Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 5
1. 1. Внутрикле точные фосфолипазы 5
1.2. Фосфолипаза Ag митохондрий 28
Глава 2. Экспериментальная часть 47
2.1.Материалы 47
2.2.Выделение и фрагментация митохондрий... 48
2.3.Определение активности фосфолипазы Ag.» 49
2.4.Определение активностей маркерных ферментов 51
2.5. Синтез поликефамида - сорбента для иммобилизации фосфолипазы An 53
2.6. Иммобилизация фосфолипазы An митохондрий на биоспецифическом сорбенте 55
Глава 3. Результаты и их обсуздение 57
3.1.Локализация фосфолипазы An в митохондриях 57
3.2. Свойства мембраносвязаняых форм фосфолипазы AQ внутренней и наружной мембран митохондрий 69
3.3.Каталитические свойства адсорбционноиммобилизованной фосфолипазы An мито хондрий 83
3.4.Влияние циклического АМФ и АТФ на эндогенные фосфолипазы митохондрии 100
Заключение 107
Выводы 110
Список литературы 113
- Фосфолипаза Ag митохондрий
- Синтез поликефамида - сорбента для иммобилизации фосфолипазы An
- Иммобилизация фосфолипазы An митохондрий на биоспецифическом сорбенте
- Свойства мембраносвязаняых форм фосфолипазы AQ внутренней и наружной мембран митохондрий
Введение к работе
Исследование каталитических свойств мембраносвязанных ферментов является одной из наиболее актуальных задач современного мембранного катализа. Особый интерес представляет изучение мито-хондриальной фосфолипазы iU, играющей ключевую роль в функционировании биологических мембран, в процессах регуляции их фосфоли-пидного состава и активности липидзависимых ферментов митохондрий. В настоящее время неоспоримо доказано, что митохондриальная фосфолипаза «^ принимает непосредственное участие в развитии "скрытых" повреждений мембран при патологических и стрессорных состояниях, а также в адаптационных процессах организма.
В то же время в изучении каталитических и функциональных свойств этого фермента имеется ещз целый ряд проблем, которые к настоящему времени полностью не изучены или же содержат много противоречий. Известно, что в митохондриях фосфолипаза .^ находится только в мембраносвязанном состоянии, однако до сих пор нет однозначного мнения о локализации его в мембранах митохондрий.Све-дения относительно каталитических свойств этого фермента малочисленны и носят разрозненный характер, фактически отсутствуют данные по изучению каталитических свойств фермента в модельных системах и, в частности, в иммобилизованном состоянии. .
В этой связи целью настоящего исследования было: I) изучить локализацию фосфолипазы А2 в митохондриях; 2) исследовать каталитические свойства мембраносвязанной митохондриальной фосфолипазы А2; 3) разработать метод адсорбционной иммобилизации на нерастворимых фосфолипидах и изучить свойства фермента в иммобилизованном состоянии; 4) изучить влияние циклического АШ и АТФ на проявле-
4 ниє каталитических свойств митохондриальной фосфолипазы к%*
На основании проведенных исследований с использованием маркерных ферментов получены новые данные о локализации фосфолипазы ко как на внутренней, так и на наружной мембранах митохондрий, в сравнительном аспекте изучены каталитические свойства фермента обеих мембран митохондрий, исследованы свойства митохондриальной фосфолипазы А, иммобилизованной на субстрате -фосфатидэтаноламине, изучено влияние АШ? и АТФ на проявление гидролитических свойств фермента в мембраносвязанном состоянии. Полученные данные представляют интерес для спеїщалистов,работающих в области биофизики и биохимии по выяснению механизмов участия фосфолипазы к% в регуляции функционального состояния митохондрий. Результаты работы могут быть использованы в медицине для разработок методов диагностики различных патологических процессов, связанных с нарушением функционирования митохондрий.
Фосфолипаза Ag митохондрий
Исследованию митохондриальной фосфолипазы AQ уделяется повышенное внимание исследователей. В первую очередь,это обусловлено важностью функциональной роли митохондрий, обеспечивающих клетку энергией за счет окислительно-восстановительных процессов. Предположение о присутствии фосфолипазы в митохондриях впервые сделали еще в 1959 г. Ленинджер и Реммерт,обнаружившие высокую концентрацию жирных кислот при набухании митохондрий ( ( фактор) /114/.В настоящее время доказано,что этот фермент играет ключевую роль в регуляции функционального состояния митохондрий. Опубликован ряд работ,посвященных изучению свойств этого фермента. Однако,не смотря на многочисленность подобных исследований, большинство вопросов,касающихся физиологической функции фосфолипазы А»его локализации в митохондриях,каталитических свойств,остаются во многом спорными или полностью неисследованными. Подавляющее число исследований по фосфолипазам митохондрий проведено с клетками печени,как источником ферментов.Однако, как было показано выше,во всех фракциях клетки печени была обнаружена фосфолипазная активность. При анализе фосфолипаз митохондрий все эти ферменты,либо в виде примесей,либо в адсорбированной на митохондриальных мембранах форме могли интерферировать с фосфолипазами митохондрий. Поэтому решение вопроса о локализации фосфолипазы А2 в митохондриях оказалось весьма сложным.
Тем не менее Росси с сотрудниками, обнаружив корреляцию между разобщением окислительного фосфорилирования и уменьшением содержания фосфолипидов в митохондриях из печени, сделали вывод о существовании некой особой эндогенной фосфолипазы, локализованной в мембранах митохондрий /25,26/. Этот вывод подтверждался появлением в реакционной среде соответствующих лизопроизводных и жирных кислот» Последующие работы различных авторов подтвердили наличие в митохондриях фосфолипазы А , обладающей специфичностью к гидролизу связи во втором положении фосфолипидов и являющейся, таким образом, фосфолипазой i (27,28,115-118/.
Впервые попытку установить точную локализацию фосфолипазы А2 в митохондриях предприняли Нахбаур и Винье /27/. При помощи осмотического шока и последующего дифференциального центрифугирования они отделили наружную мембрану от внутренней с матриксом ("тени митохондрий") и исследовали фосфолипазную активность в этих двух фракциях. Согласно их результатам удельная активность наружной мембраны была в 2,7 раза выше, чем во фракции "внутренняя мембрана + матрикс". Из этого авторы сделали выводы, что фос-фолипаза А2 расположена исключительно на наружной мембране, а ее активность во фракции "внутренняя мембрана + матрикс" обусловле-на примесями наружной мембраны. Однако вывод этот был не вполне обоснованный, так как, исходя из данных самих авторов о распределении маркерных ферментов во фракциях (цитохром-оксидаза в слу-чае внутренней мембраны и моноамино-оксидаза в случае наружной), загрязнение внутренней мембраны наружной составляло 94$, так что активность фракции наружных мембран должна быть в 10 раз больше, чем во внутренней мембране, а не в 3,7, как получили авторы статьи.
В 1969 г. аналогичные результаты получил Уайт /117/. Он выделил хорошо очищенную фракцию митохондрий, используя центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. Маркерные ферменты показали, что митохондрии были загрязнены другими оргаяеллами не более , чем 1% JWR микросом и 2% для лизосом, содержащихся в гомогенате. Митохондрии фрагментировалиоь двумя способами: осмотическим шоком и инкубацией в растворе Са2+ с последующим центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Маркерные ферменты показали, что осмотический шок приводит к отделению 75-85$ наружной мембраны, в этих условиях солюбилизируется около 40$ белков матрикса. Инкубация с Са2+ приводила к более полному отделению белков матрикса (95$). Уайтом также было показано, что фосфолипазная активность наружной мембраны в 3,1 раза больше, чем во фракции "внутренняя мембрана + матрикс". Однако свои результаты Уайт интерпре-тировал как свидетельство двойственной локализации исследуемого фермента в митохондриях. Вместе с тем, он не предпринял сравнительного изучения свойств фосфолипаз, локализованных во внутренней и наружной мембранах митохондрий.
К выводу о двойственной локализации фермента пришли ж Нах-баур с соавторами в 1972 г. /98/. Они исследовали все внутриклеточные фосфолипазы: в митохондриях, лизосомах, микросомах и плазматических мембранах. Растворимая фосфолипаза (рН-оптимум 4.,5) присутствовала только в лизосомах. Вопрос о вероятной примеси в митохондриях щелочной лизосомальной фосфолипазы к% отбрасывался простым расчетом, так как сравнение фосфолипазных активностей в разных средах показало, что при рїї 9 0 фосфолипаза к% лизосом может отвечать не более, чем за I/I0 от общей фосфолипазной активности митохондрий.
Синтез поликефамида - сорбента для иммобилизации фосфолипазы An
Капроновую ткань растворяли в концентрированной соляной кислоте (на I кг неокрашенной ткани 2,3 л концентрированной со-ляной кислоты) при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Затем добавляли 40 -водный раствор ацетона до снижения концентрации соляной кислоты до 2,8-3,0 М в течение 1,5-2,0 часов при перемешивании. Смесь выдерживали без перемешивания в течение I часа, осадок капрона отделяли декантацией. Для удаления соляной кислоты капрон промывали водой на воронке Бюхнера до нейтральной реакции. Затем капроновый порошок обезвоживали безводным ацетоном (2 л на I кг капрона). Полученный порошок капро-на высушивали в вытяжном шкафу в течение одного часа, а затем в сушильном шкафу при температуре 50-60С в течение 3-4 часов. Высушенный капрон фракционировали путем просеивания через сито с размером отверстий 0,14, 0,25, 0,5 и 1,0 мм. Для синтеза сорбента использовали фракцию 0,14-0,25 мм.
Для активации носителя навеску полиамидного порошка суспендировали в 5-кратном количестве 3,5 н раствора соляной кислоты и перемешивали I час при температуре 45С, промывали полиамид водой до нейтрального значения рН и затем 0,1 М боратным буфером, рН 8,5. После каждой промывки полиамид отделяли центрифугированием при 6000 об/мин.
Модификацию полиамидного носителя осуществляли глутаровым альдегидом. У суспензии активированного полиамидного носителя, уравновешенного в 0,1 М боратяом буфере с рН 8,5, добавляли 5-кратное по объему количество 2,беспроцентного раствора глутаро-вого альдегида в том же буферном растворе и оставляли при перемешивании на 2 часа. При этом глутаровыи альдегид реагирует со свободными аминогруппами носителя с образованием оснований Шиф-фа. Непрореагировавший глутаровыи альдегид отмывали 10-кратным по объему количеством того же буферного раствора.
Для присоединения лиганда к суспензии модифицированного по-лиамида в 0,1 М боратном буфере с рН 9,5 добавляли 5-кратное по объему количество суспензии суммарных фосфолипидов, концентрация которых в этом же буфере была 40 мг/мл. При этом весовое соотношение фосфолипидов и носителя составляло 1:5 в расчете на сухой вес. Смесь выдерживали при постоянном перемешивании в течение 2 суток при температуре 4С. При этом происходит кова-лентное связывание фосфатидилэтаноламина с модифицированным носителем также по принципу образования оснований Шиффо. Несвязавшиеся фосфолипиды удаляли промыванием адсорбента 10-кратным объемом диэтилового эфира. Количественный анализ фосфолипидов проводили по методу /163/.
Для блокирования свободных альдегидных групп к полученному адсорбенту, уравновешенному в 0,1 М боратном буфере рН 9,5, прибавляли этаноламин из расчета 0,35 мл на I г сухого веса адсорбента и оставляли при перемешивании на 24 часа при температуре 4С. Избыток этаноламина удаляли промыванием адсорбента тем же буфером в 5-кратном объеме. Перед использованием аффинный сорбент уравновешивали глициновым буфером (0,05 М, рН 9,5).
Иммобилизация фосфолипазы An митохондрий на биоспецифическом сорбенте
Адсорбционную иммобилизацию фосфолипазы к% осуществляли на биоспецифическом сорбенте, полученном путем ковалентного связывания фосфатидилэтаноламина на модифицированном глутаровым альдегидом полиамидном носителе. Для этого 10 мл фракции внутренних мембран митохондрий суспендировали в 20 мл 0,02 М трис-на-буфера (рН 8,0), содержащем 2 мМ ионов кальция, и обрабатывали ультразвуком (2 мин, 44 кГц). Затем смешивали с 5 г высушенного препарата гранулированного биоспецифического сорбента (размер гранул 0,14-0,25 мм). Смесь инкубировали при температуре 4С и постоянном перемешивании в течение 2 часов. Несвязавшиеся белки отделяли путем фильтрации на воронке Бюхнера. Для обеспечения более полного связывания фосфолипазы А отделенный фильтрат трехкратно пропускали через слой сорбента на воронке Бюхнера. Не специфически адсорбированные белки удаляли промыванием сорбента 100 мл 0,02 М трис- НСІ -буфера (рН 8,0), содержащего 2мМ ионов кальция. Полученный препарат иммобилизованной фосфолипазы Ар высушивали на фильтровальной бумаге и хранили при температуре 4С. Для определения активности порошок сорбента с иммобилизованным ферментом суспендировали в 0,01 М трис- неї буфере (рН 8,0),со-держащем 2 мМ ионов кальция, в весовом соотношении 1:10 и полученную суспензию использовали в качестве ферментного раствора, добавляя в стандартную реакционную смесь в количестве 0,5 мл. Термостабильность нативной и иммобилизованной форм фосфолипазы Ао определяли путем инкубации в 0,01 М трис- неї -буферном растворе (рН 8,0), содержащем 2 м М ионов кальция, при температуре 55С.
Известно, что основным условием успешного проведения цитохимических исследований по выяснению локализации ферментов в клетке или ее органеллах является выделение фракции с максимальной степенью очистки, а также выяснение количества примесей,присутствующих в ней. Для соблюдения этих условий при проведении операций по выделению митохондрий из печени крыс мы придерживались следующих основных правил: I) для предупреждения работы ли-зосомальных ферментов все операции проводили в холодной комнате при температуре 0-2С; 2) максимально сокращали время между забоем животных и использованием печени; 3) промывание митохондрий осуществляли 3-4 раза, суспендируя в чистой среде выделения, не содержащей растворимых белков исходного гомогената; 4) проводили оценку чистоты выделенных препаратов митохондрии при помощи маркерных ферментов. Оценку степени загрязненности митохонд-риальной фракции лизосомами осуществляли, определяя активность кислой фосфатазы, содержание микросом контролировали по активности глюкозо-6-фосфатазы. В таблице I представлены результаты изучения влияния процедуры промывания митохондриальной фракции на содержание в ней примесей лизосом и микросом. Видно, что в результате дифферен-ционного центрифугирования гомогената печени и трехкратного промывания митохондриальной фракции в конечном препарате митохондрии остается 3,26$ исходного содержания белка в гомогенате.
Свойства мембраносвязаняых форм фосфолипазы AQ внутренней и наружной мембран митохондрий
Исследование каталитических свойств ферментов обычно предполагает предварительное их выделение из изучаемого объекта и очистку до необходимой степени чистоты. Однако это положение справедливо в основном при работе с водорастворимыми ферментами. В случае изучения свойств мембраносвязанных ферментов операции по выделению и очистке зачастую приводят к изменению каталитических свойств или к полному их подавлению, связанному с изменением фосфолипидного окружения, а, следовательно, и конформации белков. Для получения объективных сведений о каталитических свойствах ферментов, связанных с биомембранами, исследования проводят с препаратами фермента, выделенных с минимальным нарушением их нативного состояния, т.е. в мембраносвязанном состоянии. В наших исследованиях по изучению каталитических свойств митохондриальной фосфолипазы А2 мы использовали препараты фракций внутренних и наружных мембран митохондрий, выделенных вышеописанным методом субфракционирования. Были исследованы следующие каталитические свойства фосфолипазы А - рН-оптимум, температурный оптимум, термостабильность, кинетика гидролиза фосфолипи-дов, чувствительность к присутствию различных двухвалентных катионов и детергентов. рН-оптимум. На рис.1 представлены результаты изучения влияния рН среды на фосфолипазную активность мембран митохондрий. Видно, что гидролитическая способность фосфолипазы А% внутренней мембраны митохондрий проявляется только при рН среды выше рН 7. Фермент наружной мембраны при этом же рН проявляет сравнительно высокую активность, равную 50% максимального значения удельной активности. Однако при рН ниже 7 наблюдается резкое снижение активности фермента. Кривые, описывающие зависимость активности ферментов от рН, показывают, что фосфолипаза к? наружной мембраны менее чувствительна к изменению концентрации ионов водорода в реакционной среде и может катализировать гидролиз фосфолипидов в сравнительно широком диапазоне изменений рН от 7,0 до 10,0. При этом максимальная активность фермента проявляется в пределах рН от 7,5 до 8,5. В отличие от фосфолипазы Ag наружной мембраны фермент внутренней мембраны работает при более щелочных значениях рН: гидролитическая способность этого фермента обнаруживается в диапазоне изменений рН среды от 8,0 до 9,5 и имеет четко выраженную величину оптимального значения рН (рН 8,5). На основании по-лученных данных можно предположить, что фосфолипазы Ag наружной и внутренней мембран митохондрий в мембраносвязанном состоянии различаются составом ионизируемых функциональных групп в их активных центрах.
Противоречия, имеющиеся в литературе относительно рН-оптимума митохондриальной фосфолипазы Ag, по-видимому, были связаны с детектированием активности ферментов, связанных с различными мембранами митохондрий. Температурный оптимум. Результаты исследований по определению оптимальных температур каталитического действия фосфолипаз Ag внутренней и наружной мембран митохондрий представлены на рис.2. Видно, что максимальная активность фосфолипаз Ао обеих мембран проявляется при одной и той же температуре, равной 40С. Однако имеются существенные, различия в зависимости активности этих ферментов от температуры реакционной среды. Фосфолипаза Ag внутренней мембраны в меньшей степени чувствительна к изменению температуры и сохраняет сравнительно высокую гидролитическую активность при температурах в пределах от 20 до 60С. В то же время активность наружной мембраны митохондрий при незначительных отклонениях температуры реакционной среды от оптимальной быстро подавляется. В пределах температур 35-45С скорость гидролиза фосфолипидов этой фосфо-липазой сохраняется на достаточно высоком уровне. Термостабильность. Соответствующие различия были обнаружены при изучении термостабильности фосфолипаз А? внутренней и наружной мембран MX путем инкубации при 50С (рис.3), фосфолипаза А2, связанная с наружной мембраной, отличается высокой стабильностью к действию высоких температур. При этом время полу инактивации фермента при 55С составило 5 часов. В то же время фермент внутренней мембраны очень чувствителен к действию высоких температур и при инкубации при 55С теряет половину исходной активности всего за 25 минут. Однако дальнейшая инкубация в этих же условиях приводит к незначительной инактивации фермента и в течение 6 часов сохраняется еще 30$ исходной активности. Литературные данные о высокой термостабильности митохондриальной фосфолипазы А2 /122/, по-видимому, имеют отношение к ферменту, связанному с наружной мембраной митохондрий. Говоря о стабильности фермента, следует отметить и тот факт, что длительное хранение препаратов мембраносвязанных ферментов при температуре -4С в течение месяца не снижало их активность, а, наоборот, активировало. Активацию можно отнести за счет физического воздействия, которому подвергались мембраны при операциях замораживания и оттаивания, когда нарушалась их целостность, что согласуется с литературными данными /34/. Кинетика гидролиза фосфодидидов. Имеются различия и в кинетике накопления жирных кислот под действием фосфолипазы Аг внутренней и наружной мембран митохондрий (рис.4). Фермент внешней мембраны гидролизует фосфолипиды с несколько большей скоростью, чем фосфолипаза А2 наружной мембраны.
Влияние ионов кальция и ЭДТА. Результаты исследований по изучению влияния ионов кальция на гидролитическую способность фосфолипазы А2 внутренней и наружной мембран митохондрий представлены на рис.5. Видно, что оба фермента могут проявлять каталитические свойства и в отсутствии эндогенных ионов кальция. Эти данные никак не противоречат положению, что митохондриальная фосфолипаза А2 является Са2+-зависимым ферментом. По-видимому, в данном случае для проявления гидролитической функции вполне достаточна концентрация эндогенного кальция, которая в митохондриях находится в пределах 10-20 нМ. Добавление в реакционную среду экзогенного кальция стимулирует активность обоих ферментов, достигая максимального значения при концентрации кальция 2 мМ. Более высокие концентрации кальция угнетают активность фосфолипазы А2 внутренней мембраны митохондрий и не сказываются отрицательно на активности фермента наружной мембраны.
Похожие диссертации на Свойства фосфолипаз А2 митохондрий печени крысы
