Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae Фоминов Глеб Вадимович

Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae
<
Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae
>

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Фоминов Глеб Вадимович. Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.15 Москва, 2006 147 с. РГБ ОД, 61:06-3/564

Содержание к диссертации

Введение

1. Введение: структура и функции клеточной стенки 10

2. Синтез глюканов клеточной стенки 13

2.1. Синтез Р-1,3-глюканов клеточной стенки 13

2.1.1. Р-1,3-глюкансинтетаза 13

2.1.2. Ген HKR1 15

2.1.3. Семейство генов, родственных GAS1 16

2.1.4. Семейство генов, родственных BGL2 18

2.2. Синтез р-1,6-глюканов 20

2.2.1. Ген KRE5 21

2.2.2. Ген BIG1 21

2.2.3. CWH41IGLS1, ROT2IGLS2 и некоторые другие гены, кодирующие белки, участвующие в синтезе N-связанных гликанов и сворачивании секретируемых белков 22

2.2.4. Гомологичные гены KRE6 и SKN1 24

2.2.5. Ген KRE11ITRS65 25

2.2.6. Ген KRE1 26

2.2.7.renbiKRE9uKNHl 26

3. Синтез хитина клеточной стенки 27

З.І.ХитинсинтетазаІ 28

3.2. Хитинсинтетаза II 28

3.3. Хитинсинтетаза Ш 28

4. Синтез -связанных гликанов секретируемых белков 29

4.1. Формирование коровой части 29

4.2. Реакции, протекающие в комплексе Гольджи: формирование «внешних цепей» или «зрелого кора» 32

5. Синтез 0-связанных гликанов секретируемых белков 35

6. Формирование гликозилфосфатидилинозитного (GPI) якоря 36

6.1. Структура GPI якоря 36

6.2. Формирование GPI якоря и его присоединение к белку 36

6.3. События, следующие за присоединением GPI якоря к белку 42

6.3.1. Деацилирование GPI 42

6.3.2. Модификация липидной составляющей GPI якоря 43

6.3.3. Добавление пятого остатка маннозы 43

6.3.4. Встраивание некоторых белков, несших GPI якорь, в КС 43

7. Сворачивание секретируемых белков 43

7.1. Связанная с ЭР деградация неправильно свернутых белков (ERAD, endoplasmic reticulum associated degradation) 44

7.2. Ответ клетки на накопление в ЭР неправильно свернутых белков (UPR,

unfolded protein response) 47

7.3. Роль ионов кальция в сворачивании секретируемых белков 49

8. Заключение, постановка задач исследования 50

Экспериментальная часть 52

1. Материалы и методы 52

1.1. Штаммы, среды, условия культивирования и стандартные генетические методы 52

1.2. Поиск мутаций, летальных в комбинации с мутацией ssu21 56

1.3. Плазмиды и генно-инженерные манипуляции 58

1.4. Флюоресцентная микроскопия 67

1.4.1. Окрашивание вакуолей в клетках дрожжей 67

1.4.2. Окрашивание ДНК клеток дрожжей с помощью DAPI 68

1.4.3 Флюоресценция химерных белков, содержащих в своем составе EGFP 68

1.4.4 Окрашивание хитина клеточных стенок дрожжей калькофлюором белым 68

1.5. Измерение активности р-галактозидазы в лизатах клеток дрожжей 69

2. Результаты исследования 70

2.1. Клонирование и секвенирование мутантной аллели ssu21 70

2.2. Гены, мутации в которых летальны или полулетальны в комбинации с мутацией ssu21 73

2.2.1. Поиск мутаций, летальных в комбинации с мутацией ssu21 73

2.2.2. Клонирование генов дикого типа, соответствующих мутантным аллелям dcsl ndcs2 77

2.2.3. Локализация белка Gwtlp 81

2.3. Чувствительность мутанта$5^2/ к кофеину 85

2.3.1. Чувствительность к кофеину у разных мутантовmcd4 85

2.3.2. Морфология вакуолей в клетках мутантаssu21 85

2.3.3. Чувствительность к кофеину мутанта ssu21 не связана с подавлением активности фосфодиэстераз, гидролизующих сАМР, и ослаблением КС... 86

2.3.4. Клонирование генов, способных в мультикопийном состоянии подавлять чувствительность мутантаssu21 к кофеину 89

2.3.5. Способность некоторых клонированных генов супрессировать другие фенотипические проявления мутации ssu21 91

2.3.6. Влияние мутации ssu21 на уровень экспрессии гена UBI4 92

3. Обсуждение результатов 94

Выводы 102

Список литературы

Введение к работе

В настоящее время дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются одним из наиболее популярных объектов молекулярных биологов. Это связано, во-первых, с тем, что при изучении их клеток легко применимы методы как классической, так и молекулярной генетики. Во-вторых, на сегодняшний день расшифрована последовательность всех генов дрожжей, что существенно упрощает работу. В-третьих, дрожжи обладают очень высокой скоростью роста, что ускоряет проведение экспериментов. Кроме того, для выращивания дрожжей можно использовать относительно простые по составу и недорогие среды. Стоит также отметить, что, поскольку дрожжи являются представителями одноклеточных эукариот, многие данные, полученные при использовании этого модельного объекта, могут быть экстраполированы на клетки высших эукариот.

Клетки всех эукариот и некоторых архебактерий способны синтезировать гликозилфосфатидилинозит (GPI). При этом структура GPI якоря, связывающего некоторые белки с мембраной (см. Обзор литературы), имеет много общих черт у дрожжей и млекопитающих, что, как было упомянуто выше, позволяет использовать данные, полученные при работе с клетками дрожжей, при изучении клеток высших эукариот. В тоже время, выявление особенностей синтеза GPI, свойственных только клеткам дрожжей, делает возможным разработку антигрибковых лекарственных препаратов, мишенями которых являются реакции, специфичные для клеток грибов.

Данная работа посвящена изучению взаимосвязи формирования GPI с другими процессами, протекающими в клетках дрожжей, такими, как биогенез клеточной стенки и сворачивание секретируемых белков. Ранее в нашей лаборатории был получен штамм, несущий мутацию ssu21 в гене MCD4 (Packeiser et al., 1999). Эта мутация приводит к нарушению синтеза GPI (Imhof et al., 2004), однако, кроме этого она обладает фенотипическими проявлениями, не связанными очевидным образом с нарушением синтеза гликозилфосфатидилинозита, такими, например, как чувствительность к кофеину и пониженному содержанию ионов кальция в среде (Packeiser et al., 1999). Это позволило предположить наличие у белка Mcd4p дополнительных функций. Таким образом, целью данной работы было прояснение физиологической роли белка Mcd4p, в связи с чем представлялось интересным выявить гены, функционально связанные с геном MCD4, и выяснить причины возникновения у мутации ssu21 в гене MCD4 фенотипических проявлений, не связанных явным образом с нарушением синтеза GPI.

Р-1,3-глюканов клеточной стенки

Несмотря на интенсивные исследования, полная картина того, как осуществляется синтез глюканов и их встраивание в КС дрожжей, не ясна. Особенно это относится к образованию р-1,6-глкжанов (см. ниже). В данном обзоре будут рассмотрены лишь некоторые белки, участвующие в синтезе глюканов и/или их встраивании в КС. В ряде случаев до сих пор остается невыясненным участвуют ли указанные белки в синтезе глюканов напрямую или лишь косвенным образом.

Синтез р-1,3-глюканов клеточной стенки

Как было упомянуто выше, глюканы этого типа выполняют в КС основную структурную функцию. Ниже будут рассмотрены наиболее изученные белки, тем или иным образом участвующие в синтезе р-1,3-глюканов. 2.1.1. Р-1,3-глюкансинтетаза

Синтез Р-1,3-глюканов осуществляется связанным с мембраной мультисубъединичным белковым комплексом, называемым р-1,3-глюкансинтетазой. Этот фермент образует из UDP-глюкозы линейные цепи, состоящие из остатков глюкозы, соединенных Р-1,3 связями (см. обзор Orlean, 1997). К настоящему времени описано несколько субъединиц, участвующих в формировании глюкансинтетазного комплекса.

Rholp, являющийся ГТФазой Rho-типа, выполняет, по-видимому, роль регуляторной субъединицы глюкансинтетазного комплекса (Drgonova et al., 1996; Qadota et al., 1996; Mazur and Baginsky, 1996). Интересно отметить также, что Rholp, связанный с GTP, принимает участие в активации дрожжевой протеинкиназы С, кодируемой геном РКС1 (Kamada et al., 1996).

Кроме того, описаны две альтернативные каталитические субъединицы, участвующие в формировании глюкансинтетазного комплекса. Одну из них кодирует ген FKS1 (Douglas et al., 1994; Eng et al., 1994; Castro et al., 1995), а другую - ген FKS2 (Mazur et al, 1995).

Продукты обоих генов, по-видимому, представляют собой белки, имеющие, по 16 трансмембранных доменов. N-концы обоих белков расположены с цитоплазматической стороны мембраны (Mazur et al., 1995; Douglas et al., 1994). В геноме Saccharomyces cerevisiae существует еще одна последовательность, гомологичная генам FKS1 и FKS2. Она может кодировать белковый продукт, имеющий на один трансмембранный домен больше, чем Fkslp и Fks2p. Этот домен расположен между трансмембранными участками, соответствующими 14-ому и 15-ому трансмембранным доменам белков Fkslp и Fks2p (Mazur et al., 1995).

Уровень транскрипции гена FKS1 зависит от фазы клеточного цикла (Ram et al., 1995; Igual et al., 1996; Mazur et al., 1995). В клетках, растущих на среде, содержащей глюкозу, большая часть (3-1,3-глюканов, по-видимому, образуется глюкансинтетазным комплексом, имеющим в своем составе каталитическую субъединицу Fkslp.

Транскрипция гена FKS2 усиливается в ответ на действие феромона, выделяемого штаммом противоположного типа спаривания, на повышение концентрации ионов кальция, на повышение температуры до 39С, при культивировании дрожжей на некоторых средах, не содержащих глюкозу, при переходе к стационарной фазе роста, а, кроме того, в отсутствие работающего продукта гена FKS1 (например, в штамме с делецией гена FKS1) (Mazur et al., 1995; Zhao etal., 1998).

Штаммы, несущие одновременно делеции обоих генов FKS1 и FKS2, нежизнеспособны (Mazur et al., 1995).

Интересно отметить, что клетки дрожжей, по-видимому, обладают способностью модулировать активность глюкансинтетазного комплекса в зависимости от состояния клеточной стенки. Многие мутации (такие как cwh41, gasl, Jksl и др.), в генах, контролирующих формирование клеточной стенки, а также обработка клеток 0.005% SDS, по-видимому, приводят к повышению соотношения GTP-связанный Rholp/GDP-связанный Rholp (Bickle et al, 1998), тем самым, влияя на активность глюкансинтетазного комплекса как минимум двумя способами. Rholp, связанный с GTP, во-первых, как уже было упомянуто выше, непосредственно активирует глюкансинтетазный комплекс, а во-вторых, способен активировать протеинкиназу С, и соответствующий сигнальный путь, позитивно регулирующий транскрипцию FKS2 (Zhao et al., 1998), а возможно и FKS1 (Igual et al., 1996).

Интересно отметить, что HOG сигнальный путь также, по-видимому, может регулировать работу р-1,3-глюкансинтетазного комплекса (Lai et al., 1997). Рассмотрим также некоторые другие гены, тем или иным образом связанные с синтезом р-1,3-глюканов. 2.1.2. Ген HKR1

HKR1, жизненно важный для клеток дрожжей, был клонирован как ген, сверхэкспрессия которого обеспечивает устойчивость к киллерному токсину НМ1 из Hansenula mrakii (Kasahara et al., 1994). Негативное воздействие на клетки S. cerevisiae токсина HMl, по крайней мере, отчасти определяется его способностью ингибировать активность Р-1,3-глюкансинтетазного комплекса. Чувствительными к этому токсину являются почкующиеся или формирующие конъюгационные трубки клетки дрожжей (Takasukaetal., 1995).

HKR1 кодирует белок, предположительно локализованный в плазматической мембране и содержащий один трансмембранный домен. Этот белок обогащен серином и треонином, являющимися потенциальными сайтами для О-гликозилирования. С-концевой домен, расположенный в цитоплазме, содержит Са2+ связывающий мотив. Сверхэкспрессии одного только З -концевого участка гена HKR1, кодирующего С-концевую часть Hkrlp, достаточно для обеспечения устойчивости к токсину НМ1, причем эффект оказывается даже более сильным, чем в случае сверхэкспрессии полноразмерного гена HKR1 (Kasahara et al., 1994; Yabe et al., 1996).

Синтез -связанных гликанов секретируемых белков

Можно выделить два этапа синтеза Л/-связанных гликанов секретируемых белков. Во-первых, это формирование коровой части, которое осуществляется в ЭР, а во-вторых, последовательность реакций, протекающих в комплексе Гольджи и приводящих к дальнейшему усложнению связанного с белком корового олигосахарида. 4.1. Формирование коровой части

Формирование коровой части гликанов, связанных с некоторыми остатками Asn секретируемых белков, происходит в два этапа. Сначала синтезируется олигосахарид, связанный с долихилпирофосфатом, а затем он целиком переносится на остаток Asn белка. Донорами остатков Сахаров для реакций, протекающих в цитозоле, являются UDP-iV-ацетилглюкозамин и GDP-манноза, а для реакций, протекающих в просвете ЭР, - связанные с долихилфосфатом остатки маннозы и глюкозы (см. обзор Burda and Aebi, 1999). Ниже будут рассмотрены основные реакции, приводящие к формированию iV-связанного олигосахарида, и ферменты их катализирующие.

Биосинтез олигосахарида, связанного с долихилпирофосфатом, начинается на обращенной к цитозолю стороне мембраны ЭР с переноса iV-ацетилглюкозаминфосфата на долихилфосфат. Белок Alg7p, участвующий в осуществлении этой реакции, является мишенью туникамицина, вещества ингибирующего формирование -связанных олигосахаридов секретируемых белков в клетках дрожжей (Rine et al., 1983; Barnes et al., 1984; см. обзор Burda and Aebi, 1999).

Второй этап, присоединение остатка JV-ацетилглюкозамина связью Р-1,4, по-видимому, осуществляется при участии белков Ygl047wp и Ybr070cp (Chantret et al., 2005).

Белок Alglp участвует в присоединении первого остатка маннозы связью Р-1,4 (Huffaker and Robbins, 1982; Albright and Robbins, 1990; Couto et al., 1984; см. обзор Burda and Aebi, 1999).

У мутантов по гену ALG2 накапливаются олигосахариды, связанные с долихилпирофосфатом, содержащие, кроме остатков iV-ацетилглюкозамина, 1 или 2 остатка маннозы, однако точная биохимическая функция белка Alg2p до сих пор не выявлена (Huffaker and Robbins, 1983; Jackson et al., 1989; Jackson et al., 1993; см. обзор Burda and Aebi, 1999).

Белок Algllp, по-видимому, участвует в присоединении 5-ого остатка маннозы связью а-1,2 (Cipollo et al., 2001). Интересно, что Alglp может образовывать белковые комплексы с белками Alg2p и Algllp (Gao et al., 2004).

Собранный на обращенной в цитозоль поверхности мембраны ЭР, связанный с долихилпирофосфатом олигосахарид, который состоит из двух остатков N-ацетилглюкозамина и пяти остатков маннозы (Рис. 1А), переносится на сторону мембраны ЭР, обращенную в просвет этого компартмента. В этом процессе, по-видимому, участвует белок Rftlp (Helenius et al., 2002).

После переноса связанного с долихилпирофосфатом олигосахарида на обращенную в просвет ЭР поверхность мембраны, к нему присоединяются еще четыре остатка маннозы и три остатка глюкозы, причем, как было упомянуто выше, донорами этих остатков являются сахара, связанные с долихилфосфатом.

Белок Alg3p участвует в присоединении 6-ого остатка маннозы связью а-1,3 (Huffaker and Robbins, 1983; Aebi et al., 1996; Verostek et al., 1991; Sharma et al., 2001; см. обзор Burda and Aebi, 1999).

Трансфераза Alg9p участвует в присоединении 7-ого остатка маннозы связью а-1,2 (Burda et al., 1996; Cipollo and Trimble, 2000; Cipollo and Trimble, 2002; см. обзор Burda and Aebi, 1999), a, возможно, также участвует и в присоединении девятого остатка маннозы связью а-1,2 (Frank et al., 2004; см. обзор Helenius and Aebi, 2004).

Algl2p предположительно катализирует присоединение 8-ого остатка маннозы связью а-1,6 (Burda et al., 1999; Cipollo and Trimble, 2002; см. обзор Burda and Aebi, 1999).

Трансфераза Alg6p, по-видимому, катализирует присоединение первого (Runge et al., 1984; Reiss et al., 1996), a Alg8p второго остатков глюкозы связью а-1,3 к олигосахариду, связанному с долихилпирофосфатом (Runge and Robbins, 1986; Stagljar et al., 1994). Глюкозилтрансфераза AlglOp вовлечена в присоединение третьего остатка глюкозы связью а-1,2 (Burda and Aebi, 1998; см. обзор Burda and Aebi, 1999).

После завершения синтеза связанного с долихилпирофосфатом олигосахарида, состоящего из 3-х остатков глюкозы, 9-ти остатков маннозы и 2-х остатков N-ацетилглюкозамина (Рис. 1А) ассоциированный с мембраной ЭР фермент, олигосахарил трансфераза, переносит этот олигосахарид (в некоторых случаях на белок может переноситься и меньший по размеру олигосахарид) на Asn секретируемого белка. При этом Asn как правило, входит в состав последовательности Asn-X-Ser/Thr (где X - остаток любой аминокислоты, кроме Pro). Стоит отметить, что, не всякая такая последовательность аминокислотных остатков в белке является субстратом для олигосахарил трансферазы. Олигосахарил трансфераза дрожжей состоит из 9 субъединиц: Ostlp-Ost6p, Wbplp, Stt3p и Swplp (см. обзоры Knauer and Lehle, 1999; Yan and Lennarz, 2005)

После переноса на Asn белка олигосахарид (GlcsMangGlcNAca, где Glc - остаток глюкозы, Man - остаток маннозы, a GlcNAc - остаток iV-ацетилглюкозамина) подвергается процессингу, в результате которого от него отщепляются остатки глюкозы, и, как правило, один остаток маннозы. Глюкозидазы Cwh41p и Gls2p участвуют в отщеплении остатков глюкозы (Romero et al., 1997а; Trombetta et al., 1996; о роли остатков глюкозы в контроле за качеством сворачивания секретируемых белков см. ниже). В отщеплении остатка маннозы участвует маннозидазаМпБІр (Camirand et al, 1991).

Структура GPI якоря

Коровая часть предшественника(ов) гликозилфосфатидилинозитного якоря представляет собой следующую структуру: EtNP-6-Man-a-l,2-Man-a-l,6-Man-a-l,4-GIcN-a-1,6-лшо-инозит-1-Р04-липид, где EtNP - остаток фосфоэтаноламина, Man - остаток маннозы, a GlcN - остаток глюкозамина. В случае S. cerevisiae первый и второй остатки маннозы, по-видимому, могут быть модифицированы остатками фосфоэтаноламина (см. обзоры McConville and Ferguson, 1993; Orlean, 1997; Tiede et al., 1999; Kinoshita and Inoue, 2000; Ikezawa, 2002). Кроме того, четвертый остаток маннозы присоединен к третьему остатку коровой части связью а-1,2, а пятый остаток маннозы может присоединяться связью а-1,2 или а-1,3- к четвертому остатку маннозы GPI якоря уже после его присоединения к белку (Fankhauser et al., 1993; Sipos et al., 1995; Grimme et al., 2001).

Рассмотрим основные реакции, необходимые для формирования GPI якоря. Первым этапом является присоединение остатка iV-ацетилглюкозамина к фосфатидилинозиту, в результате чего образуется JV-ацетилглюкозаминилфосфатидилинозит (GlcNAc-PI). Донором JV-ацетилглюкозамина при этом является UDP-ЛГ-ацетилглюкозамин (Costello and Orlean, 1992). В настоящее время известно, что, по крайней мере, пять белков S. cerevisiae, вовлечены в этот процесс: Gpilp, Gpi2p, Gpi3p, Gpil5p и Erilp (Leidich et al., 1994; Leidich and Orlean, 1996; Leidich et al., 1995; Schonbachler et al., 1995; Yan et al., 2001; Sobering et al., 2004). Проводя аналогию с данными, полученными с использованием клеток млекопитающих (Watanabe et al., 1998; Watanabe et al., 2000), можно предположить, что эти белки образуют комплекс, выполняющий функцию GPI-iV-ацетилглюкозаминилтрансферазы. Роль каждого из белков, входящих в этот комплекс, до конца не ясна. Gpi3p является, по-видимому, каталитической субъединицей. Этот белок похож по аминокислотной последовательности на некоторые бактериальные гликозилтрансферазы, использующие UDP-caxapa (Vossen et al., 1995; Kostova et al., 2000). Данные, полученные с использованием клеток млекопитающих, говорят, что Gpilp возможно участвует в стабилизации комплекса (Hong et al., 1999b). Гены дрожжей GPI2, GPI3 и GPI15 являются жизненно важными (Leidich et al., 1995; Kostova et al., 2003; Yan et al., 2001), a GPI1 и ERI1 - нет, но их деления приводит к температурочувствителыюсти (Leidich and Orlean, 1996; Sobering et al., 2003). Ортологи гена GPU S. cerevisiae из клеток человека и мыши способны частично комплементировать фенотипические проявления, сопровождающие делецию этого гена у дрожжей (Tiede et al., 1998).

Интересны недавние данные, указывающие на то, что работа GPI-iV-ацетилглюкозаминилтрансферазы может негативно регулироваться ГТФазой Ras2p, a Erilp в свою очередь, по-видимому, может, взаимодействуя с GTP-связанной формой Ras2p, ингибировать активность этой ГТФазы (Sobering et al., 2003; Sobering et al., 2004).

Второй реакцией в процессе синтеза GPI является деацетилирование GlcNAc-PI, приводящее к образованию глюкозаминилфосфатидилинозита (GlcN-РГ) (Costello and Orlean, 1992). Эту реакцию, по-видимому, катализирует белок Gpil2p, на 24% идентичный белку PIG-L крысы (Watanabe et al., 1999). Ген GPI12 жизненно важен для клеток дрожжей.

В результате третьей реакции GlcN-PI модифицируется добавлением жирной кислоты к гидроксильной группе инозита, что придает всей структуре устойчивость к действию PI-специфичной фосфолипазы С. Донором остатка жирной кислоты, по-видимому, является ацил-КоА (Costello and Orlean, 1992). Белок Gwtlp необходим для осуществления этой реакции (Umemura et al., 2003). Делеция гена GWT1 приводит к сильному замедлению скорости роста дрожжей и, по крайней мере, у некоторых штаммов, к температурочувствительности (Tsukahara et al, 2003).

Донором первого остатка маннозы, присоединяемого к предшественнику GPI на следующем этапе, является долихилфосфат-манноза (Dol-P-Man). Это следует из того, что нарушение синтеза этого соединения приводит к накоплению GlcN-PI, в котором инозит модифицирован остатком жирной кислоты (см. выше; Orlean, 1990; Costello and Orlean, 1992).

Недавно был клонирован ген PIG-M человека, кодирующий маннозилтрансферазу, катализирующую присоединение первого остатка маннозы к предшественнику GPI якоря. Топология этого мембранного белка говорит о том, что присоединение первого остатка маннозы, по-видимому, происходит на стороне мембраны ЭР, обращенной в просвет этого компартмента. В геноме S. cerevisiae обнаружен ортолог человеческого гена PIG-M- GPI14, кодирующий белок на 35% идентичный белку PIG-M человека (Maeda et al., 2001; Ashida et al., 2005). Некоторые фенотипические проявления мутации в жизненно важном гене GPI14 согласуются с тем, что кодируемый им белок участвует в синтезе GPI якорей (Davydenko et al., 2005). Кроме того, недавно были выявлены белки, PIG-X млекопитающих и ортологичный ему Pbnlp S. cerevisiae, также участвующие в присоединении первого остатка маннозы

Связанная с ЭР деградация неправильно свернутых белков (ERAD, endoplasmic reticulum associated degradation)

Неправильно свернувшиеся белки, как правило, задерживаются в ЭР и впоследствии направляются в цитозоль для деградации протеасомой (McCracken and Brodsky, 1996; Werner et al., 1996; Hiller et al., 1996; см. обзор Parodi, 1999).

У млекопитающих и, по-видимому, большинства других видов эукариот, ведущую роль в контроле за качеством сворачивания секретируемых белков играет система, состоящая из перечисленных ниже компонентов. Во-первых, это ферменты, удаляющие остатки глюкозы с олигосахарида (Glc3Man9GlcNAc2, где Glc - остаток глюкозы, Man -остаток маннозы, a GlcNAc - остаток iV-ацетилглюкозамина), перенесенного на Asn белка в ЭР (см. раздел, посвященный синтезу N-связанных гликаиов секретируемых белков). Во-вторых, в систему контроля за качеством сворачивания секретируемых белков входит фермент (UDP-глюкозатликопротеин глюкозилтрансфераза), способный узнавать неправильно свернутые белки и повторно присоединять остаток глюкозы к их iV-связанным олигосахаридам. Кроме того, в осуществлении контроля за качеством участвуют белки кальциневрин и кальретикулин (в случае дрожжей Schizosaccharomyces pombe последний отсутствует), способные связываться с белками, к JV-связанным олигосахаридам которых присоединен один остаток глюкозы, и, удерживая их в ЭР, способствовать их правильному сворачиванию (см. обзоры Ahner and Brodsky, 2004; Parodi, 1999; Ellgaard and Helenius, 2003), а также лектин EDEM, связывающийся с белками, несущими олигосахариды Man8GlcNAc2 (возникающие после удаления остатков глюкозы и одного остатка маннозы), и способствующий последующей деградации белков, которые так и не приняли правильную конформацию (Oda et al., 2003; Molinari et al., 2003). Помимо вышеперечисленных белков, шапероны, например, такие, как BiP, также могут принимать участие в контроле за качеством сворачивания секретируемых белков (см. обзор Ahner and Brodsky, 2004).

Однако система контроля за качеством сворачивания секретируемых белков у & cerevisiae несколько отличается от аналогичной системы млекопитающих и даже дрожжей Schizosaccharomyces pombe. В клетках S. cerevisiae присутствуют глюкозидазы (Cwh41p и Gls2p), отщепляющие остатки глюкозы от перенесенного на Asn белка олигосахарида (Romero et al., 1997а; Trombetta et al., 1996). В клетках дрожжей этого вида обнаружен ортолог кальнексина, белок Cnelp, который, несмотря на невысокую (24% идентичность) гомологию с кальнексином собаки, возможно, имеет некоторое отношение к контролю за качеством сворачивания секретируемых белков (Parlati et al., 1995), а также белок Mnllp (Htmlp), гомологичный EDEM, способствующий деградации неправильно свернутых гликопротеинов (Nakatsukasa et al., 2001; Jakob et al., 2001; Spear and Ng, 2005; см обзор Ahner and Brodsky, 2004). Кроме того, в клетках S. cerevisiae присутствует ортолог BiP -белок Kar2p (Rose et al., 1989; Normington et al., 1989; см обзор Ahner and Brodsky, 2004).

Тем не менее, в клетках S. cerevisiae не выявлено фермента, обладающего активностью 1ГОР-глюкоза:гликопротеин глюкозилтрансферазы, хотя и имеется белок (Кге5р), который обладает некоторой гомологией с 1ГОР-глюкоза:гликопротеин глюкозилтрансферазами других эукариот (Fernandez et al., 1994; Jakob et al., 1998; Parker et al., 1995; см. обзор Parodi, 1999).

Белки, которые так и не смогли принять правильную конформацию, деградируют в цитозоле при участии протеасомы. При этом растворимые и, по крайней мере, некоторые белки, содержащие трансмембранные домены, ретротранслоцируются в цитозоль при участии белка Sec61p (Pilon et al., 1997; Plemper et al., 1997; Zhou and Schekman, 1999; см. обзор Romisch, 1999). Однако некоторые мембранные белки, по-видимому, не нуждаются в Sec61p для обратного транспорта в цитозоль (Walter et al., 2001; Huyer et al., 2004; см обзор Ahner and Brodsky, 2004). Протеин дисульфид изомераза, кодируемая у дрожжей геном PDI1, по-видимому, способна узнавать в ЭР неправильно свернутые белки и способствовать их ретротранслокации (Gillece et al., 1999). Возможно, подобную функцию выполняет и белок Mnllp (Htmlp) (Spear and Ng, 2005).

Независимо от пути, которым неправильно свернутый белок ретротранслоцируется в цитозоль, в этом процессе также, по-видимому, принимает участие белковый комплекс, состоящий из Cdc48p, обладающего активностью АТРазы, а также Ufdlp и Npl4p (Ye et al., 2001; см. обзор Bays and Hampton, 2002). Стоит также отметить, что сам 19S кэп протеасомы, возможно, способствует процессу ретротранслокации некоторых неправильно свернутых белков (Lee et al., 2004).

Перед деградацией 26S протеасомой (Hampton et al., 1996; Hiller et al., 1996) неправильно свернутые белки в цитозоле убиквитинилируются. В этом процессе принимают участие локализованные в мембране ЭР убиквитин лигазы DoalOp (Swanson et al., 2001) и комплекс белков Der3p/Hrdlp и Hrd3p (Bordallo et al., 1998; Gardner et al., 2001; Deak and Wolf, 2001), а также белки, соединенные с убиквитином (ubiquitin-conjugating enzymes) Ubclp, иЪсбр Ubc7p (Bays et al., 2001; Biederer et al., 1996), а, возможно, и некоторые другие белки (Haynes et al., 2002; Hill and Cooper, 2000; см. обзоры Hampton, 2002; Ahner and Brodsky, 2004). Кроме того, неправильно свернутые гликопротеины дегликозилируются локализованной в цитозоле iV-гликаназой (Suzuki et al., 2000; Hirsch et al., 2003; Hirsch et al., 2004).

Похожие диссертации на Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces Cerevisiae