Введение к работе
Актуальность проблемы. Программированная клеточная смерть (ПКС) является фундаментальным биологическим процессом, позволяющим многоклеточным организмам удалять избыточные и поврежденные клетки. ПКС функционирует в процессе развития организма, участвует в ответе на стрессовые воздействия и играет защитную роль при инфекции патогенами. Наиболее изученной формой ПКС у животных является апоптоз, характеризующийся определенным набором морфологических и биохимических признаков. Ключевую роль в программированном самоубийстве клеток животных играют каспазы - семейство высокоспецифичных цистеиновых протеаз, активирующихся при апоптозе и вносящих единичные разрывы в молекулы ограниченного набора клеточных белков. Каспазы обладают исключительной специфичностью гидролиза, внося разрыв после остатка аспарагиновой кислоты (D), находящегося в определенном аминокислотном контексте. Направленная фрагментация белков-мишеней каспазами приводит в конечном счете к упорядоченной гибели клетки. И напротив, ингибирование каспаз препятствует осуществлению апоптоза.
В полном соответствии с названием «апоптоз» (от греч. «опадание листьев»), ПКС функционирует и в организмах растений и используется для тех же целей, что и у животных. Следует отметить, что молекулярные механизмы ПКС растений изучены существенно хуже, чем в случае апоптоза животных. Однако наличие ряда сходных черт в ПКС животных и растений позволяет предполагать, что при осуществлении ПКС организмы двух царств используют сходные принципы. В этой связи существенно и удивительно, что у растений, судя по результатам секвенирования растительных геномов, отсутствуют каспазы - основные исполнители ПКС животных. В то же время, имеются многочисленные данные о том, что ингибиторы каспаз животных способны подавлять развитие ПКС растений. В соответствии с этим, при ПКС растений часто наблюдается активация неидентифицированных «каспазо-подобных» протеаз, способных гидролизовать разнообразные пептидные субстраты каспаз. Эти результаты позволяют думать, что в осуществлении ПКС у растений задействованы протеазы, являющиеся функциональными аналогами каспаз животных, но структурно сильно отличающиеся от каспаз.
Какая протеаза играет роль каспаз животных при осуществлении ПКС у растений? Такой фермент был найден и охарактеризован в ходе выполнения данной диссертационной работы и получил название «фитаспаза» (растительная аспартат-специфичная протеаза).
Цель работы. Обнаружение, идентификация, выяснение структуры,
свойств и роли апоптотической протеазы растений - фитаспазы.
Задачи:
-
Исследовать поведение ядерного белка животных протимозина альфа в здоровых и апоптотических клетках человека и использовать полученные данные для разработки принципа поиска белков-субстратов каспаз.
-
Используя потенциальный белок-мишень фитаспазы, сконструировать репортерный белок, позволяющий детектировать активацию фитаспазы при ПКС и выделить фермент.
-
Определить субстратную специфичность фитаспазы.
-
Исследовать участие фитаспазы в осуществлении ПКС растений.
-
Идентифицировать фитаспазу и выяснить ее структурную организацию.
-
Определить пути активации фитаспазы.
-
Выяснить локализацию фитаспазы в здоровых и в апоптотических тканях растений.
-
Провести сравнительный анализ структуры и свойств апоптотических протеаз животных и растений.
Решение поставленных задач должно было позволить выявить и всесторонне охарактеризовать апоптотическую протеазу растений, являющуюся функциональным аналогом каспаз животных, и определить сходства и различия апоптотических протеаз животных и растений.
Научная новизна и практическая значимость. В структуре белка человека протимозина альфа идентифицирован сигнал ядерной локализации. Одной из выявленных ядерных функций протимозина альфа является участие в защите клеток от окислительного стресса.
Обнаружено, что в процессе апоптоза в клетках человека происходит фрагментация протимозина альфа каспазой. В результате гидролиза протимозин альфа теряет сигнал ядерной локализации и меняет свою внутриклеточную локализацию с ядерной на цитоплазматическую.
Биоинформатический поиск ядерных белков-субстратов каспаз, основанный на модели фрагментации протимозина каспазой, выявил белок VirD2 агробактерии Agrobacterium tumefaciens (патогена растений) в качестве потенциальной мишени каспаз. Экспериментально установлено, что белок VirD2 фрагментируется каспазой-3 человека и идентифицированы места гидролиза.
Используя принцип изменения внутриклеточной локализации белка вследствие фрагментации каспазой, выявленный на примере протимозина альфа, мы обнаружили активацию фитаспазы при индукции ПКС в листьях табака. Показано, что фитаспаза гидролизует белок VirD2 после остатка D в том же месте, что и каспаза-3 человека. Фитаспаза выявлена у широкого круга растительных организмов.
Разработана процедура выделения фитаспазы из растительных экстрактов. Фитаспазы табака и риса получены в индивидуальном состоянии. Определена субстратная специфичность фитаспаз, показавшая, что эти
растительные ферменты, как и каспазы, гидролизуют субстраты строго после остатка D в благоприятном аминокислотном контексте.
Установлена роль фитаспазы в осуществлении ПКС, вызванной как биотическим (вирусная инфекция), так и абиотическими стрессами (окислительный и осмотический стресс).
Фитаспазы табака и риса идентифицированы как субтилизин-подобные (сериновые) протеазы растений.
Активация фитаспазы происходит путем автокаталитического процессинга профермента в соответствии со специфичностью фитаспазы. Отщепление продомена необходимо для образования активной фитаспазы и для ее секреции.
В здоровых листьях растений фитаспаза накапливается в межклеточной жидкости (апопласте), куда направляется N-концевым сигнальным пептидом профермента. Индукция ПКС сопровождается перемещением фитаспазы из апопласта внутрь умирающей клетки.
Фрагментация агробактериального белка VirD2 фитаспазой является защитным механизмом, препятствующим доставке чужеродной ДНК в ядро растительной клетки.
Таким образом, у растений идентифицирован и охарактеризован новый тип протеаз, являющихся функциональными аналогами каспаз животных, и выявлены свойства апоптотических протеаз, специфичные для растений.
Все результаты диссертационной работы получены впервые.
Результаты работы опубликованы в виде 15 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых научных журналах, 1 главы в книге и 1 международного патента.
Работа была поддержана грантами РФФИ, Королевского общества Великобритании, CRDF.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференциях: Bilateral German-Russia Symposium, October 15-18, 2006, Titisee, Germany; VI Съезде общества физиологов растений России, 18-24 июня 2007 г., Сыктывкар; International Biochemistry and Molecular Biology Mini-Symposium, May 5-7, 2007, Tainan, Taiwan; IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11 -15 мая 2008, Новосибирск; Russia-German Bilateral Symposium "Molecular Biomedicine", 29 мая-2 июня 2008, Санкт-Петербург; The 1st International Conference on Plant Proteases, April 10-14, 2011, Hemavan, Sweden.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 202 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, выводы, список литературы. Материал иллюстрирован 74 рисунками и 3 таблицами. Библиографический указатель включает 206 цитированных работ.
