Содержание к диссертации
Введение
1. Структурно-функциональное состояние митохондрий после замораживания-отогрева
2. Ионная проницаемость митохондриальных мембран в норме и патологии РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3. Материалы и методы исследования 33
3.1. Выделение митохондрий из печени крыс 33
3.2. Аналитические методы І 34
3.3. Техника и режимы замораживания-отогрева 40
3.4. Характеристика использованных реактивов 42
4. Влияние режимов замораживания-отогрева на ионную проницаемость и структурно-функциональное состояние митохондрий 43
4.1. Изменение ионной проницаемости мембран митохондрий после действия низких температур 45
4.2. Действие низких температур на АТР-синтетазную и АТРазную активности митохондрий 48
4.3. Влияние скорости замораживания и отогрева на транспорт ионов Са в митохондриях печени крыс .. 50
4.4. Структурные изменения митохондрий после действия низких температур 56
5. Чувствительность ключевых ферментов системы окислительного фосфорилирования митохондрий к действию низких
температур 6^
5.1. Влияние замораживания-отогрева на сукцинатдегидро-геназную и цитохромоксидазную активности митохондрий 67
5.2. Содержание цитохромов и активность внешнего пути окисления НДЩ в митохондриях после действия низких температур 70
5.3. Влияние замораживания-отогрева на окисление НАД(Ф)-зависимых субстратов 79
б. Состояние ионного транспорта митохондрий после замора живания-отогрева 84
6.1. Восстановление функциональной активности митохондрий после действия низких температур 84
6.2. Свойства систем ионного транспорта митохондрий, индуцированных после замораживания-отогрева 87
6.3. Роль перекисного окисления и ферментативного гидролиза мембранных липидов в индукции ионного транспорта митохондрий после зшлораживания-отогрева.101
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 113
ВЫВОДЫ 119
ЛИТЕРАТУРА 121
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 150
- Структурно-функциональное состояние митохондрий после замораживания-отогрева
- Ионная проницаемость митохондриальных мембран в норме и патологии
- Техника и режимы замораживания-отогрева
- Изменение ионной проницаемости мембран митохондрий после действия низких температур
- Влияние замораживания-отогрева на сукцинатдегидро-геназную и цитохромоксидазную активности митохондрий
Введение к работе
Биологические объекты широко используются для низкотемпературного консервирования с целью их дальнейшего применения в биологии и медицине. Несмотря на определенные успехи в разработке методов глубокого замораживания и хранения отдельных клеток животного и растительного происхождения, низкотемпературное консервирование органов находится еще в стадии экспериментальных разработок [47,60,202]. Для успешного решения этой задачи необходимо глубокое и всестороннее изучение механизмов криопов-реждения биоструктур, стоящих на различных уровнях биологической организации.
Наиболее чувствительными структурами к повреждающему действию замораживания являются мембраны клеток и клеточных орга-нелл [5,6,302]. Холодовое повреждение биологических мембран обусловлено как изменением свойств среды, в условиях кристаллизации водной фазы [80,220,228] , так и изменением физико-химического состояния входящих в их состав компонентов - липидов и белков [5,6,IIl]. Криоповреждение мембран, выполняющих наиболее важные и сложные функции клетки может привести к потере ее биологических свойств.
Важными мембранными структурами клетки являются митохондрии, трансформирующие энергию окисления субстратов в энергию аденозинтрифосфата (АТР), которая используется на поддержание клеточного гомеостаза и обеспечение функционального статуса. Митохондрии играют ключевую роль и во внутриклеточном распреде- лении ионов - важнейших регуляторов метаболизма [13,115, <і47, 2УУ]. Некоторые исследователи считают, что для гибели клеток во время их замораживания достаточно повреждения митохондрий и локализованных в них систем генерации энергии [156,171,250].
Высокий уровень структурной и функциональной организации митохондриальных мембран лежит в основе их повышенной чувствительности к низким температурам. Хотя молекулярный механизм генерации энергии в настоящий момент не полностью выяснен, ясно, что внутренняя мембрана митохондрий играет в нем решающую роль. Обязательным условием для сопряжения процессов окисления субстратов с синтезом АТР является ее низкая проницаемость для ионов [194,239]. Любые воздействия, приводящие к увеличению ионной проницаемости внутренней мембраны, сопровождаются разобщением окислительного фосфорилирования [21,65) . Этот факт позволяет рассматривать митохондрии как удобную модель для изучения действия низких температур на биологические структуры.
Вместе с тем установлено, что ионная проницаемость внутренней мембраны митохондрий, индуцированная различными агентами, может регулироваться метаболическим состоянием органелл: степенью восстановленности дыхательной цепи [103,331] , пиридиновых нуклеотидов [212,277], тиоловых групп [ібб,2Із]. В настоящее время известно, что разобщение окислительного фосфорилирования, наблюдаемое после глубокого охлаждения митохондрий, сопровождается увеличением протонной проводимости внутренней мембраны [56,69]. Свойства ионного транспорта, индуцированного низкотемпературным воздействием, а также его возможная регуляция со стороны других функциональных систем митохондрий до сих пор остаются не изученными.
Другой причиной нарушения функционального состояния мито- хондрий после замораживания-отогрева является угнетение активности дыхательной цепи [44,t>6,69]. Однако остается не вполне ясным, какие именно участки дыхательной цепи наиболее криочувст-вительны и какой режим криовоздействия ответственный за структурно-функциональные нарушения.
Анализ литературы показывает, что основное внимание исследователей уделяется механизму низкотемпературного повреждения электронтранпортной цепи и АТР-генерирущего аппарата. Б то же время их способность к активному транспорту Оа после замораживания-отогрева остается неизученной, хотя известно, что повышение концентрации этого иона в цитоплазме приводит к гибели клеток [107,281].
Существует мнение [28tf,290,29l], что для криоповреждения митохондрий характерна "латентность", когда повреждения развиваются не сразу после отогрева, а через определенный промежуток времени. Причины развития этих повреждений и пути их предотвращения остаются мало исследованными.
Эффективным путем предохранения биоструктур от повреждающего действия замораживания является применение криопротекторов. Однако в силу своего химического строения традиционные защитные соединения не могут обеспечить сохранность биологических структур, не оказывая при этом отрицательного влияния на метаболическое состояние клеток и ее органелл. Поэтому актуальной проблемой криобиологии является поиск новых путей сохранения биологических свойств органелл, клеток, органов и тканей. Одним из таких подходов является стимуляция восстановительных процессов в указанных выше биосистемах при использовании эффективных режимов замораживания-отогрева под защитой мембранстабилизирующих соединений.
Цель работы
Целью настоящей работы явилось изучение характера изменений ионной проницаемости мембран и окислительного фосфорилиро-вания митохондрий в зависимости от режимных параметров их замораживания и времени после отогрева для выявления причин возникновения "латентных" повреждений и поиска путей их предотвращения с помощью биологически активных соединений.
Задачи исследования
Исследовать дыхательную, фосфорилирующую, АТРазную и Са -транспортную активности митохондрий и проницаемость их мембран для ионов If**, К*, Na+ при различных вариантах быстрого и медленного замораживания-отогрева.
Определить криочувствительность различных участков дыхательной цепи на основании ингибиторного анализа, измерения концентрации митохондриальных цитохромов и активности мембрано-связанных ферментов.
Исследовать зависимость изменения величины мембранного потенциала и проницаемости митохондриальных мембран для ионов после замораживания и отогрева во временном аспекте с целью выяснения причин возникновения "латентных" криоповреждений.
Разработать способы предотвращения "латентных" криоповреждений с помощью биологически активных мембранотропных соединений.
Научная новизна
В результате проведенной работы выявлены некоторые общие закономерности развития криоповреждений и репаративных процессов в мембранах митохондрий. Показано, что нарушения функционального состояния замороженно-отогретых митохондрий обусловлены двумя основными причинами: изменением проницаемости внутрен- ней мембраны для ионов и подавлением активности электронтранс-портной цепи. Установлено, что ингибирование скорости переноса электронов по дыхательной цепи вызвано высвобождением эндогенного цитохрома с из внутренней мембраны в среду замораживания. Выяснен механизм развития "латентных" криоповреждений в мембранах митохондрий и разработаны конкретные способы их предотвращения. Установлено, что развитие "латентных" повреждений обусловлено процессами перекисного окисления и фосфолипазного гидролиза мембранных липидов. Впервые изучена динамика репаративных процессов после криовоздействия и показано, что мембраноактивные соединения (антиоксиданты, местные анестетики, комплексоны Са^*, адениновые нуклеотиды, НАД(ф)-зависимые субстраты) обеспечивают эффективное восстановление функционального состояния митохондрий, подвергнутых замораживанию-отогреву.
Практическая ценность
Установленные в работе оптимальные условия замораживания-отогрева, обеспечивающие возможность реализации репаративных процессов в мембранах митохондрий, могут явиться обоснованием для разработки рекомендаций при криоконсервировании различных клеток и более сложных объектов. Выяснение механизма возникновения "латентных" повреждений в мембранах митохондрий после замораживания-отогрева позволило разработать способы их предотвращения с помощью антиоксидантов, местных анестетиков, адениновых нуклеоти-дов, НАД(Ф)-зависимых субстратов.
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференциях молодых ученых Института проблем криобиологии и крио-медицины АН УССР (.Харьков, 1980, 1984); 1У-м Украинском биохимическом съезде ІДнепропктровск, 1982); ХІ-й Всесоюзной конферен- ции по пересадке органов и тканей (Тбилиси, 1982); 11-м Международном симпозиуме "Вода и ионы в биологических системах" (Румыния, Бухарест, 1982).
Структурно-функциональное состояние митохондрий после замораживания-отогрева
В настоящее время считается, что повреждение биологических объектов в процессе замораживания может быть результатом действия четырех основных факторов, связанных с изменением свойств среды:
1. температурного шока, т.е. резкого перепада температур и то-ничности среды в отсутствии фазового перехода воды в лед [53,60, 217];
2. образования кристаллов льда [80,227,230] ;
3. увеличения концентрации солей и других растворенных веществ в результате вымораживания воды [232,234,265];
4. дегидратации - удаления воды из мембран и макромолекул [159, 23IJ.
На основании ряда экспериментальных работ [105,160,221,267 выяснено, что при понижении температуры до 0 -І5С в мембранах биосистем различного уровня организации происходят фазово-структурные перестройки липидов. Фактически это означает, что в этих условиях мембранные липиды переходят из жидкокристаллического состояния в состояние геля. Температуры фазовых переходов природных липидов варьируют в широких пределах, что обуславливает сосуществование в бислое двух фаз: твердой и жидкой. При дальнейшем понижении температуры (-18 -30С) происходит латеральное разделение липидов [160,197,303] и формирование в мембране кластеров, обогащенных липидами с близкими физико-химическими свойствами [154,184,197]. Процессы кластеризации липи-дов сопровождаются агрегацией белков и их вытеснением из глубины мембраны к ее поверхности [142,196,323].
Целенаправленный научный анализ литературных и собственных экспериментальных данных позволил авторам работы [б] создать реальную многофакторную гипотезу криоповреждения, органично соединившую роль факторов среды со структурными изменениями биологических мембран. Эта работа явилась дальнейшим развитием современных представлений о механизмах процессов, приводящих к нарушению свойств биообъектов после деконсервации. Однако степень обратимости этих процессов после отогрева остается малоизученной.
Известно, что после локального замораживания различных тканей частично или полностью восстанавливаются присущие им биологические свойства [20,38,73] . Однако до настоящего времени остается не вполне ясным: связано ли это с репарацией мембран клеток и ее органелл или обусловлено функционированием и размножением клеток, неповрежденных в процессе криовоздействия. Определенные результаты в этом отношении были получены в экспериментах на микроорганизмах. Было установлено [27l], что замораживание клеток Е. coli до -78С со скоростью Ю/мин и последующий отогрев приводит к повреждению всей популяции бактерий. Однако после их помещения в питательную среду, клетки репарировали и были способны образовывать колонии. Аналогичные данные были получены после действия низких температур на другие виды бактерий [312]. Недавно появились сведения о том, что в процессе репарации бактериальных клеток после замораживания до -196 С восстанавливаются барьерные свойства их мембран, что выражается в уменьшении чувствительности бактерий к воздействию детергентов и лизоцима [32]. Шгибиторы внутриклеточного синтеза белка, РНК, ДНК и мукопротеинов не предотвращали репарацию [32,270]. В то же время ингибиторы окислительного фосфорилирования (ДШ?, цианид, азид, олигомицин) в значительной степени подавляли восстановление барьерной функции бактериальных мембран [270]. Результаты этих исследований указывают на то, что развитие репаративных процессов после низкотемпературного воздействия тесно связано с функционированием митохондрий, однако их роль в указанных выше процессах до сих пор не исследована.
Ионная проницаемость митохондриальных мембран в норме и патологии
Как указывалось в предыдущем разделе, внутренняя мембрана митохондрий является не только местом локализации ферментов дыхательной цепи и синтеза АТР, но и служит барьером между двумя осмотическими отсеками: матриксом и цитоплазмой. Сохранение барьерной функции является обязательным условием для генерации трансмембранного протонного градиента и, соответственно, синтеза АТР и активного транспорта ионов [194,239].
Установлено, что разобщение окислительного фосфорилирова-ния в митохондриях, подвергнутых действию низких температур, сопровождается повышенной проницаемостью их внутренней мембраны для протонов [56,69,308]. Вместе с тем, изменение барьерной функции мембран для других ионов в этих условиях не исследовано. Изучение ионной проницаемости мембран митохондрий после замораживания-отогрева становится весьма актуальным, поскольку в настоящее время накоплены экспериментальные данные об индукции ионного транспорта при действии различных факторов, а также о влиянии на этот процесс метаболически активных соединений.
Так, при снижении рН среды инкубации [58,59,84,315], добавлении SH-реагентов [100,166,295], алкилирующих агентов [25, 72], тиреоидных гормонов [54,85,174], продуктов фосфолипазного гидролиза [54,168,274] и перекисного окисления [179,223] мемб 2+ ранных липидов, а также повышении концентрации фосфата и Са [103,133,276,330] увеличивается проницаемость внутренней мембра - 23 ны митохондрий для одно- и двухвалентных катионов. Ионный транспорт, индуцированный вышеперечисленными агентами, сопровождается увеличением скорости дыхания в состоянии 2, снижением величины мембранного потенциала, что обуславливает разобщение окислительного фосфорилирования.
Характерной особенностью процесса деэнергизации митохондрий при действии различных факторов, включая отрицательные температуры [7], является освобождение ионов Са . В настоящее время можно считать установленным, что митохондрии играют важную роль в распределении ионов Са в клетке, аккумулируя его в виде нерастворимых фосфатных комплексов - гидроксиапатитов [ИЗ, 155], 2IIJ. Транспорт Са в митохондрии сопровождается резкой активацией поглощения кислорода [lI9], изменением степени восстановленное переносчиков дыхательной цепи [l20] , снижением рН среды инкубации, вследствие освобождения из органелл протонов со стехио-метрическим коэффициентом ffVCa=2 [29,149,272]. Движущей силой для транспорта Са в митохондрии служит мембранный потенциал, имеющий отрицательный заряд на внутренней стороне мембраны [237, 238]. Захват катиона осуществляется при участии белкового переносчика [і85,І8б], конкурентно ингибируется трехвалентными катионами семейства лантана [244] и неконкурентно - рутениевым красным [92,170]. В присутствии рутениевого красного, когда вход Са + подавлен, катион медленно освобождается в среду в результате электронейтрального Са /гНҐ -обмена [І49,І70. На природных и искусственных мембранах показано, что роль Me п+/пН+-обменников могут выполнять производные мембранных фосфолипидов: жирные кис-лоты[118, 215,274], органические гидроперекиси [50,95,104].
Механизм выхода Са + из митохондрий не полностью выяснен. Экспериментальные данные свидетельствуют о различных путях за - 24 хвата катиона и его высвобождения, нечувствительного к рутению красному, но зависимого от фосфата [l49,I9I,277 . Вместе с тем, в некоторых условиях Ca может освобождаться в среду вследствие обращения унипортного переносчика [98,І02,І9Ї].
Техника и режимы замораживания-отогрева
Быстрое замораживание суспензии митохондрий, хранящейся в среде выделения без ЭДТА в полиэтиленовых ампулах объемом I мл на льду, проводили путем погружения в жидкий азот. Начальная скорость охлаждения составляла 400-500/мин (рис.1, начало охлаждения отмечено стрелкой I).
Медленное замораживание митохондрий проводили также в полиэтиленовых ампулах объемом I мл в парах азота с начальной скоростью 0,5-1,0/мин. Температура образца через 10-15 мин достигала -80 -100 С, т.е. температур, при которых фазовые переходы воды и мембранных липидов полностью завершены. После этого суспензию митохондрий охлаждали до -19бС, погружая ампулы в азот (рис.2.2).
При всех исследованных режимах замораживания митохондрии хранили при температуре жидкого азота (-І9бС) в течение 1-3 часов.
Отогрев проб осуществляли быстро на водяной бане при +40С до 0 +2С с начальной скоростью 500/мин (рис.1, начало отогрева отмечено стрелкой 2) или медленно на воздухе при комнатной температуре (рис.2.3.).
Замораживание-отогрев образцов контролировали с помощью медь-константановой термопары, ЭДС которой усиливали и записывали на потенциометре КСП-4.
Таким образом, в работе применялись следующие режимы крио-воздействия: быстрое замораживание-быстрый отогрев, быстрое замораживание-медленный отогрев, медленное замораживание- медленный отогрев, медленное замораживание-быстрый отогрев.
Изменение ионной проницаемости мембран митохондрий после действия низких температур
Согласно современным представлениям о механизме окислительного фосфорилирования [151,194] , внутренняя мембрана митохондрий служит барьером для одновалентных катионов. Сохранение барьерной функции является необходимым условием для образования на внутренней мембране электрохимического градиента протонов, который служит движущей силой синтеза энергии и активного транспорта ионов 237,241].
Как видно из рис.З нативные митохондрии не набухали в среде с нитратом аммония без субстрата в присутствии ротенона, предотвращающего окисление эндогенных субстратов в дыхательной цепи. Поскольку при нейтральных значениях рН анион Ш," свободно проникает через мембраны митохондрий [l09], скорость переноса ИН4+ лимитируется проницаемостью внутренней мембраны для Н [I08J. Таким образом, скорость набухания митохондрий в изотонической среде ira NO-j определяется величиной пассивного транспорта протонов. Внесение разобщителя, способного переносить ионы водорода через биомембраны [46,17б], приводило к набуханию митохондрий (рис.З).
После быстрого замораживания-быстрого отогрева протонная проводимость внутренней мембраны увеличивалась. Добавка разобщителя приводила к стимуляции скорости набухания (рис.З). Скорость набухания митохондрий после медленного замораживания-быстрого отогрева незначительно отличалась от скорости набухания после быстрого замораживания-быстрого отогрева. Добавка разобщителя также стимулировала протонную проводимость (рис.З). Влияние ФКШ на скорость набухания митохондрий после быстрого и медленного замораживания в сочетании с медленным отогревом уже не проявлялось, в связи с тем, что при таких режимах криовоздействия протонная проводимость возрастала в наибольшей степени (рис.З).
В изотоническом растворе ЮГО нативные митохондрии также не набухают из-за низкой проницаемости внутренней мембраны для К (рис.4). Добавка валиношцина приводила к быстрому набуханию митохондрий, вследствие электрогенного переноса К внутрь митохондрий [ІЗІ]. Сравнение режимов криовоздействия позволило установить, что К+-проводимость внутренней мембраны в меньшей степени изменяется после быстрого отогрева замороженных митохондрий
class5 Чувствительность ключевых ферментов системы окислительного фосфорилирования митохондрий к действию низких
температур class5
Влияние замораживания-отогрева на сукцинатдегидро-геназную и цитохромоксидазную активности митохондрий
Приведенные выше данные об увеличении цитохромоксидазной активности в присутствии экзогенного цитохрома с указывают на необходимость изучения действия низких температур на цитохром-ный участок дыхательной цепи.
На табл.б показано, что содержание цитохромов c+Cj в митохондриях, окисляющих сукцинат, незначительно снижалось после быстрого замораживания-быстрого отогрева, а после быстрого замо-раживания-медленного отогрева их концентрация уменьшалась на 2(Ж. В то же время, содержание цитохромов а/ад не изменялось после исследованных режимов криовоздействия.
При восстановлении ферментов дыхательной цепи не сукцина-том, а дитионитом значительных изменений в содержании как цито-хромов а/а3, так и с+ст выявлено не было (табл.7). Вместе с тем, сопоставление данных, приведенных в, табл.6 и 7, показывает, что содержание цитохромов c+Cj в присутствии сукцината несколько ниже, чем в присутствии дитионита, как в нативных, так и заморожен-но-отогретых митохондриях. Однако, если в нативных митохондриях разница между содержанием цитохромов с+Сх при их восстановлении дитионитом и сукцинатом составляла 10-15%, то после быстрого за-мораживания-быстрого отогрева эта разница возрастала до 20%, а после быстрого замораживания-медленного отогрева достигала 35%. Эти данные свидетельствуют об увеличении пула эндогенного цито-хрома с, не подвергающегося восстановлению при внесении в среду инкубации сукцината.
В работе [225] показано, что часть цитохрома с не связана с внутренней мембраной митохондрий. Этим, видимо, объясняются приведенные выше данные о том, что в нативных митохондриях содержание цитохромов с+Ст выше при восстановлении их дитионитом, чем в присутствии сукцината (табл.б,7).
Предполагают [iOl], что десорбированный с внутренней мембраны цитохром с может принимать участие в окислении внемито-хондриального НАДН по антимицин А-нечувствительному пути. Из табл.8 видно, что нативные митохондрии медленно окисляли экзогенный НАДН в присутствии ингибиторов дыхательной цепи (ротено-на и антимицина А). После действия низких температур активность внешнего пути окисления НАДН резко возрастала, причем после медленного отогрева замороженных митохондрий скорость окисления НАДН была незначительновыше, чем после быстрого.
