Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 8
1.1. Биохимия оксида азота 8
1.2. Активные формы кислорода 9
1.3. Источники активных форм кислорода и азота в биологических системах 13
1.3.1. NO-синтазы 13
1.3.2. Образование активных форм кислорода митохондриями... 16
1.3.3. Ксантиноксидоредуктаза 19
1.4. Функции оксида азота в биологических системах 20
1.5. Карбонильный стресс и его взаимосвязь с окислительным стрессом 26
1.6. Физиологические доноры оксида азота 31
1.6.1. S-нитрозотиолы 32
1.6.2. Динитрозильные комплексы железа 35
1.6.3. Физиологические функции ДНКЖ и S-нитрозотиолов 39
1.7. Использование оксида азота в медицине 41
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Получение препаратов 45
2.2. Регистрация спектров ЭПР и регистрация образования супероксидного радикала при моделировании карбонильного стресса... 46
2.3. Методика исследования уровня и распределения оксида азота в тканях и органах животных 47
2.4. Получение изолированных митохондрий 49
Глава 3. Антиоксидантные свойства ДНКЖ 50
Глава 4. Механизм образования супероксидного радикала при взаимодействии L-лизина с метилглиоксалем 62
Глава 5. Образование новых типов ДНКЖ при моделировании карбонильного стресса 73
Глава 6. Исследование уровня и распределения оксида азота и его производных в тканях и органах животных 81
6.1. Преобразование различных типов ДНКЖ при их введении в кровь 81
6.2. Ингаляция воздухом с повышенным содержанием NO 85
6.3. Изменение уровня NO в тканях органов крыс после инъекции глутатионовых ДНКЖ 92
Заключение 96
Выводы 98
Библиографический список 99
- Источники активных форм кислорода и азота в биологических системах
- Физиологические доноры оксида азота
- Регистрация спектров ЭПР и регистрация образования супероксидного радикала при моделировании карбонильного стресса...
- Механизм образования супероксидного радикала при взаимодействии L-лизина с метилглиоксалем
Введение к работе
В настоящее время одной из актуальных задач в медицинской биофизике, физиологии и медицинской химии является изучение процессов, в которых участвуют активные короткоживущие молекулы, являющиеся регуляторами на различных уровнях организации живых организмов. К таким соединениям, в первую очередь, относятся оксид азота (NO) и его производные. В последние годы появляется все больше данных о новых физиологических функциях оксида азота и его метаболитов. Кроме сигнальной роли NO, актуальной областью исследования являются реакции оксида азота с активными формами кислорода. Возникающие в этих реакциях активные соединения - пероксинитрит, диоксид азота, N02C1 и др. являются важными компонентами иммунного ответа в организме человека и животных, а также участвуют в процессах апоптоза. С другой стороны, изменение концентрации оксида азота под действием различных свободных радикалов и других высокореакционных интермедиатов служит важнейшим фактором, влияющим на физиологическую активность NO, в том числе на сигнальную функцию этой молекулы. Кроме того, активные формы кислорода и азота участвуют в развитии патологий, связанных с окислительным стрессом: атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, нейродегенеративные заболевания, катаракта, рак, диабет. Однако, взаимодействия активных форм кислорода с такими производными NO как S-нитрозотиолы (RSNO) и динитрозильные комплексы железа остаются мало изученными. Существенно, что сам оксид азота и S-нитрозотиолы в различных модельных системах и в организме проявляют цитопротекторные и антиоксидантные свойства [1]. Предполагается, что редокс-активные ионы железа связываются в составе нитрозильных комплексов, при этом ингибируются реакции свободно-радикального окисления биологических молекул. Известно также, что перекисное окисление липидов ингибируется благодаря взаимодействию NO с алкилпероксильными и алкоксильными радикалами и гемовыми группами некоторых белков.
В ходе ряда связанных с диабетом патологий окислительный стресс сочетается с карбонильным, возникающим в результате увеличения концентрации активных соединений, содержащих альдегидные и карбонильные группы. К этим соединениям относятся глиоксаль, метилглиоксаль, 3-гидроксиглюкозон, представляющие собой продукты окисления глюкозы и других Сахаров. Активными карбонильными соединениями являются также малоновый диальдегид и 4-гидроксиноненаль, возникающие при перекисном окислении липидов. Выше перечисленные соединения модифицируют аминокислотные остатки белков и азотистые основания нуклеиновых кислот, меняя свойства этих важнейших биомолекул [2-3]. В литературе имеются противоречивые данные о влиянии карбонильного стресса на метаболизм оксида азота. Предполагают, что продукты взаимодействия активных карбонильных соединений с белками могут опосредованно влиять на активность NO-синтазы и в то же время непосредственно перехватывать NO. Тем не менее, механизм этих процессов остается не ясным. Известно, что в реакции метилглиоксаля с аминокислотами образуется супероксидный радикал [4]. Поскольку супероксид чрезвычайно эффективно взаимодействует с оксидом азота, последний должен элиминироваться в ходе карбонильного стресса. В связи с этим, особый интерес представляет изучение взаимного влияния интермедиатов карбонильного стресса и физиологических метаболитов оксида азота (ДНКЖ и S-нитрозотиолов). Из выше сказанного следует, что эти физиологические производные оксида азота могут играть чрезвычайно важную роль, как в нормальных условиях существования живого организма, так и в ходе патологических процессов, сопровождающихся окислительным и карбонильным стрессом. Исследование механизмов процессов, происходящих с участием оксида азота, активных форм кислорода и карбонильных соединений, особо интересно, так как эти процессы являются пересечением ключевых регуляторных путей в клетках и тканях живого организма.
Цель и задачи исследования.
Целью работы являлось выяснение роли оксида азота и динитрозильньгх комплексов железа при карбонильном и окислительном стрессе, а также исследование распределения оксида азота и его метаболитов в тканях и органах животных.
Исходя из поставленной в диссертационной работе цели, решались следующие задачи:
Выяснить физико-химические механизмы антиоксидантного действия ДНКЖ в различных модельных системах.
Изучить закономерности взаимодействия активных форм кислорода и азота в условиях, моделирующих карбонильный стресс.
Выяснить механизмы образования новых типов ДНКЖ, связанных с продуктами взаимодействия метилглиоксаля со свободными аминокислотами.
Исследовать влияние ингаляционного введения NO и влияние инъекций препарата ДНКЖ на уровень оксида азота в тканях разных органов.
Источники активных форм кислорода и азота в биологических системах
В отличие от супероксида, синтез которого может являться побочным результатом взаимодействия кислорода с различными редокс-агентами в клетках, NO в биологических системах продуцируется ферментативным путем, в результате окисления аминокислоты аргинина с одновременным синтезом другой аминокислоты цитруллина под влиянием фермента NO-синтазы, при этом окисляется NADPH, а кислород восстанавливается до воды. На сегодняшний день известны четыре изоформы NO-CHHTa3(NOS): нейрональная (nNOS), митохондриальная (mtNOS), эндотелиальная (eNOS) и индуцибельная (iNOS) NO-синтазы [12]. Все изоформы NOS представляют собой гомодимеры с молекулярным весом 130-180 kD. Основное различие между NO-синтазами заключается в месте их локализации и способах регуляции их ферментативной активности. Эндотелиальная и нейрональная изоформы выявлены в эндотелеоцитах, нейронах, тромбоцитах, нейтрофилах и некоторых других клетках, регулируются преимущественно физиологическими факторами. Вместе с митохондриальной они являются кальций- и кальмодулин- зависимыми NO-синтазами. Индуцибельно экспрессируемая NO-синтаза найдена в макрофагах, гепатоцитах, фибробластах, миоцитах и в некоторых других клеточных культурах. В отличие от остальных изоформ индуцибельная NO-синтаза не нуждается в ионах кальция для своей активации, так как кальмодулин жестко связан с этим ферментом, обеспечивая его постоянное функционирование [13, 14].
NO-синтазы существуют в клетке в виде димера и активны только в таком состоянии. В составе каждой субъединицы димера различают редуктазный, кальмодулинсвязывающий и оксигеназный домены. Редуктазный домен содержит флавины ФАД и ФМН: ФАД является первичным акцептором электронов от БАДФН, а ФМН переносит электроны от ФАД на оксигеназный домен [12]. Последний содержит гемовую группу, рядом с которой связываются молекулы L-аргинина и кислорода. На этом участке фермента происходит окисление L-аргинина с выделением из него молекулы оксида азота. Важную роль в процессе синтеза играет молекула (6К)-5,6,7,8-тетрагидро-Ь-биоптерин (ВЩ), которая связывается с оксигеназным доменом. При отсутствии этой молекулы синтез оксида азота невозможен [15]. Считается, что комплекс кальмодулина с Са придает ферменту конформационное состояние, необходимое для внутреннего переноса электронов. Именно отличия в прочности связывания кальмодулина с димером NOS обуславливают каталитические различия изоформ. Активность nNOS и eNOS сильно зависит от концентрации Са , в то время как с iNOS кальмодулин связан столь прочно, что она не нуждается в добавлении Са2+ [16]. Хотя удельные активности всех изоформ NOS одинаковы, при работе в организме оказывается, что конститутивно присутствующие в клетках NO-синтазы синтезируют небольшие концентрации N0 в течение короткого времени, a iNOS синтезирует значительно большие концентрации NO в течение длительных периодов (до нескольких дней).
В последнее десятилетие несколько независимых лаборатории опубликовали данные о ферментативном образовании супероксида всеми изоформами NO-синтаз [19]. Это происходит при отсутствии субстрата L-аргинина, которое приводит к разобщению процесса переноса электрона на гем. Реакция требует присутствия в системе молекулярного кислорода и кальмодулина. В результате, вместо оксида азота генерируется супероксид и перекись водорода. В этом процессе интересна роль биоптерина, в некоторых исследованиях показано, что BHt может на время запасать электрон, тем самым, подавляя генерацию супероксида [19]. Значительное выделение супероксида происходит только когда концентрация ВН4 2цМ, a L-аргинина 100 цМ. Однако, есть исследования в которых утверждается, что генерация Ог" происходит в результате самоокисления редокс-активньгх кофакторов, а не за счет ферментативной реакции [20].
Из выше перечисленного следует, что регуляция NO-синтаз является сложным процессом, поэтому в научных исследованиях весьма популярно использование экзогенных источников оксида азота (в частности и биологических). В этом случае, результаты действия оксида азота легче интерпретировать, так как отсекаются эффекты сигнальных веществ, которые могут влиять на биосинтез NO .
Митохондрии - клеточные органеллы, обеспечивающие большую часть необходимого клетке АТФ. Основная их функция - это захват богатых энергией субстратов (жирные кислоты, пируват, углеродный скелет аминокислот) и их окислительное расщепление с образованием СО2 и Н20, сопряженное с синтезом АТФ. Таким образом, митохондрии являются основными потребителями кислорода в клетке. Потребление кислорода в качестве окислителя обычно называют внутриклеточным дыханием. Этот процесс осуществляется дыхательной цепью митохондрий, которая осуществляет перенос электронов от субстратов окисления (НАДН, сукцинат) на молекулярный кислород с восстановлением его до воды, при этом происходит направленный перенос протонов из матрикса в межмембранное пространство. Энергия, накопленная в виде разности концентраций протонов, расходуется на синтез АТФ. Помимо этого митохондрии участвуют в синтезе стероидов коры надпочечников, отвечают за процесс теплопродукции в клетках бурого жира, являются внутриклеточным депо ионов кальция, играют важную роль в развитии процессов апоптоза, его инициировании и многих других процессах.
Перенос электронов осуществляется в результате работы дыхательной цепи митохондрий. Побочным продуктом ее функционирования является генерация супероксида. В нормальных условиях при окислительном фосфорелировании от 0,15 до 5% потребляемого кислорода переходит в супероксид [21,22]. Такая неточность в оценке связана с рядом методологических проблем. Кроме того, известно, что супероксид наиболее интенсивно продуцируется митохондриями, выделенными из тканей и органов с патологическими нарушениями. Было показано, что генерация супероксида заметно увеличивается при ишемии и последующей реперфузии ткани [23], а также в ходе старения организма. Продукция супероксида в значительной степени зависит таюке от тканевой, видовой принадлежности и от режима работы дыхательной цепи.
Физиологические доноры оксида азота
Как было отмечено выше оксид азота это высокореакционное соединение, его взаимодействие с супероксидом приводит к появлению токсичных соединений и, следовательно, к окислительному и нитрозильному стрессу. К тому же NO может перехватываться гемоглобином или окисляться. Все это крайне ограничивает время его жизни, и все же известно, что оксид азота оказывает паракринное действие, синтезируясь в одних клетках, он влияет на метаболические процессы в соседних клетках. Предполагают, что для обеспечения такого транспорта и защиты природа прибегает к включению N0 в S-нитрозотиолы (RS-NO) и динитрозильные комплексы железа [57, 58].
Известно, что эти- соединения постоянно формируются в различных клетках и тканях организма, особенно при интенсивной продукции оксида азота индуцибельной NO-синтазой [59]. Представляется возможным, что динитрозильные комплексы и S-нитрозотиолы являются своеобразным депо для оксида азота. Другой их функцией может быть транспортировка NO к различным биологическим целям, отдельно или вместе с железом, с последующим высвобождением этих компонентов.
ДНЮК и RS-NO в биосистемах существуют в двух формах -низкомолекулярной и связанной с тиольными группами белков [57]. Белковые формы стабильнее из-за более высокого сродства к оксиду азота, поэтому они могут функционировать как внутриклеточное депо NO. Эти формы медленно высвобождают оксид азота и обладают низкой лабильностью внутри клеток, т. е как доноры они менее эффективны. Перенос оксида азота, вероятно, осуществляют низкомолекулярные ДНКЖ и RS-NO, они легче перемещаются в биологических средах, могут переноситься через мембраны и обладают меньшим сродством к NO. S-нитрозотиолы возникают как эндогенный продукт реакции NO или активных производных NO с сульфгидрильными группами. Первичной мишенью является сульфгидрильная группа цистеиновых остатков, которые присутствуют во многих белках [60, 61]. Также мишенью могут быть тиольные группы эндогенного глутатиона (GSH) или цистеина (Cys). Нитрозилирование сульфгидрильной группы приводит к образованию S-нитрозотиолов с высоким или низким молекулярным весом соответственно. В организме совместный пул S-нитрозотиолов делится на группы. В таблице 1 приведено содержание метаболитов NO для различных тканей. Максимальный уровень был обнаружен в эритроцитах 250 нМ, минимальный в плазме 10 нМ. Подавляющая часть (90%) всех нитрозильных групп связана с белками и принадлежит к классу высокомолекулярных соединений. Интерес к S-нитрозотиолам был вызван тем, что эти соединения по наблюдениям in vivo могут вызывать физиологический ответ, чрезвычайно напоминающий свободные NO радикалы. Хорошо описанным примером являются вазодилатация и ингибирование агрегации тромбоцитов.
Рассмотрим нитрозотиолы низкой молекулярной массы. Было синтезировано in vitro много различных форм нитрозотиолов, они широко тестировались как доноры N0 (например, 8-нитрозо-№ацетилпенциламин (SNAP)), но у млекопитающих наиболее значимыми являются S-нитрозоцистеин (Cys-NO) и особенно S-нитрозоглутатион (GSNO). Последний обнаружен во всех тканях, его базовая концентрация находится в пределах 1-10 нМ, максимальная концентрация обнаружена в тканях аорты и эритроцитах (таб. 1). Известно, что концентрация эндогенного глутатиона (GSH) находится в пределах милимолярных концентраций, это показывает, что доля S-нитрозотиолов от GSH это процент или меньше. Клеточный метаболизм S-нитрозотиолов сложен и еще не полностью объяснен. Много споров вызывают пути биосинтеза. Было продемонстрировано, что при физиологическом рН, S-нитрозотиолы не синтезируются при взаимодействии свободного оксида азота и тиолов. Как уже отмечалось выше, S-нитрозотиолы могут возникать с участием окислов азота [8]. Однако имеются данные о возможном образовании этих соединений из динитрозильных комплексов железа [57].
Динитрозильные комплексы железа образуются при взаимодействии оксида азота, негемового железа и различных лигандов, например тиолов. В биологических системах комплексы были обнаружены с помощью метода электронного парамагнитного резонанса, т.к. они обладают характерным спектром с g фактором равным 2,03. Впервые, сигнал с таким g фактором был зарегистрирован еще в 60-х годах тремя независимыми группами. Малярд и Кент наблюдали присутствие парамагнитных центров с g фактором 2,03 в печени крыс [63]. Коммонер с соавторами также обнаружили аналогичный сигнал ЭПР в печени крыс на первых этапах индуцированного карциногенеза [64]. Ванин А.Ф. наблюдал похожие сигналы в культуре дрожжевых клеток, а затем и в клетках животных [65]. Позднее сигнал удалось идентифицировать, было показано, что его ЭПР спектр совпадает со спектром низкомолекулярных динитрозильных комплексов при температуре жидкого азота. Этот вывод был подтвержден экспериментально, например было показано, что при содержании животных на диете с повышенным содержанием нитрита, происходит образование этих парамагнитных центров в различных тканях и органах [59, 66]. Показано также, что при добавлении в питьевую воду животным изотопа железа Fe, наблюдается включение его в комплексы [67]. Интерес к динитрозильным комплексам резко возрос только в 90-х после открытия физиологической роли эндогенного NO у млекопитающих. В ряде работ было продемонстрировано зависимое от L- аргинина образование ДНКЖ, т.е. оксид азота, который включается в состав ДНКЖ, генерируется NO-синтазой [68]. Так, образование ДНКЖ из эндогенных компонентов (ионов железа, тиолов и NO) происходило в клетках и тканях экспрессирующих индуцибельную NOS, в том числе в макрофагах, фибробластах [69], гепатоцитах [70], клетках гладких мышц сосудов, изолированной аорте крыс [71], изолированых островках Лангерганса, различных типах раковых клеток и других биологических моделях in vivo и in vitro [68]. Формирование ДНКЖ наблюдали и в клетках с конститутивной изоформой NO-синтазы, например, в изолированных эндотелиальных клетках свиньи после их стимуляции брадикинином или ионофором А23187 [72]. Эндогенные динитрозильные комплексы железа были обнаружены также в бактериальных клетках [73].
Регистрация спектров ЭПР и регистрация образования супероксидного радикала при моделировании карбонильного стресса...
Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре Е-109Е фирмы Varian (США). Условия регистрации спектров ЭПР: СВЧ мощность 5 мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0,05 мТл для TER.ON и СВЧ мощность 10 мВт, амплитуда ВЧ модуляции 0,4 мТл для ДНКЖ. Спектры феноксильного радикала пробукола регистрировали при СВЧ мощности 50 мВт. В экспериментах с генерацией (V, для постоянства газового состава образцы помещали в тонкостенный (толщина стенок 0,00254 мм) газопроницаемый тефлоновый капилляр PTFE 22 (Zeus Industrial Products, Inc., USA), а запись спектров проводили при непрерывной продувке воздухом. В остальных случаях образцы помешались в стеклянные капилляры. Для генерации супероксида использовалась митохондрии, а также система ксантин-ксантиноксидаза.
В экспериментах моделирования карбонильного стресса регистрацию спектров ЭПР проводили при комнатной температуре. Условия регистрации: СВЧ-мощность 20 мВт, СВ-частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧ-модуляции 0,2 мТл. Запись спектров начинали через 1 мин после смешивания реакционных компонентов. Реакционную смесь (120 мкл) вводили в газопроницаемые тефлоновые капилляры. Капилляры помещали в кварцевую трубку, через которую в ходе измерения постоянно продували азот или воздух. Симуляцию спектров ЭПР проводили с использованием программы Simphonia (Brucker). В качестве стандарта использовали сигнал ЭПР стабильного синтетического свободного радикала - дифенилпикрилгидразина. Генерирование супероксидного анион-радикала (02 ) определяли двумя независимыми методами: по восстановлению супероксидом нитросинего тетразолия и по индуцированной 02" хемилюминесценции люцигенина. Кинетику накопления продукта восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) - формазана определяли по поглощению при 560 нм на спектрофотомере Hitachi-557 (Япония) при температуре 25. Реакцию инициировали добавлением 10 мМ метилглиоксаля к среде, содержащей 100 мкМ нитросинего тетразолия и 10 мМ L-лизина в 100 мМ карбонатном буфере рН 9,5. Хемилюминесценцию измеряли с помощью хемилюминометра Lum-5773 (Россия) в среде, содержащей 20 мкМ люцигенина; 15 мМ L-лизина; 15 мМ метилглиоксаля в 100 мМ К,№-фосфатном буфере рН 7,8. Измерения проводили при температуре 37 и постоянном перемешивании реакционной среды. Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента.
Эксперименты проводились на крысах Wistar (самцы массой 350-400 г). Всех животных произвольным образом делили на две экспериментальные группы, по 4-5 особей в каждой. В первой группе (контроль) крыс анестезировали уретаном, проводили трахеотомию, подключали к аппарату искусственной вентиляции лёгких (АВЛ). Далее всем животным путём инъекций вводились компоненты спиновой ловушки NO: диэтилдитиокарбамат (DETC, 620 мг/(кг массы тела), в 1,0 мл физиологического раствора, внутрибрюшинно) и FeSO HaO с цитратом Na (25 и 125 мг/(кг массы тела), соответственно, в 1,0 мл физиологического раствора, подкожно в область левого плеча). Через 30 мин всех животных контрольной группы забивали, после чего у них быстро экстрагировали органы (сердце, лёгкое, печень, почка, скелетная мышца), а также брали образец цельной крови. Животным из второй экспериментальной группы после анестезии, трахеотомии и подключения к АВЛ так же, как и в контрольной группе, вводились компоненты спиновой ловушки NO. В течении последующих мин проводилась ингаляция воздухом с повышенным содержанием NO, для чего небольшое количество оксида азота вводилось в канал активного вдоха АВЛ. При этом содержание NO в дыхательной смеси приблизительно в 4-5 раз превышало его естественный уровень в воздухе. По истечению этих 30 минут животных забивали и экстрагировали органы. В экспериментах по определению изменения уровня оксида азота в результате инъекций препарата динитрозильных комплексов железа, животным из второй группы после анестезии вводили препарат ДНКЖ (90 мг/кг) через катетер, введенный в яремную вену, спустя 2 минуты через катетер получали образцы цельной венозной крови. После этого этим крысам по стандартной методике вводили компоненты спиновой ловушки NO. Через 30 мин после инъекции ДНКЖ этих животных также забивали и экстрагировали органы, а также получали образцы цельной крови, соответствующие окончанию опыта.
Изолированные органы всех животных промывали в физиологическом растворе, после чего их измельчали и помещали в пластиковые трубки диаметром 5,0 мм. Полученные образцы ткани органов, а также крови быстро замораживали и хранили в жидком азоте. Спектры ЭПР всех образцов регистрировали при температуре жидкого азота на спектрометре X-диапазона типа Е-109Е фирмы "Varian" (США). Амплитуда модуляции магнитного поля составляла 0,2 мТл при частоте 100 кГц. Частота СВЧ-поля составляла 9,32 ГГц, а её мощность во всех случаях устанавливалась на уровне 10 мВт. Спектры всех образцов регистрировались в области g=2,04. После записи спектров все образцы органов размораживали и определяли массу ткани в активной зоне резонатора спектрометра.
Статистическая достоверность эффектов определялась с помощью t-критерия Стьюдента. В экспериментах по введению различных типов ДНКЖ в кровь отбор крови крыс проводили из сонной артерии. Образцы цельной крови (1-1,5 мл) помещали в гепаринизированные пробирки и хранили при температуре + 4 С. Эксперименты ставили в течении 1,5 часов от момента отбора. Объём вводимых препаратов ДНЮК составлял не более 4 % от общего объема крови. Для отделения форменных элементов кровь центрифугировали на микроцентрифуге (Microspin) в течении 5 мин при скорости 35000 об/мин.
Механизм образования супероксидного радикала при взаимодействии L-лизина с метилглиоксалем
Активные формы кислорода и карбонильные соединения способны вызывать модификацию аминокислотных остатков белковых молекул [54, 101-104]. Модифицированные белки являются маркерами атеросклероза, сахарного диабета, нейродегенеративных заболеваний и других патологий, возникающих при развитии окислительного стресса [101-103]. Увеличение уровня активных форм кислорода при окислительном стрессе индуцирует перекисное окисление липидов и образование реакционноспособных карбонильных соединений, подобных 4-гидроксиноненалю и малоновому диальдегиду [101, 2]. Кроме того, при диабетической гипергликемии возможно развитие так называемого «карбонильного стресса», возникающего вследствие накопления карбонильных соединений иной структуры, являющихся продуктами автоокисления глюкозы и метаболизма триозофосфатов, в том числе глиоксаля, метилглиоксаля и 3-дезоксиглюкозона [55, 107]. В данной работе, в качестве модели карбонильного стресса, была использована система взаимодействия L-лизина и метилглиоксаля. В организме млекопитающих метилглиоксаль образуется как в процессе гликолиза, так и при автоокислении глюкозы [105, 109]. Использование L-лизина было обусловлено тем, что эта аминокислота является одной из основных мишеней действия активных карбонильных соединений в белковых молекулах [105, ПО]. На рис. 19 приведены результаты ЭПР-спектроскопии продуктов реакций L-лизина с метилглиоксалем. Из приведенных на этом рисунке данных видно, что в анаэробных условиях в реакции L-лизина с метилглиоксалем удается зарегистрировать свободнорадикальные интермедиаты (рис. 19, спектр 1). Спектры ЭПР этих свободнорадикальных интермедиатов характеризуются многокомпонентной сверхтонкой структурой и могут являться суперпозицией спектров анион-радикала метилглиоксаля (МГ ) и катион-радикала диалкилимина [107].
Анализ литературных данных [107, 108, ПО] позволяет предположить последовательность реакций, приводящих к образованию свободных радикалов при взаимодействии аминокислот с карбонильными соединениями (рис. 20). Из представленной схемы видно, что диалкилимин представляет собой основание Шиффа, возникающее в процессе взаимодействия карбонильных групп метилглиоксаля с двумя молекулами L-лизина. В реакции диалкилимина с ещё одной молекулой а-кетоальдегида образуются, соответственно, катион-радикал основания Шиффа и семидион метилглиоксаля (МГ ).
Важно отметить, что в условиях аэрации реакционной смеси были зарегистрированы лишь следовые количества свободнорадикальных интермедиатов (рис. 19, спектр 2). Замена газовой среды на азот после инкубации смеси метилглиоксаля с L-лизином в аэробных условиях приводит к значительному (почти на порядок) росту уровня свободных радикалов, предположительно диалкилимина и метилглиоксаля (рис. 21). Существенно, что в этих условиях содержание свободнорадикальных интермедиатов возрастало при добавлении СОД к реакционной смеси (рис. 21, кривая 2). Вызываемый СОД эффект может быть связан с тем, что этот фермент удаляет супероксидный радикал, генерируемый в исследуемой модельной системе.
В используемой в работе модельной системе также было обнаружено, что 02" интенсивно генерируется при взаимодействии L-лизина с метилглиоксалем в карбонатном буфере рН 9,5. Оценку образования супероксида проводили по накоплению формазана при восстановлении НСТ (рис. 22). Накопление формазана в этих условиях может не зависеть от 02 , т.к. нельзя исключить восстановления НСТ другими интермедиатами реакции L-лизина с метилглиоксалем. Тем не менее, исходя из того, что СОД значительно (более чем в 4 раза) подавляла образование формазана в описанных условиях, можно утверждать, что большая часть НСТ восстанавливается под действием 02 (рис. 22). Скорость реакции аминогрупп с метилглиоксалем снижается при повышении кислотности среды [111, 112]. Использование хемилюминесценции в качестве метода, более чувствительного, чем восстановление НСТ [113], позволило обнаружить образование 02 в смеси метилглиоксаля с L-лизином при рН 7,8 (рис. 23), т.е. в условиях близких к физиологическим. СОД в этих условиях практически полностью ингибирует хемилюминесценцию люцигенина, что является доказательством зависимости этого процесса от присутствия супероксидного анион-радикала (рис. 23, кривая 2).
Снижение концентрации регистрируемых методом ЭПР свободных радикалов в аэрируемой реакционной среде, вероятно, не связано с ингибированием их образования. Действительно, при продувке азотом содержание свободнорадикальных интермедиатов достигает максимума через 8 мин. после смешивания реакционных компонентов, но при смене газовой среды на воздух уровень выявляемых методом ЭПР свободных радикалов быстро падает (рис. 24А). Таким образом, молекулярный кислород и 02" , по-видимому, непосредственно взаимодействуют со свободнорадикальными производными диалкилимина и метилглиоксаля, причем образующиеся в этой реакции продукты не регистрируются методом ЭПР (рис. 24А). В этих экспериментальных условиях СОД достоверно снижала скорость падения интенсивности сигнала ЭПР в ходе аэрации (рис. 24А, кривая 2). Через 2 мин после повышения концентрации кислорода в среде, содержащей L-лизин и метилглиоксаль, в ней не удаётся обнаружить свободнорадикальных интермедиатов (рис. 24А, кривая 2). При аэрации реакционной среды в присутствии СОД зарегистрирован спектр ЭПР, имеющий 5 компонент сверхтонкой структуры, и g фактор, равный 2,0042 (рис. 24Б, спектр 2). Согласно литературным данным, характеристики приведенного на рис. 24Б спектра ЭПР соответствуют сигналу цис-формы анион-радикала метилглиоксаля (рис. 24Б, спектры 2 и 3) [114]. Вероятно, наличие этого сигнала в присутствии СОД указывает на возможность элиминации МГ под действием супероксида. Этот результат, на первый взгляд, представляется парадоксальным, так как сам Ог согласно [107] образуется в реакции (1). Тем не менее, известно, что в водных средах 02 восстанавливает некоторые органические радикалы [114], а также катализирует протонирование и диспропорционирование анион-радикала нитробензола [115].
