Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4
РАЗДЕЛ ПЕРВЫЙ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
ГЛАВА I. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О РОЛИ ПРОЦЕССОВ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ И ЗАХВАТА КАТЕХОЛАМИНОВ В АДРЕНЕРГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ 9
1.1. Высвобождение катехоламинов адренореак -тивными структурами II
1.2. Захват адренергических гормонов-медиаторов адренореактивными структурами .- 14
1.3. Температурная зависимость процессов захвата и высвобождения адренергических rojb монов-медиаторов 19
РАЗДЕЛ ВТОРОЙ. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1 32
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 32
2.1. Препаративные методы 32
2.2. Аналитические методы исследования 33
2.3. Техника и режимы замораживания 35
2.4. Характеристика использованных реактивов и препаратов 36
ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ОХЛАЖДЕНИЯ.ЗАМОРАЖИВАНИЯ И ОТОГРЕВА НА ЗАХВАТ ГОРМОНОВ-МЕДИАТОРОВ АДРЕНОРЕАКТИВНЫМИ СТРУКТУРАМИ 37
3.1. Характеристика процесса поглощения гормонов-медиаторов семявыносящим протоком
крыс после охлаждения.замораживания и отогрева
3.2. Захват Гн31 -норадреналина и Гн3]-адреналина предсердиями крыс после предварительного охлаждения,замораживания и отогрева 45
3.3. Исследование захвата катехоламинов срезами предсердий быка после температурных воздействий 49
ЗА. Исследование захвата адренергических гормонов-медиаторов щитовидной железой быка после температурных воздействий 66
ГЛАВА 4. ВЫСВОБОЖДЕНИЕ НОРАДРЕНАЛИНА АДРЕНОРЕАКГИВНЫМИ
СТРУКТУРАМИ ПОСЛЕ ИХ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО ОХЛАЖДЕНИЯ,
ЗАМОРАЖИВАНИЯ И ОТОГРЕВА 87
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 99
ВЫВОДЫ 105
ЛИТЕРАТУРА .
Введение к работе
В настоящее время накопился достаточно обширный фактичес -кий материал, посвященный раскрытию механизмов криоповреждений и криозащиты на различных уровнях биологической организации. В частности, на клеточном уровне было установлено значение повреждения мембранных структур клеток р 3,6,7 и каталитических систем Г27І, в восстановлении их структурно-функциональной полно -ценности после замораживания-отогрева. Это позволило использо -вать полученные данные при разработке методов криоконсервации и. трансплантации тканей и органов Г-ч-4,5,24Т, в том числе эндокринных тканей иб,47І, а также решить ряд вопросов, связанных с защитой биоматериалов от повреждающего действия холода.
Однако, в случае пересадок криоконсервированных тканей весьма важным является сохранение функциональной полноценности механизмов их регуляции и ауторегуляции [55], обладающих высо -кой чувствительностью к температурным воздействиям.
Способность биологических объектов к адаптивным перестрой -кам метаболизма в условиях охлаждения организма регулируется ги-поталамо-гипофизарно-надпочечниковой системой при непосредственном участии адренергических механизмов регуляции. Взаимодействие адренергических гормонов-медиаторов с клеткой представляет собой многоступенчатый процесс: высвобождение (секреция) гормона-ме -диатора, образование гормон-рецепторного комплекса и передача гормонального сигнала через мембрану,обратный захват гормона -медиатора.ферментативное превращение его .Нарушение любого из этих звеньев приводит к рассогласованию функционирования симпато-адреналовой системы,среди которых наиболее существенным является нарушение основных этапов адренергического медиаторного процесса - высвобождения, рецепции и захвата катехоламинов Г4І.
Состояние адренергических механизмов регуляции в условиях охлаждения, замораживания и отогрева до настоящего времени практически не изучено. В единичных работах показана высокая чувствительность процессов захвата и высвобождения катехоламинов, а также адренорецепторов к понижению температуры в зоне положительных значений [ЗО, ПО, 147,79,139].
Недостаточная изученность влияния холода на адренергичес-кие регуляторные механизмы препятствует более полной оценке механизмов криоповревдений и функциональной жизнеспособности тканей и органов,а также поиску оптимальных способов их криоконсервации.
Захват (активный процесс связывания и транспорта через био-лигическую мембрану) и высвобождение катехоламинов тесно связаны с функционированием мембран 14,92,1821 , липидный бислой которых претерпевает фазово-структурные переходы уже при физиологических температурах Гб,7, 200]. Если при этом учесть, что фазово-структурные перестройки липидов вызывают вертикальную и горизонтальную транслокацию белков, в том числе и гормон-чувствительных белков, участвующих в связывании и транспорте гормонов-медиаторов "20, 2б,195,1бз], то становится также достаточно очевидным реальность изменения этих структур в условиях охлаждения, замораживания и отогрева.
В связи с изложенным, представляется весьма актуальным изучение адаптивных регуляторных факторов на клеточном и тканевом уровнях как после действия пониженных положительных температур, так и после низкотемпературного замораживания биологических объектов .
Целью настоящей работы явилось изучение процессов захвата и высвобождения катехоламинов различными тканями животных, отличающимися типами адренергической иннервации и адренорецепторов в условиях охлаждения, замораживания и отогрева, а также поиск способов сохранности нейронального захвата норадреналина в условиях криоконсервации тканей и органов. В задачи исследования входило:
1. Изучить влияние предварительной экспозиции предсердий и семявыносящего протока крыс, срезов предсердий и щитовидной железы быка при температурах 37°С, 20°С, 4°С, 0°С, а также быстрого и медленного двухэтапного замораживания до -19б°С на процессы захвата и высвобождения катехоламинов.
2. Исследовать возможность защиты механизмов, обеспечивающих нейрональный захват норадреналина тканями животных криопро-текторами полиэтиленоксидом м.м. 400 (ПЭО-ШЗ), глицерином, ди-метилсульфоксидом (ДМСО).
Новизна работы определяется тем, что в настоящем исследовании впервые изучены последствия действия гипотермических условий и низких температур на процессы захвата и высвобождения катехоламинов тканями животных. На предсердиях и семявыносящем протоке крыс, срезах предсердий и щитовидной железы быка, наделенных разными типами симпатической иннервации и адренорецепторов, впервые показан однотипный характер ответной реакции адренергических регуляторних процессов на понижение температуры кратковременного хранения тканей до 0°С и замораживание до -196°С. Показано преимущество медленного двухэтапного замораживания тканей животных до -196°С по сравнению с быстрым для сохранности активного транспорта Гн3І-норадреналина в адренергические терминали. Исследована возможность защиты криопротекторами (ПЭО-400, глицерин,ДМСО) нейронального захвата норадреналина тканями крыс и быка. Определены наиболее благоприятные условия сохранения механизмов нейронального захвата норадреналина адренореактивными структурами в условиях охлаждения и замораживания до -196°С.
Теоретическое значение работы состоит в том, что количественные характеристики процессов захвата и высвобождения катехоламинов, их соотношение и динамика углубляют представления о температурной чувствительности основных этапов адренергического медиаторного процесса и механизмах их криоповреждений.Данное исследование показало перспективность изучения криочувствительности гормон-рецеп-торных взаимодействий.
Практическая значимость работы заключается в том,что установленные общие закономерности характера реакции процессов захвата катехоламинов тканями животных на охлаждение до 0°С и низкотемпературные воздействия расширяют круг критериев оценки функциональной активности криоконсервированных биологических объектов перед их трансплантацией.Показана принципиальная возможность сохранности адренергических механизмов регуляции в условиях криоконсервации тканей и органов.
Материалы диссертации доложены на 13 международных, всесоюзных и республиканских съездах, конференциях и симпозиумах и опубликованы в 20 печатных работах.
Выполненное исследование является частью плановых научных работ Института проблем криобиологии и криомедицины АН УССР (№№ государственной регистрации 77001366, 79015696).
В результате выполнения исследования сформулированы следующие положения, выносимые на защиту;
1. Захват катехоламинов тканями крыс и быка более чувствителен к температуре начала фазовых переходов липидов биологических мембран (20°С), чем к околонулевым температурам.
2. Медленное двухэтапное замораживание тканей животных до -196°С обеспечивает большую сохранность механизмов, осуществляю - 8 щих нейрональный захват норадреналина, чем быстрое.
3. Использование 5 % раствора ПЭО-400 при быстром замораживании семявыносящего протока крыс до -19б°С позволяет увеличить сохранность активного транспорта норадреналина в адренергические терминали до 80$; медленное двухэтапное замораживание срезов щитовидной железы быка с 10% ДМСО сохраняет нейрональный захват нор -адреналина до 98$.
