, как правило, топологически эквивалентны структурам, полученным неэмпирическими методами. Но количественные различия могут быть значительными (до 0.5 А для разрывающихся или образующихся связей). Поэтому неэмпирические вычисления методом B3LYP производились в три стадии. На первой найденная методом РМЗ структура использовалась как начальное приближение для базиса 3-21G.
Далее найденные в базисе 3-21G геометрия и силовые константы использовались как исходные данные для оптимизации геометрии в базисе 6-31G(d), а результат вычислений в этом базисе - как исходные данные в базисе 6-3I++G(df,p)- В найденной экстремальной точке в каждом базисе выполнялся расчет и термодинамических величин. Методика выполнения эксперимента включала в себя несколько этапов. На первом этапе с помощью программы HyperChem формировалась система, состоящая из 2 гу анилиновых групп и нескольких молекул воды. Молекулы гуанидина помещались на различном расстоянии друг от друга и расстояние между гуанидинами измерялось как расстояние от атома углерода С2 одной молекулы до атома углерода С] другой молекулы. После того, как система (рисунок 5) была построена, с помощью программы HyperChem рассчитывалась оптимальная геометрия молекулы. Для этого использовался метод РМЗ» После определения оптимальной геометрии системы формировался входной файл для расчета оптимальной геометрии данной системы с помощью квантово- химической программы Gaussian 99. Для этого сначала, с помощью программы Babel ч проводилось конвертирование! файла из формата HyperChem в, іак называемый. XYZ формат. Затем формировался входной файл ДІЇЯ G98, в которой координаты атомов углерода в обеих молекулах гуанидйка фиксировались, и таким образом фиксировалось расстояние между молекул&ші. Дня оптимизации геометрии молекулы с помощью программы G98 использовался DFT метод B3LYP с базисным набором 6-31 КН-4\ Затеїи, полученные результаты просматривались с помощью бесплатно распространяемой программ MolView. Достоинство это! программа ушпю тстся в том, что QHR позволяет просматривать файлы ЙЫХОДНОГО формата Gaussian 98 без какой-либо дополнительной конвертации. С ее помощью также можно последовательно проследить все сдепаиные Cmus&tam 98 преобразовании геометрии молекулы. Далее, с помощью специально написанной иа скриптоззом языке UnixSliell прій раммм, нз выходного файла Gaussian 98 производи л с & выбор новых, оптимизаронашшх декартовых координат системы. Время расчета оптимальной геометрии для системы варьировалось в зависимости от числа молекул и составляло от 4 до 18 часов. Данные времени расчета оптимальной геометрии системы для каждого исследуемого случая приведены в таблице 5: После того, как система была определена в новых, оптимизированных декартовых координатах» с помощью специально написанной программы, определялась область пространства, в которой будет происходить поиск возможного пути переноса протона от одной молекулы гуанидипа к другой. Для этого необходимо было найти кратчайший путь от одной NH2 группы к другой и вокруг пего в пространстве "вырезать" параллелепипед, захватывающий все атомы водных молекул в свое пространство» Поиск пути переноса протона с помощью программы Gaussian 98 состоял в том, что протон помещался последовательно в каждую точку пространства в выбранной области, координаты атомов углерода для каждой из молекул гуанидина при этом оставались фиксированы — таким образом определялась оптимальная геометрия и минимальная энергия полученной системы. Для минимизации времени расчетов протон перемещался каждый раз на расстояние О.ЗА по одному из трех направлений. Общее число шагов составляло, в зависимости от размеров системы, от 5x5x10=250 до 9x9x20=1620. Число шагов и потребовавшееся Бремя расчета для каждой системы приведено в таблице 6(А-В): Основная сложность на этапе подготовки файлов для расчета поверхности потенциальной энергии системы заключалась в том, что подобные расчеты, с перемещением атома на заданное расстояние, в Gaussian 98 реализованы только для систем, записанных в так называемой z-матрице (R, а, Р).
Модель активации потенциалзависимых ионных каналов
Вопрос о том, каким образом проводимость канала управляется электрическим полем, является одним из центральных в биофизике. В широко распространенной модели Ходжкина-Хаксли предполагается, что проводимость для ионов К+ регулируется некими положительно заряженными управляющими частицами, которые смещаются в мембране при изменениях электрического поля. Смещение положения этих частиц зависит от напряжения приложенного поля и соответствующим образом открывает или закрывает канал. Движение управляющих заряженных частиц определяется по возникновению воротных токов. Однако, эта модель основана на предположении, что перескок заряженных групп должен происходить через всю толщу мембраны, а это представляется маловероятным. Сделано много других попыток объяснения механизма гейтинга, однако они не увенчались успехом. Таким образом, ответ на вопрос каким образом ионный канал активирует проводимость ионов и переходит из закрытого состояния в открытое до сих пор не найден. Проблема, на решение которой направлена данная работа состояла в исследовании механизма гейтинга (т.е. процессов открытия и закрытия) потенциалзависимых ионных каналов возбудимых биологических мембран, открываемых (управляемых) изменением напряжения трансмембранного электрического поля, и в особенности на понимание механизма функционирования (действия) Na+ и К+ каналов, Прежде всего, как основная структура, рассматривались К+ каналы, так как каналы типа KcsA являются единственной структурой, которая сейчас известна. Таким образом, в работе рассматривались способы организации внешних сегментов молекулы ионного канала, существующих в потенциалзависимых каналах, в которых деполяризация мембраны и, соответственно, канала, приводит к появлению (генерации) протона.
Этот «избыточный» протон, в свою очередь и открывает ионный канал (воздействуя на всю сетку водородных связей и изменяя их структуру), как предполагается в предложенной нами модели активации канала. Открытию потенциалзависимого ионного канала предшествует воротный ток, который, как известно, например, для Shaker канала, равен движению эквивалентных 13 элементарных зарядов (равных заряду протона), пересекающих мембрану в поле электрического потенциала. Предлагаемая модель приписывает это движению именно протонов, а не движению массы трансмембранного сегмента молекулы белка ионного канала (как целой структуры); данный сегмент имеет основную аминокислоту (аргинин - arg или лицин - lys) в каждом третьем остатке, поэтому имеет положительные заряды, которые способны перемещаться.
В данной работе предложена новая модель, описывающая механизм гейтинга потенциалзависимых ионных каналов. Хотя пространственная структурная информация об этих каналах на сегодня ограничена каналами из одиночного бактериального белка KcsA топологии КіГ. "Однако, структурные интерполяции на базе электрофизиологических экспериментов на эукариотических каналах К+ находятся в таком согласии со структурой бактериальных каналов, что могут экстраполировать структурные свойства с KcsA на все семейство. К тому же в настоящее время, благодаря белковой кристаллографии, известна первичная структура нескольких К+ каналов (KcsA, MthK, KirBac, KvAP), выявлены химические основы их селективной проницаемости и установлено, что все они имеют одинаковую топологию поры канала. Поэтому для изучения процесса гейтинга в качестве модельной системы мы использовали бактериальный канал KcsA. В основу предложенной модели были положены следующие экспериментально подтвержденные факты: 1. во время перехода из закрытого состояния в открытое канал с регулируемой проницаемостью формально остается в закрытом состоянии, т.е. переноса ионов не происходит, однако многие его характеристики (ток проводимости, воротные токи и т.п.) существенно отличаются от первоначальных и по сути отражают стадии открывания канала. Процесс открывания регулируется специальным воротным механизмом, который определяется самой структурой канала; 2. решаюшая роль в процессе гейтинга принадлежит положительно заряженному транс мембран ному сегменту, который содержит молекулы аргинина (и лизина) в каждой четвертой позиции; 3. экспериментально показано, что воротный ток, открывающий каналы, зависит от присутствия в аминокислотной последовательности молекул аргинина и по сути является протонным током. Лейчтаг показал, что мутации аргинина в 84сегменте К+ каналов нарушают способность канала отвечать на изменения напряжения, а как известно, молекулы аргинина способны переносить протон или последовательность протонов; 4. амплитуда наблюдаемого воротного тока соответствует току переноса 3-х протонов в одном S4 сегменте. В исследованиях Стараса в [156] показано, что если два последних аргинина в S4 сегменте мутируют до гистидина, то переноса протонов не происходит, в то время как мутация других АК остатков не приводит к такому результату; 5. литературные данные свидетельствуют, что ключевую роль в процессе гейтинга играет транспорт протонов в канале. И хотя протонный транспорт в потенциал зависимых ионных каналах не был найден экспериментально, было замечено, что ТМ сегмент S4, который является сенсором напряжений, вовлечен в процесс переноса протонов в Shaker канале. Таким образом, показано, что «воротный» ток фактически является протонным током. Процесс открывания потенциалзависимых и рН-зависимых ионных каналов определяется изменениями в протонной подсистеме канала. Как известно, молекулы воды в канале находятся в связанном состоянии и ориентированы параллельно стенкам поры за счет сильного электрического поля. Существование в канале электрического поля напряженностью 10 В/м доказано экспериментальными работами [157]. Молекулы воды, связанные с аминокислотными остатками, образующими внутреннюю стенку канала способствуют образованию сильных коротких водородных связей- На базе ab initio квантово-химических расчетов было показано, что короткие сильные связи ответственны за удерживание KcsA канала в закрытом состоянии [158]» Как было показано, сильные и короткие Н-связи (длина такой связи порядка 2.5 А), когда перенос протона из одной потенциальной ямы в другую затруднен, могут взаимно превращаться в слабые длинные Н-связи (длина около 2.7 А), с низким барьером, когда перескок протона из одной ямы в другую возможен. Эти трансформации Н-связей играют важную роль в процессе гейтинга канала. Полагают, что процесс гейтинга канала зависит от пространственной организации 4-х доменов с внутриклеточными окончаниями, расположенными достаточно близко друг к другу, так что они могут удерживаться сильными короткими водородными связями в закрытом состоянии. Эти водородные связи, сформированные группами Н5О2 (гидроксониевый комплекс), получая дополнительный протон, трансформируются в слабые водородные связи, которые уже не могут удерживать вместе домены.
