Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания Крындушкин Дмитрий Сергеевич

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Крындушкин Дмитрий Сергеевич. Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания : Дис. ... канд. физ.-мат. наук : 03.00.02 : Москва, 2004 126 c. РГБ ОД, 61:04-1/1214

Содержание к диссертации

Введение

1. Прионы млекопитающих 10

1.1. Прионы - новый класс инфекционных агентов 10

1.2. Инфекционная активность прионов млекопитающих связана с белком РгР с 11

1.3. Доказательства прионной гипотезы 13

1.3.1. Использование экспериментальных животных для исследования инфекционности прионов. Существование межвидового барьера 13

1.3.2. Изучение прионов млекопитающих с помощью трансгенных животных 14

1.3.3. Взаимодействие PrPSc и РгРс. Изучение прионного превращения белка РгР in vitro. Штаммы прионов 14

1.4. Молекулярные модели прионного перехода 16

1.5. Предполагаемая функция белка РгР. Может ли патологический эффект PrPSc объясняться инактивацией белка 17

1.5.1. Структура белка РгР. Си2+-связывающая активность РгР 17

1.5.2. Роль белка РгР в защите клеток нервной системы 20

2. Прионы низших эукариот 21

2.1. Нехромосомные детерминанты [Р8Ґ] и [URE3] дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Цитоплазматический детерминант [Het-s] грибаPodospora anserina.. 21

2.2. Молекулярная природа детерминанта [Р5Ґ]: прионный переход белка Sup35... 24

2.2.1. Структура и функция белка Sup35. Роль N- концевого домена в возникновении и поддержании детерминанта [ЛИ ] 24

2.2.2. Экспериментальные доказательства прионных свойств белка Sup35 26

2.2.3. Мутации в гене SUP35, приводящие к потере прионного детерминанта [PSt]. Штаммы прионного детерминанта [Р8Ґ] 30

2.3. Создание гибридного цриона на основе N- концевого домена ортолога Sup35 из дрожжей Pichia methanolica ,... 31

2.4. Сходство прионной формы белков Sup35 и Ure2 с амилоидами млекопитающих. Структура амилоидных фибрилл 32

2.5. Биологическое значение прионов низших эукариот , 34

3. Клеточные факторы, влияющие на поддержание прионного состояния белков . , 36

3.1. Шапероны: классификация и функциональное значение

3.2. Влияние шаперонов на прионный переход PrP in vitro a in vivo 38

3.3. Роль шаперона Hspl04 в поддержании детерминанта [РДТ1"]. Действие GuHCl на [Р8Ґ] обусловлено инактивацией Hsp 104

Заключение 41

Инфекционная активность прионов млекопитающих связана с белком РгР с
Предполагаемая функция белка РгР. Может ли патологический эффект PrPSc объясняться инактивацией белка
Молекулярная природа детерминанта [Р5Ґ]: прионный переход белка Sup35...
Влияние шаперонов на прионный переход PrP in vitro a in vivo

Введение к работе

Термин "прион" появился в связи с исследованием ряда дегенеративных заболеваний центральной нервной системы с неизвестной этиологией, таких как скрейпи овец и болезнь Крейцфельда-Якоба человека. Несмотря на то, что эти болезни, особенно у животных, известны довольно давно, природа их оставалась неизвестной вплоть до последнего времени. Медленный прогресс в исследовании этих болезней был связан как с необычно долгим инкубационным периодом при развитии заболевания, так и со способом их возникновения: они могут возникать спорадически и в го же время могут наследоваться, а также передаваться инфекционным путем. Разнообразие путей возникновения ставило в тупик большинство исследователей. В 1967 была предложена «белковая» гипотеза, согласно которой инфекционный агент (получивший название "прион") представляет собой обычный клеточный белок, находящийся в особом конформационном состоянии, которое способно к самоподдержанию при помощи автокаталитического механизма. На сегодняшний день эту гипотезу можно считать доказанной. Ее подтверждают практически все экспериментальные данные, а также тот факт, что до сих пор не удалось найти какую-либо нуклеиновую кислоту, связанную с передачей этих инфекционных заболеваний.

За последние десять лет появились работы, показывающие существование прионных белков не только у млекопитающих, но и у дрожжей S. cerevisiae и гриба Podospora anserina. Если у млекопитающих существование прионов во всех известных случаях связано с патологией, то у низших эукариот данное явление может иметь адаптивное значение, У дрожжей прионоподобные свойства белков лежат в основе механизмов эпигенетической наследственности и регуляции экспрессии генов на посттрансляционном уровне.

Изучение прионов у дрожжей открывает новые перспективы в понимании сущности этого явления. Возможно, феномен прионов гораздо шире распространен в природе и играет существенно большее значение у различных организмов, чем это известно на сегодняшний день. Поиск в геномных базах выявляет значительное количество белков у различных организмов, структурно сходных с уже известными прионными белками у дрожжей. Это наводит на мысль о том, что белки со способностью приобретать альтернативную самоподдерживающуюся конформацию широко распространены и могут играть важную роль в регуляции физиологических процессов в клетке. Кроме того, до сих пор остается открытой проблема диагностики и лечения прионных болезней у человека. Особое значение данная проблема получила в силу появившихся в последнее время сообщений о возможности передачи данных заболеваний от животных к человеку при употреблении в пишу мяса больных животных. Ввиду того, что дрожжевые прионы сходны по своим принципиальным свойствам с прионами млекопитающих, изучение механизмов образования и элиминации прионов у дрожжей позволит глубже понять патогенез прионных заболеваний и разработать подходы к их терапии.

Таким образом, на сегодняшний день актуальной представляется задача поиска белков, критичных для поддержания прионного детерминанта у дрожжей. Подобные белки могли бы в перспективе быть использованы как "молекулярное лекарство" для лечения прионных заболеваний человека и животных. Регуляция экспрессии таких белков в клетке также может представлять интерес как для биологии, так и для медицины. Данная диссертационная работа включает в себя попытку реализации этого замысла с использованием дрожжевого прионного детерминанта.

Несмотря на наличие доказательств прионный гипотезы для ряда белков млекопитающих и низших эукариот, на сегодняшний день получено очень мало данных о структурной организации прионов. Практически все имеющиеся данные получены в экспериментах, проводимых с прионными белками in vitro. Отсутствие структурных данных существенно затрудняет понимание процессов, происходящих в клетке на молекулярном уровне. Поэтому одной из задач нашей работы явилось создание нового методического подхода, дающего информацию о структуре прионов дрожжей, а также использование этого метода для изучения механизмов их репликации. Подобный методический подход может быть использован в будущем и для анализа других прионных белков.

Инфекционная активность прионов млекопитающих связана с белком РгР с

В 1982 году впервые был очищен инфекционный агент скрэйпи из гомогената мозгов больных животных и была показана его белковая природа. При этом инфекционность удавалось инактивироватъ обработкой материала протеиназой К, мочевиной к другими хаотропными агентами, нарушающими структуру белков. Напротив, инфекционный агент оказался устойчивым к агентам, действующим на нуклеиновые кислоты: обработке нуклеазами, различными мутагенами и ультрафиолетовому облучению (Prusiner et al., 1982; Prusiner., 1982). С. Прузинер назвал этот агент прионом (prion - proteinaceous infections particle), а белок - PrP (Prion Protein). Очистка белка PrP и установление его структуры позволили идентифицировать ген Ргпр, кодирующий этот белок (Oesch et al, 1985). Было показано, что этот ген присутствует в геноме всех видов млекопитающих, а также у птиц. Нормальный PrP (РгРс) оказался мембранным белком, присутствующим в клетках независимо от прионной инфекции. Данный белок имел молекулярную массу 33-35 кДа и полностью деградировал при обработке протеиназой К. Белок идентичного размера (и аминокислотной последовательности) был найден в инфекционном материале (PrPSc), однако при обработке протеиназой К он превращался в белок с молекулярной массой 27-30 кДа (Prusiner et al, 1982), в котором отсутствовали 66 N-концевых аминокислот. Кроме того, PrPSc отличался от РгРС плохой растворимостью в детергентах и склонностью к агрегации (Prusiner et al., 1983; Oesch et al, 1985), которая и является причиной образования амилоидов в ткани мозга.

Все экспериментальные данные свидетельствуют о том, что прионная изоформа белка РгР отличается от нормальной только конформацей этого белка. Более детальное исследование показало, что эти конформации различаются уже по вторичной структуре. Так белок PrPSc имеет в основном р- складчатую структуру (50% (ї-слоев и 20% а-спиралей), в то время как в состоянии РгР этот белок обогащен а-спиральными участками (40% а-сшіралей) и практически не содержал р-слоев (Pan et al., 1993).

Таким образом, было установлено, что данный белок может находиться по крайней мере в двух различных конформационных состояниях (РгР и PrPL), четко разделяющихся биохимически (по устойчивости к протеазам и детергентам), а также по вторичной структуре. Основываясь на этих данных, С. Прузннер сформулировал прионную гипотезу, согласно которой, прионная (патогенная) форма белка PrPSc стимулирует конформацдониый переход из РтРс в PrPSc, что и обуславливает инфекционность прионного белка. Заболевание развивается при попадании в организм инфекционной формы РгР с извне (например, при потреблении в пищу мяса и, в особенности, мозга больных животных) или при спонтанном переходе белка РгРс в PrPSo. В некоторых случаях мутации в гене Ргпр приводят к увеличению вероятности этого перехода; такие особи имеют предрасположенность к прионной болезни (наследственная форма),

Суммируя вышесказанное, заметим, что прионная гипотеза предлагает совершенно новый механизм развития заболевания, в основу которого легли следующие положения: (1) передача заболевания осуществляется через "инфекционный белок" в отсутствие какой-либо нуклеиновой кислоты; (2) данный белок может находиться как минимум в двух конформациях с различными биологическими свойствами; (3) передача информации (в данном случае приводящей к развитию болезни) происходит посредством репликации (воспроизведения) белковой конформации. Первые два положения формально противоречат существовавшим до недавнего времени догмам молекулярной биологии, согласно которым носителем наследственной информации может быть только молекула нуклеиновой кислоты, и, соответственно, пространственная структура белка заложена в его первичной последовательности. Большое количество экспериментальных данных, v подтверждающих прионную гипотезу, корректируют эти догмы, делая их не столь абсолютными.

Существенный прогресс в исследовании прионов стал возможным после того, как была разработана удобная экспериментальная система, позволяющая проверять инфекционность имеющегося материала (в основном, гомогенатов мозга умерших животных). Система основана на использовании животных (мышей и хомячков), которым вводили предполагаемый инфекционный материал непосредственно в мозг и определяли развитие болезни (Prusmer et al., 1980а). Используя эту систему, С. Прузинер разработал несколько биохимических подходов по выделению и очистке прионного вещества из мозгов больных животных, основанных на плохой растворимости РгР с в детергентах и склонности этой формы к агрегации (Prusmer et al., 1978; Prusmer et al., 1980b). Решающим в понимании природы заболевания стало наблюдение, о том, что инфекционность всегда совыделялась с белком РгР; при этом, концентрация этого белка была пропорциональна инфекционному титру (Gabizon et al., 1988). Дальнейшая очистка этого белка до гомогенного состояния не приводила к уменьшению инфекционного титра. Более того, инфекционность уменьшалась практически до нуля при добавлении к очищенному материалу антител, специфичных к РгР (Gabizon et al., 1988).

Кроме этого, было зафиксировано существование специфических межвидовых барьеров передачи прионной инфекции. Так, например, мыши в большинстве случаев заболевали при введении им очищенного прионного вещества из больных мышей, однако были устойчивы к заражению прионами, выделенными из мозга хомячков. Этот факт, по-видимому, объясняется небольшим различием первичной структуры белка у разных организмов, что приводит к различию его конформации. Подобный межвидовой барьер наблюдается практически всегда, однако для некоторых случаев передача прионной инфекции все-таки происходит, хотя и с существенно пониженной эффективностью. Значительное количество таких случаев, к сожалению, было зафиксировано в Великобритании после эпидемии "коровьего бешенства". Среди людей, употреблявших в пищу мясо больных коров, было обнаружено несколько случаев так называемого "нового варианта болезни Крейцфельда-Якоба". Эту болезнь диагностировали как прионную, однако фиксируемые пато-морфологические изменения тканей мозга больше соответствовали не стандартному варианту Крейцфельда-Якоба, а прионной болезни

Дальнейший прогресс в изучении свойств прионов был связан с применением методов генетической инженерии и созданию трансгенных животных с измененным геном Ртр. Например, очень важным доказательством прионной концепции явился тот факт, что мыши с делецией гена Ртр были устойчивы к прионной инфекции и неспособны производить новые инфекционные частицы (Bueler et al., 1992; Prasiner et al., 1993). Это означало, что РгР необходим для развития инфекции. Кроме того, проведенные генетические исследования показали, что все известные случаи наследственной формы прионной болезни связаны с мутациями в гене Ргпр. Было продемонстрировано, что, вводя данные мутации в геном мышей, можно вызвать у них развитие заболевания, клинические симптомы которого неотличимы от соответствующих симптомов больных людей, в геноме которых присутствуют данные мутации (Hsiao et al., 1990). Таким образом, было показано, что все компоненты, необходимые для возникновения прионного заболевания, уже существуют у мышей. В пользу этого свидетельствует также тот факт, что трансгенных мышей, несущих ген РгР хомячка, легко удавалось заразить путем введения суспензии клеток мозга больного хомячка (Scott et al,, 1989), то есть межвидовой барьер обусловлен исключительно разницей в структуре гена Ргпр. ДНК-анализ показал, что устойчивость мышей к заражению прионами хомячка является результатом отличий в 16 из 254 аминокислотах первичной последовательности РгР (Scott et al., 1993), однако эти отличия приводят к существенному различию в третичной структуре этих белков.

Предполагаемая функция белка РгР. Может ли патологический эффект PrPSc объясняться инактивацией белка

Прионный белок РгР человека содержит 253 аминокислоты и экспрессируется в основном в клетках нервной системы. Он является мембранно-связанным белком, который локализуется в синапсах, в обогащенных холестеролом мшсродоменах плазматической мембраны, известных как кавеоли (Simons and Ehehalt, 2002). Было показано, что кавеоли содержат в высокой концентрации множество рецепторов и других сигнальных молекул и ответственны за передачу сигналов внутрь клетки. Поэтому предполагается, что РгР также может иметь сигнальную функцию.

РгР можно условно разбить на 2 домена [Рис, 3, по (Hetz et aL, 2003)]. С-концевой домен этого белка хорошо структурирован, содержит несколько а-спиральных участков (в форме РгРс), 2 сайта гликозилирования и дисульфидный S-S мостик. N-концевая часть белка неструктурирована у РгРс и содержит несколько стозпцих подряд аминокислотных повторов (PHGGGWGQ), которые принимают участие в образовании прионной формы белка (увеличение количества повторов приводит к повышению частоты возникновения болезни), а также кооперативно связывают ионы Си2+ и, в меньшей степени, ионы Zn2+ и Мп2+. По-видимому, РгР участвует в поддержании определенной концентрации этих ионов в тканях мозга, поскольку мыши с делецией гена Ргпр имеют пониженный уровень ионов Си + в мозге и повышенный в сыворотке крови (Brown et aL, 1997). По другим данным, снижение концентрации Си2+ при делеции гена Ргпр заметно проявляется только во время окислительного стресса (Sakudo et aL, 2004). Известно также, что прионное заболевание также приводит к дисбалансу концентраций Си2+; например, при возникновении спорадической болезни Крейцфельда-Якоба уровень Си2+ снижается в 2 раза (Wong et aL, 2001). Это означает, что неправильное сворачивание (фолдинг) РгР может приводить к нарушению гомеостаза ионов металлов в мозге, что в свою очередь, может приводить к повреждению нейронов (Brown, 2001).

Отметим, что недостаточная концентрация Си2+ может приводить к возникновению окислительного стресса, поскольку эти ионы обеспечивают работу супероксид-дисмутазы - ключевого фермента, защищающего клетки от повреждения свободными радикалами. Поэтому отсутствие РгР или его неправильный фолдинг могут приводить к накоплению свободных радикалов в нервных клетках и к их аполтозу. Более того, прионный белок сам имеет слабую супероксид-дисмутазную активность in vitro (Brown et aL, 1999), которая зависит от связывания ионов меди N-концевыми повторами в белке. Взаимодействие между PrPSc и РгРс ингибирует супероксид-дисмутазную активность. Кроме того, в недавней работе (McMahon et aL, 2001) было показано, что в присутствии свободных радикалов РгР подвергается Си2+-зависимому расщеплению вблизи N-концевых повторов. Это приводит к образованию С-концевой части белка РгР, которая, как предполагают, выполняет сигнальные функции в клетке. Все эти факты подтверждают роль РгР в процессах защиты клеток от окислительного стресса.

Совсем недавно было установлено, что РгР может играть роль Б защите клеток от апоптоза, индуцируемого различными стрессами. Было найдено несколько партнеров РгР в этом процессе. Одним из них является стресс-индуцируемый белок 1 (STI1), взаимодействующий с РгР на плазматической мембране. Это взаимодействие защищает нейроны от анисомицин-индуцироемого апоптоза (Zanata et al., 2002). При дальнейшем изучении этого явления оказалось, что в зависимости от характера этого взаимодействия: оно может приводить к активации двух различных сигнальных путей, действующих пройди анти — апоптотически (Chiarini et al., 2002). Другими словами, состояние белка РгР определяет баланс между про- и анти- апоптотическими сигналами. Подтверждая свои выводы, исследователи показали, что клетки нейронов с делецией гена Ртр более чувствительны к апоптозу, вызванному уменьшением питательных стимулов (Kuwahara et al., 1999).

Еще одним указанием на возможную антиапоптотическую роль РгР в клетках является наблюдение о том, что РгР взаимодействует с Вс1-2 - одним из основных антиапоптотических белков в клетке. Это взаимодействие было показано при помощи дрожжевой двухгибридной системы, а также ко-иммунопреципитадией (Boimhar et al,, 2001). Кроме того, консервативные N-концевые повторы в белке РгР гомологичны ВН2 домену, общему для всех белков семейства Вс1-2. Бъшо показано, что сверхэкспрессия Вс1-2 спасает нейроны от апоптоза, индуцируемого делецией гена Prnp (Kuwahara et al., 1999). Дополнительное свидетельство принадлежности РгР к антиапоптотическому семейству найдено в экспериментах (Bounhar et al, 2001), показавших, что РгРс защищает нейроны от Вах-индуцируемого апоптоза, что ранее было зафиксировано для Вс1-2. Этот эффект не наблюдали для РгР, несущего мутации, ассоциированные с прионной болезнью.

Все вышеперечисленные факты показывают, что РгР играет важную роль в организме млекопитающих, поэтому изменение его конформации вследствие перехода белка в прионное состояние может существенно повлиять на клеточные процессы и привезти к развитию нейродегениративного заболевания. Несмотря на то, что мыши с делецией гена Ртр не содержат явно выраженных признаков дегенерации мозговой ткани, более тонкий анализ позволил найти биохимические отличия по сравнению с мышами дикого типа. Клетки мозга таких мышей были гиперчувствительны к окислительному стрессу, в них наблюдали повышенный уровень дисмутазы, NF-kB и про-апоптотических белков, а также уменьшенный уровень р53 (Brown et al., 2002).

Суммируя сказанное, можно предположить, что токсический эффект, наблюдаемый при прионном заболевании и выраженный в дегенерации мозговой ткани, может быть объяснен двумя причинами: накоплением агрегатов PrPSc в тканях мозга и потерей защитной функции белка РгРс при переходе в пршнное состояние. Наличие агрегатов PrPSc приводит к нарушению нормальной передачи сигнала через синапсы, а также к другим морфологическим изменениям, в то время как потеря функции РгР проявляется в повышенной частоте гибели нейронов.

У дрожжей S. cerevisiae, как и у других живых организмов, подавляющее большинство наследственной информации содержится в хромосомах. Однако, по мере развития дрожжевой генетики, было обнаружено, что некоторые признаки у дрожжей наследуются нехромосомно. Как правило, большинство таких признаков все равно определяются генетической информацией, закодированной в нуклеиновых кислотах митохондрий;, пластид или вирусов. Вместе с этим, по крайней мере два описанных наследуемых фактора, или, более правильно, детерминанта, обозначаемых [PSf] и [URE3], выбиваются из этого ряда. Наследование этих детерминантов, определяющих характерные для них фенотипы, не связано с какой-либо нуклеиновой кислотой, принадлежащей плазмидам, вирусам или митохондриям (Tuite et al., 1982; Сох et al., 1988). Необычность их свойств долгое время оставалась совершенно непонятной. Только в 1994 г. Р. Викнер высказал гипотезу, которая не противоречила экспериментальным данным, накопившимся к тому времени (Wickner, 1994). Она связывает детерминанты с существованием определенных белков в клетке, которые по своим свойствам сходны с прионами млекопитающих.

Детерминант [PSf] был изначально описан как цитоплазматически наследуемый фактор, приводящий к увеличению эффективности прочтения (то есть супрессии) всех трех нонсенс-кодонов (Сох, 1965). Повышенный уровень прочтения нонсенс-кодонов может быть легко определен генетическими методами. Цитоплазматическое наследование этого детерминанта тестировали следующим образом: при скрещивании штамма дрожжей с детерминатом [PSf \ со штаммом без этого детерминанта (обозначаемый \psi J) и последующем мейозе все 4 образовавшиеся гаплоидные клетки дрожжей содержали детерминант [Р5Ґ], в отличие от хромосомных мутаций, дающих в этом тесте расщепление 2:2. При этом детерминант [PSt] обладал способностью спонтанно появляться и исчезать с достаточно высокой частотой (большей, чем частота генных мутаций). Таким образом, эти факты четко отличают [P.S74"] от хромосомных мутаций.

Молекулярная природа детерминанта [Р5Ґ]: прионный переход белка Sup35...

Белок Sup35 состоит из трех доменов (Kushnirov et al., 1988), представляющих собой отдельные функциональные блоки (Рис. 4) (Ter-Avanesyan et al., 1993; Тег-Avanesyan et al., 1994).

С-концевой домен (С) Sup35 структурно сходен с фактором элонгации трансляции eEF-lA и необходим для жизни дрожжевой клетки. N-кошевая область белка несущественна для жизнеспособности и может быть подразделена на собственно N-концевой (N, первые 123 а.к.) домен и средний (М) домен (124 а.к.-253 а.к.), отличающиеся друг от друга по аминокислотному составу и типу предсказываемой вторичной структуры (Рис.4). N- домен имеет в своем составе последовательности, способные образовывать вторичную структуру с обилием [і-слоев. Аминокислотный состав N- домена довольно необычен: он содержит 27% Gin, 18% Asp, 17% Туг, 17% Gly. Домен М богат заряженными аминокислотами - Lys и Glu - вместе составляющими около 35%. Почти на всей ее длине предсказывается а- спиральная структура. Вероятнее всего этот домен играет роль вспомогательного разделительного домена между двумя значимыми N- и С- доменами.

Белок Sup35 является фактором терминации трансляции eRF3 у дрожжей S. cerevisiae. Выполнение этой функции целиком и полностью осуществляется С-доменом Sup35, что и обуславливает фенотип детерминанта [PSf] (Ter-Avanesyan et al., 1993; Stansfield et al., 1995Ъ). Высокая консервативность функционального С-домена этого белка позволяет предположить, что он выполняет схожую функцию и в других организмах (Frolova et al., 1994). Однако его N- концевая часть не консервативна. Добавим, что уровень экспрессии Sup 35 примерно постоянен на протяжении всего жизненного цикла дрожжевой клетки.

Все имеющиеся экспериментальные данные говорят о том, что N-домен белка Sup35 необходим и достаточен поддержания детерминанта [РІЇҐ]. Частичная или полная делеция N- домена приводит к утрате [PSf]; вместе с тем, гаплоидные штаммы дрожжей, которые несут хромосомную аллель SUP35, кодирующую белок, укороченный с N-конца, и одновременно содержат плазмиду с аллелью SUP35, кодирущую домен N белка Sup35, способны поддерживать детерминант [PSf] (Ter-Avanesyan et al., 1994). Вывод о важности N- домена Sup35 для поддержания [PSf] подтверждается также наблюдением, что все известные на сегодняшний день точковые мутации, вызывающие элиминацию [PSf], локализуются в этом домене Snp35 (Doel et al., 1994; DePace et al., 1998). Кроме того, мультикопийные шгазмиды, несущие аллели, которые кодируют только N- домен Sup35, эффективно вызывают образование [PSf] de novo (Derkatch et al., 1996; Patino et al., 1996).

Следует также отметить существование 6 стоящих подряд аминокислотных повторов (блоков) в N-домене белка Sup35 (PQGGYQQYN), Было показано, что увеличение количества этих повторов приводит к увеличению частоты возникновения [PSf% что делает их похожими на повторы в прионном белке млекопитающих РгР (п. 1.5.1.). Кроме того, эти повторы играют важную роль в поддержании и наследовании [PSf], что отличает их от повторов внутри РгР.

Таким образом, совокупность полученных данных свидетельствует о том, что Sup35 содержит два важных для функционирования участка: N-домен отвечает за поддержание [PSf], а С- домен отвечает за функциональность белка как фактора терминации трансляции.

Согласно работе Р. Викнера (Wickner, 1994), все необычные свойства детерминанта [PSf] (равно как и двух других детерминантов) легко объясняются, если предположить, что Sup35 является прионным белком S. cerevisiae. В таком случае для него верны постулаты прионной гипотезы, сформулированные для РгР (п. 1.2.): Sup35 обладает несколькими конформациями с различными биологическими свойствами, а передача информации (в данном случае речь идет о наследуемой информации, выраженной в наличии детерминанта {PSf}) происходит посредством воспроизведения белковой конформации в ряду клеточных поколений. В отличие от РгР, экспериментальные данные указывают на то, что прионной конформационной перестройке подвергается, по-видимому, только N-концевой домен Sup35. Поэтому далее он часто будет упоминаться как "прионный" домен Sup35.

Ниже мы продемонстрируем, каким образом из прионной гипотезы вытекают свойства [Р8Ґ], а также приведем убедительные доказательства этой гипотезы, полученные в последнее время.

Одним из удивительных свойств детерминанта [PS1/1-] является обратимость его потери: он может возникать de novo с достаточно высокой частотой у штаммов дрожжей, потерявших [Р/+]. Эта особенность плохо объясняется гипотезами, подразумевающими присутствие в штаммах автономного генома. Прионная гипотеза легко объясняет этот факт: клетка, лишившаяся детерминанта,, теряет способность поддерживать прионную конформацию соответствующего белка, а значит, если такая потеря не была связана с мутациями в гене SUP35, то белок, кодируемый этим геном, может с какой-то вероятностью вновь перейти в прионную форму.

Доминантный характер наследования детерминанта [РБҐ] (и связанный с ним цитоплазматический тип наследования) также легко объясняется прионной гипотезой. При спаривании клеток дрожжей, одна из которых имеет [PSf] (прионную форму Sup35), а другая лишена его, происходит смешивание цитоплазмы. При этом белок в прионной форме передает свою необычную конформацию нормальной изоформе белка гибридной клетки, что приводит к образованию фенотипа, характерного для [РБҐ],

Подобно тому, как делеция Ргпр ведет за собой потерю РгР с у млекопитающих, делеция 5 -концевого района гена SUP35 приводит к потере детерминанта [Р8Ґ], поскольку такие мутанты не синтезируют белки, подверженные конформационной перестройке. Напротив, повышение концентрации белка Sup35 в клетках дрожжей увеличивает частоту индукции состояния [PSf], поскольку с увеличением количества молекул, подверженных перестройке, растет вероятность того, что какая-либо из них спонтанно изменит конформацию.

Проведенные в нашей лаборатории биохимические исследования показали, что в клетках [PSt] белок Sup35 находится в агрегированной и протеазоустойчивой форме, что характерно и для прионной формы PrPSc (Paushkin et al., 1996). Это удалось показать при помощи ультрацентрифугирования лизата клеток [PSf] и \psi ] в линейном градиенте сахарозы, а также обработки этих лизатов протеиназой К.

Влияние шаперонов на прионный переход PrP in vitro a in vivo

Дрожжевой белок Hsp 104 является шапероном из семейства Hsp 100. До недавнего времени он оставался единственным известным белком, принимающим участие в поддержании дрожжевых прионов. Делеция гена HSP104, кодирующего этот белок, приводит к исчезновению как детерминанта [PSZ ], так и [URE3] (Chemoff et aL, 1995; Moriyama et al., 2000). Кроме того, было показано, что избыток этого шаперона также может приводить либо к потере [Р$Ґ \, либо к ослаблению супрессорного фенотипа, вызываемого этим детерминантом (Chemoff et al., 1995), то есть для поддержания [РІЇҐ] необходим оптимальный уровень экспрессии Hspl04.

Для объяснения этого необычного эффекта были предложены две альтернативные гипотезы. Согласно первой из них (Kushnirov and Ter-Avanesyan, 1998), функция Hsp 104 заключается в дроблении приониых фибрилл Sup35 (из крупных фибрилл получаются мелкие, которые затем эффективно разрушаются до мономеров с помощью Hsp70/Hsp40). Поэтому сверхэкспрессия данного белка приводит потере прионного детерминанта из-за активного "растворения" прионных агрегатов. Делеция данного белка приводит к потере детерминанта по другой причине. Прекращение дробления агрегатов приводит к тому, что в клетке вместо многих мелких возникает один или несколько крупных агрегатов. При этом при делении клетки крупные агрегаты наследуются гораздо хуже мелких, то есть с большей вероятностью остаются в материнской клетке, а не переходят в дочернюю. Это быстро приводит к образованию большого количества клеток, свободных от прионной формы Sup35 (а следовательно и от [РІЇҐ]). Недавно эта модель получила несколько экспериментальных подтверждений (Wegrzyn et al., 2001), в том числе и в экспериментальной части нашей работы.

Согласно второй гипотезе (Lindquist et al., 1995), Hspl04 участвует в процессе полимеризации (то есть присоединению мономера Sup35 к растущему полимеру). Считается, что Hsp 104 взаимодействует с мономером Sup35 и помогает ему принять определенную промежуточную конформацию, которая затем эффективно переходит в прионную конформацию после присоединения к полимеру. Несмотря на то, что эта модель согласуется с рядом экспериментальных данных (Narayanan et al., 2003), она не может полностью объяснить все имеющиеся факты (что будет ясно из Результатов и Дискуссии), поэтому в дальнейшем в качестве рабочей гипотезы будет выступать первая из них (Kushnirov and Ter-Avanesyan, 1998).

До недавнего времени оставался загадкой механизм действия низкомолекулярного соединения GuHCl на дрожжевые прионы. Напомним, что добавление 3-5 мМ GuHCl в среду для роста дрожжей эффективно элиминирует как [РБҐ], так и [URE3]. Поскольку оба эти детерминанта пропадали также при делеции гена HSP104 в клетках дрожжей, была высказана гипотеза о том, что GuHCl специфически ингибирует активность Hspl04. Недавно эта гипотеза получила убедительные подтверждения. Во-первых, было обнаружено, что обработка клеток GuHCl приводит in vivo к тем же последствиям, что и инактивация Hspl04 (Ferreira et al., 2001; Jung and Masison, 2001), В присутствии 3-5 мМ GuHCl клетки дрожжей оказались неспособны приобрести термотолерантность в ответ на умеренный тепловой стресс, а таюке были неспособны произвести сворачивание (фолдинг) денатурированной люциферазы в модельной системе in vivo (Parsell et al.s 1994). Во-вторых, была найдена точковая мутация в гене HSP104 (D184Y), приводящая к тому, что детерминант [Р$Ґ] становился существенно более устойчивым к действию GuHCl (Jung et al., 2002). Существование такой мутации означает, что белок Hspl04 является одной из главных мишеней действия GuHCl (если не единственной). Окончательное подтверждение этого факта было получено при исследовании свойств Hspl04 in vitro. Оказалось, что 3-5 мМ GuHCl специфически ингибируют АТФ-азную активность Hspl04, уменьшая ее до 35% от нормы (Griraminger et al., 2003). Кроме того, ионы гуанидина взаимодействуют с комплексом Hspl04-ATO, стимулируя стабильность этого комплекса.

Недавно было показано, что сверхэкспрессия двух дрожжевых шаперонов из семейства Hsp70 (Ssal и Ssbl) влияет на уровень элиминации [РЯҐ] под действием сверхэкспрессированого гена HSP104 (Chernoff et al., 1999; Newnam et al., 1999). Однако прямого влияния Ssal и Ssbl (без Hspl04) на стабильность {PSt\ замечено не было.

Обнаружение Hspl04 как ключевого белка, участвующего в поддержании дрожжевых прионов указывает на важную роль шаперонов в процессе прионной конверсии, а также служит еще одним доказательством белковой природы [PSP].

В работе (DebButman et al., 1997) был смоделирован прионный переход РгР PrPSc in vitro и изучено влияние на этот процесс шаперонов разных семейств. Чтобы увеличить скорость конверсии, к очищенному РгР добавляли очищенный прионный материал, выделенный из мозга инфицированных животных, содержащий в основном PrPSc, Далее в реакцию добавляли наработанные в Е. coli шапероны различных классов и последовали их влияние на кинетику прионного перехода. Оказалось, что из всех исследованных белков только шаиероны GroEL (Hsp60 из Е. соН) и Hspl04 (HsplOO из S. cerevisiae) оказывали существенное воздействие, и в обоих случаях это было ускорение прионного перехода. Эффект Hspl04 становится понятен в рамках модели действия этого шаперона, сформулированной ранее в Разделе 3.2.. По-видимому, Hspl04 дробит (фрагментирует) полученные прионные фибриллы, увеличивая концентрацию доступных для мономеров РгР концов фибрилл, тем самым ускоряя процесс полимеризации. Для объяснения эффектов GroEL авторы предложили следующее объяснение: GroEL взаимодействует с мономерами РгРс, дестабилизируя их конформациго, при этом получаются молекулы РгРшт (промежуточные по своей конформации), которые затем легче конвертируются в PrPSo3 чем исходные молекулы РгРс. Эти рассуждения подтверждаются данными по кинетике прионного перехода, полученными теми же авторами. Кроме того, был установлен факт специфического взаимодействия РгРс и НврбО в двухгибридной (two-hibrid) дрожжевой системе (Edenhofer et al., 1996).

Кроме того, в нескольких работах было исследовано влияние на прионный переход так называемых химических шаперонов (агентов, стабилизирующих белок в нативной конформации). К ним относятся глицерол, DMSO и другие химические соединения. Оказалось, что в некоторых случаях эти агенты ингибируют образование PrPSc (Tatzelt et al., 1996; DebBurman et al., 1997), Авторы предполагают, что химические шапероны стабилизируют а-спиральную конформацию РгРс: и тем самым препятствуют образованию молекул РгР (с промежуточной конформацией, служащих материалом для реакции конверсии в PrPSe),

В последнее время появились данные о том, что для существования эффективного процесса конверсии PrPc PrPSc in yivo требуются некоторые клеточные белки-шапероны (Welch and Gambetti, 1998; Saborio et al., 1999). Кроме того, предполагается участие шаперонов в патогенезе множества амилоидных болезней (болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона), которые характеризуются накоплением в мозгу больного упорядоченных белковых агрегатов, сходных по своей морфологии с прионными агрегатами. Возникновение этих заболеваний по-видимому связано со снижением уровня активности шаперонов, вызванного, например, возрастом пациента (Soti and Csermely, 2003). Поэтому уже сейчас шапероны, а также вещества, регулирующие их активность, рассматривают как потенциальное средство для лечения этих и многих других "болезней фолдинга", опираясь на результаты молекулярных исследований (Chai et al,, 1999; Warrick et al., 1999; Yoo et al., 2001).

В течение длительного времени все известные проявления прионного феномена были связаны с одним лишь белком РгР. Интерес к изучению прионов в основном объяснялся патологией, которую они вызывают у человека и других млекопитающих. Однако по мере изучения молекулярных механизмов этого явления были выявлены и фундаментальные аспекты проблемы. Открытие прионов позволило обнаружить существование нового типа наследственности - белковой наследственности. Этот факт не опровергает центральную догму молекулярной биологии, а, скорее дополняет ее, подчеркивая всю сложность процессов, связанных с переносом генетического материала. Кроме того, прионная гипотеза постулирует возможность существования у белка нескольких стабильных конформаций с разными биологическими свойствами, что уже подтверждено многочисленными экспериментальными фактами.

Обнаружение прионных белков у низших эукариот существенным образом расширило представления о прионах. Стало ясно, что это не просто принципиально новое, но и достаточно общее явление, встречающееся у различных организмов. При этом у дрожжей и грибов существование белков с прионными свойствами может иметь адаптивное значение. Поэтому подобные белки возможно распространены более широко, чем известно сейчас,

Прионы дрожжей явились весьма удобной модельной системой для изучения прионного явления в целом. Они имеют неоспоримые преимущества перед животными системами по скорости постановки экспериментов, доступности и безопасности для исследователей. Эти преимущества предопределили быстрый прогресс в исследовании прионов дрожжей и, несомненно, сыграют значительную роль в изучении молекулярных механизмов прионного превращения белков, а также в исследовании распространенности и биологического значения прионного феномена. Можно надеяться, что какая-либо дрожжевая система может быть использована в будущем для исследования возможных прионных свойств белков - кандидатов на роль патогенов, вызывающих прионные или амилоидные заболевания человека и животных, а также для проверки химических соединений, предлагаемых на роль лекарственных средств от этих болезней. Первые успешные работы такого рода уже опубликованы (Bach et al.s 2003).

Целью нашей работы было дальнейшее изучение молекулярных механизмов репликации прионных детерминантов в дрожжах S. cerevisiae. Мы сфокусировались на генетическом контроле репликации детерминантов [PJST1"] и \PStps\ и провели поиск дрожжевых белков, влияющих на поддержание этих детерминатов. Механизмы, контролирующие процесс наследования прионов, могут представлять большой интерес как для фундаментальной биологии, так и для медицины. Кроме того, для более углубленного изучения этих механизмов представлялась необходимой разработка нового методического подхода, позволяющего получить информацию о структурной организации прнонвых агегатов в клетках дрожжей и механизмах действия "антиприонных" факторов. В связи с этим в нашей работе были поставлены следующие основные задачи: