Содержание к диссертации
Введение
1. Ингибиторы интегразы вируса иммунодефицита человека и механизм их действия/обзор литературы/ 8
1.1. Интеграза ВИЧ-1: строение и функции 10
1.2. Ингибиторы интегразы ВИЧ-1 15
1.2.1. Низкомолекулярные ингибиторы 15
1.2.1.1. Производные дикетокислот 15
1.2.1.2. Производные нафтиридина 23
1.2.1.3. Стирилхинолиновые ингибиторы 26
1.2.1.4. L-цикориевая кислота и ее производные 33
1.2.1.5. Производные гидроксикумарина 37
1.2.2. Пептиды и антитела 40
1.2.3. Олигонуклеотиды 48
2. Интеграза ВИЧ-1: ингибирование каталитической активности модифицированными олигонуклеотидами /результаты и обсуждение/ 52
2.1. Оптимизация структуры олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1 55
2.1.1. Оптимизация структуры ненуклеотидной части олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1 55
2.1.1.1. Дизайн и синтез конъюгатов 55
2.1.1.2. Влияние структуры ненуклеотидной части конъюгата на его ингибирующую активность 58
2.1.1.3. Влияние положения ненуклеотидной части в структуре конъюгата на его
ингибирующую активность 62
2.1.2. Оптимизация структуры нуклеотидной части ингибитора интегразы ВИЧ-1 63
2.1.2.1. Влияние длины олигонуклеотида на ингибирующую активность конъюгата 63
2.1.2.2. Влияние модификаций углеводо-фосфатного остова олигонуклеотида на ингибирующую активность его конъюгатов 64
2.1.3. Влияние олигонуклеотидных конъюгатов на активность некоторых ДНК-связывающих ферментов 67
2.1.4. Проверка ингибирующей активности конъюгатов 2'-0-метил-олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой 71
2.2. Механизм действия олигонуклеотидных конъюгатов. Определение участка связывания ингибитора 74
2.2.1. Действие олигонуклеотидных конъюгатов на устойчивость комплекса интегразы ВИЧ-1 с ДНК 74
2.2.2. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе ВИЧ-1 и определение участка связывания 76
2.2.2.1. Дизайн и синтез олигонуклеотидных ингибиторов, содержащих 2,3-ДИгидроксипропильную группировку при 2'-0-атоме уридина 78
2.2.2.2. Оптимизация условий ковалентного присоединения ингибитора к интегразе 79
2.2.2.3. Получение препаративного количества ковалентно связанного комплекса ингибитора T2-F1 с интегразой, его триптический гидролиз и подготовка продуктов гидролиза к масс-спектрометрическому анализу 83
2.2.2.4. Масс-спектрометрический анализ продуктов триптического гидролиза ковалентно связанного комплекса ингибитора с интегразой 86
2.3. Доставка олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1 в клетки 93
2.3.1. Оптимизация условий формирования комплексов олигонуклеотидного ингибитора с носителями 94
2.3.2. Проникновение олигонуклеотидного ингибитора в клетки 97
2.3.2.1. Трансфекция клеток комплексами олигонуклеотидного ингибитора с пептидными носителями 97
2.3.2.2. Трансфекция клеток комплексом олигонуклеотидного ингибитора с pDMAEMA 102
Тестирование противовирусной активности олигонуклеотидных ингибиторов на ВИЧ-инфицированных клетках 104
3. Экспериментальная часть 107
3.1. Реактивы иматериалы
3.1.1. Реактивы 107
3.1.2. Ферменты 107
3.1.3. Олигонуклеотиды 108
3.1.4. Буферные растворы 109
3.2. Методы 109
3.2.1. Синтез конъюгатов олигонуклеотида с флуоресцеином, эозином и тетраметилродамином 112
3.2.2. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность интегразы ВИЧ-1 113
3.2.3. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность фрагмента Кленова 115
3.2.4. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность эндонуклеазы рестрикции Msp 9RI 116
3.2.5. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность мутантов интегразы ВИЧ-1 117
3.2.6. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность интегразы ПВЧ 117
3.2.7. Изучение действия олигонуклеотидных конъюгатов на устойчивость комплекса интегразы ВИЧ-1 с ДНК 118
3.2.8. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе ВИЧ-1 и определение участка связывания 118
3.2.9. Изучение проникновения олигонуклеотидного конъюгата в клетки 122
Приложение 125
Выводы 132
Литература
- Низкомолекулярные ингибиторы
- Оптимизация структуры ненуклеотидной части олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1
- Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе ВИЧ-1 и определение участка связывания
- Синтез конъюгатов олигонуклеотида с флуоресцеином, эозином и тетраметилродамином
Введение к работе
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) поражает иммунную систему и вызывает одно из опаснейших заболеваний - синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). По оценкам всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), на начало 2006 года число людей, зараженных ВИЧ, во всем мире составляло 38,6 миллиона человек (рис.1) [1]. Число людей, заразившихся ВИЧ в 2005 году, составило 4,1 миллиона человек, и 2,8 миллиона человек умерли от СПИДа. В Российской Федерации с момента начала эпидемии и до начала 2006 года официально было зарегистрировано около 350 000 случаев ВИЧ-инфекции. Однако фактическое число людей, живущих в России с ВИЧ-инфекцией намного выше. По различным оценкам, их количество на начало 2006 года составляет от 560000 до 1,6 миллиона человек.
Показатель распространенности сради аарослых
15,04-34,0% Q 1.0%х5.0% D 0.1%-сО,5%
5.0%-<15.0Ч аО,5К-<1.0* О «0,1%
Рис. 1. Глобальная картина ВИЧ-инфекции по данным ВОЗ (на начало 2006 года) [1],
До начала применения первых коммерчески доступных лекарственных препаратов против СПИДа продолжительность жизни больных составляла не более одного года. Используемая в настоящее время комплексная терапия HAART (highly active antiretroviral therapy) позволяет продлить время жизни больных СПИДом до 8 лет [2]. Данный вид терапии включает лекарственные препараты, направленные на подавление трех стадий репликативного цикла ВИЧ: обратной транскритщии, протеолитического созревания и слияния вирусной частицы с клеткой. Необходимость использования комплексной терапии обусловлена быстрой эволюцией ВИЧ, которая приводит к появлению устойчивых к препаратам форм вируса. Несмотря на то, что
HAART-терапия рассматривается как наиболее действенная и доступная на сегодняшний день, ее применение приводит к желаемому снижению уровня инфекции только у 50-90% наблюдаемых больных. Она так же не позволяет полностью остановить репликацию ВИЧ. Кроме того, часто возникают проблемы с доступностью препаратов, применяемых в HAART-терапии, их токсичностью и восприимчивостью организмом инфицированного человека. По этим причинам в настоящее время продолжается активный поиск как новых ингибиторов указанных выше стадий репликативного цикла ВИЧ, так и соединений, нарушающих другие стадии цикла вируса и способных дополнить существующую противовирусную терапию.
Большое внимание уделяется разработке ингибиторов стадии интеграции. В ходе собственного воспроизводства вирус использует ресурсы клетки, для чего ему необходимо встроить (интегрировать) ДНК-копию своего генома в геном зараженной клетки. Этот процесс осуществляет вирусный фермент интеграза. Показано, что вирус, содержащий дефектную интегразу, не способную осуществлять интеграцию вирусной ДНК, не размножается в культуре клеток [3]. Это говорит о ключевой роли стадии интеграции в репликативном цикле ВИЧ. Кроме того, остановка репликации вируса при нарушении функций интегразы свидетельствует также о том, что клетка не содержит каких-либо собственных ферментов, способных катализировать интеграцию. В связи с этим, ингибиторы, специфично подавляющие каталитическую активность интегразы, не должны влиять на другие клеточные процессы и, как следствие, должны быть менее токсичны для клетки и всего организма в целом по сравнению с ингибиторами других стадий репликативного цикла ВИЧ. Но, несмотря на всю привлекательность интегразы в качестве мишени для противовирусных препаратов, на сегодняшний день нет ни одного соединения - ингибитора интегразы, которое бы успешно прошло все клинические испытания и было бы предложено как лекарственное средство против СПИДа. Большинство известных на сегодняшний день ингибиторов интегразы, в том числе и ингибиторы, находящиеся на стадии клинических испытаний, взаимодействуют с ионом магния, связанным в активном центре фермента. Однако уже показано, что применение этих ингибиторов приводит к быстрому появлению устойчивых к их действию форм фермента, содержащих мутации в активном центре. Кроме того, такие ингибиторы способны влиять на активность клеточных ферментов, относящихся к тому же семейству, что и интеграза, и использующих при катализе ионы магния, например, V(D)J RAG рекомбиназы, которые необходимы для нормального синтеза антител в организме. В этой связи крайне актуальным является поиск новых соединений, способных подавлять каталитическую активность интегразы, и в том числе ингибиторов с новым механизмом действия.
Целью настоящей работы стала разработка эффективных, специфичных и нецитотоксичных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 на основе модифицированных олигонуклеотидов. В ходе работы был осуществлен синтез серии конъюгатов коротких одноцепочечных олигонуклеотидов с гидрофобными соединениями различной структуры и исследовано их действие на активность интегразы ВИЧ-1. Показано, что наиболее эффективными ингибиторами являются конъюгаты 11-звенных олигонуклеотидов с эозином и олеиновой кислотой. Эти соединения подавляют обе стадии интеграции: З'-процессинг и перенос цепи. Кроме того, было исследовано влияние длины олигонуклеотида и структуры его углеводо-фосфатного остова на ингибирующую активность конъюгатов. По результатам исследований, для ингибирования интегразы ВИЧ-1 in vivo предложены конъюгаты 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином или олеиновой кислотой.
Для того чтобы понять механизм действия предложенных нами ингибиторов, мы изучили их действие на комплекс интегразы с ДНК-субстратом - U5 фрагментом ДНК ВИЧ. Установлено, что действие ингибиторов на основе модифицированных олигонуклеотидов направленно на разрушение комплекса интегразы с вирусной ДНК. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе с последующим масс-спектрометрическим анализом продуктов триптического гидролиза ковалентно связанного комплекса позволило идентифицировать участок фермента, с которым взаимодействует ингибитор. Показано, что он локализован в С-концевом домене интегразы. Высокая активность олигонуклеотидных конъюгатов как ингибиторов интегразы ВИЧ-1 свидетельствует о важности данного участка в функционировании фермента. Полученная информация может быть использована для дизайна новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1.
Для тестирования противовирусной активности предлагаемых нами ингибиторов на ВИЧ-инфицированных клетках мы подобрали носители, обеспечивающие эффективную доставку олигонуклеотидных конъюгатов в ядра клеток. В сотрудничестве с университетом г. Левен (Бельгия) показано, что конъюгаты 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой ингибируют репликацию ВИЧ-1 в инфицированных клетках.
Работа включает обзор литературы, посвященный основным классам ингибиторов интегразы ВИЧ-1 и механизмам их действия.
Низкомолекулярные ингибиторы
Среди ингибиторов интегразы ВИЧ-l основную часть составляют низкомолекулярные соединения [10, 11, 12, 13, 15, 16]. Каталитическую активность интегразы ВИЧ-1 способны подавлять гидроксилированные ароматические соединения, флавоны и флавоноиды, производные кофеиновой кислоты (САРЕ), ариламиды, стирилхинолины, сульфоны и сульфонаты, куркумин и его производные, тирфостины, депсиды и депсидоны, тиазолотиазепины, терпеноиды, производные дикетокислот и др. Механизм действия большинства из них остается неизвестным. Наиболее часто предполагают взаимодействие ингибитора с каталитическим доменом интегразы, в частности, с ее активным центром, и ингибирующую активность соединения связывают с координацией ионов-кофакторов.
Мы рассмотрим несколько классов низкомолекулярных соединений, представители которых являются наиболее активными ингибиторами интегразы, и чей механизм действия изучен более детально.
Тестирование в качестве ингибиторов интегразы ВИЧ-l библиотеки соединений, состоящей из 250000 образцов, выявило ряд наиболее активных из них. Все данные соединения являлись производными дикетокислот и проявляли большую активность при ингибировании реакции переноса цепи, нежели при ингибировании 3 процессинга. Это позволило объединить их в одну группу и говорить о новом классе специфичных к переносу цепи ингибиторов интегразы [46]. Значения IC50 в реакции переноса цепи с использованием рекомбинантной интегразы для наиболее активных представителей этого класса ингибиторов - L-731,988 и L-708,906 (табл. 1) -составляли соответственно 80 и 150 нМ, а в реакции 3 -процессинга - 6 мкМ и более 1мМ [46]. При этом активность, которую данные соединений проявляли in vitro, была сопоставима с их активностью при ингабировании прединтеграционного комплекса (табл. 1). Кроме того, производные дикетокислот подавляли и репликацию вируса в культуре клеток, значения IC50 для L-731,988 и L-708,906 в экспериментах на клетках составляли 1 и 2 мкМ.
Селекция устойчивых к действию дикетокислот штаммов вируса и последующее определение места мутации подтвердили, что репликация вируса подавляется именно на стадии интеграции [46]. Интеграза устойчивого к действию L-731,988 штамма содержала замену Metl54Ile, а интеграза устойчивого к L-708,906 штамма несла мутацию ТЬгббИе, а также либо Metl54Ile, либо Serl53Tyr. На основании того, что интегразы устойчивых штаммов содержали мутации аминокислотных остатков в непосредственной близости от двух аминокислотных остатков, входящих в каталитическую триаду интегразы, а именно от Asp64 и Glul52, было предположено, что дикетокислоты взаимодействуют с активным центром фермента либо с его непосредственным окружением [46].
Практически одновременно с информацией о дикетокислотах появились данные о другом ингибиторе интегразы - 1-(5-хлороиндол-3-ил)-3-гидрокси-3-(2Н-тетразол-5 ил)-пропеноне (5CITEP) (рис. 5) [47]. Авторам удалось определить структуру каталитического домена интегразы, закристаллизованного в присутствии ингибитора 5С1ТЕР. Рентгено-структурный анализ показал, что ингибитор лежит в активном центре фермента между аминокислотными остатками каталитической триады - Asp64, Aspll6 и Glul52. Согласно карте электронной плотности, 5CITEP образовывал ряд контактов с аминокислотными остатками интегразы, важными для осуществления каталитического акта и ДНК-связывания. Так Glul52 находился на расстоянии водородной связи от енольного гидроксила 5СГТЕР. Кроме того, было возможно образование водородных связей между G!nl48 и атомом азота индольного кольца 5СГТЕР, между Asnl55, Thr66, Lysl59, Lysl56 и атомами азота тетразольного кольца 5CITEP. Прямых контактов с двумя другими аминокислотными остатками каталитической триады Asp 64 и Aspl 16 обнаружено не было.
Полученные структурные данные представляли большой интерес для понимания механизма действия 5СГГЕР и дикетокислот в целом, поскольку ряд исследований свидетельствовал в пользу того, что эти соединения могут быть отнесены к одному и тому же классу ингибиторов интегразы. 5CITEP, как и дикетокислоты, проявлял большую ингибирующую активность в реакции переноса цепи [48, 49]. Об общем участке связывания для дикетокислот и 5CITEP говорили как эксперименты по конкурентному связыванию ингибиторов с интегразой [48], так и сравнение данных
структурного анализа каталитического домена фермента с 5СІТЕР с данными по мутациям в структуре интегразы устойчивых к дикетокислотам штаммов вируса.
Для того чтобы понять механизм действия дикетокислот было изучено взаимодействие ингибитора L-731,988 с интегразой [50]. Показано, что ингибитор не взаимодействует с изолированным ферментом вплоть до микромолярных концентраций. Для его связывания с интегразой необходимо присутствие ДНК-субстрата - U5 или U3 концевых последовательностей вирусной ДНК. При этом Kd комплекса интегразы с L-731,988, определенная в присутствии 100 нМ 115-субстрата, составляла 75 нМ, что коррелировало со значением ICso в реакции переноса цепи. Неспецифическая ДНК, а также ДНК-субстрат для реакции дезынтеграции не стимулировали взаимодействие ингибитора с ферментом. Кроме того, увеличение концентрации субстратной ДНК, избыток которой мог выступать в качестве ДНК-мишени, приводило к уменьшению связывания ингибитора с интегразой. На основании полученных данных авторы предположили, что ингибитор L-731,988 подавляет реакцию переноса цепи, конкурируя с ДНК-мишенью за место ее связывания, причем для взаимодействия ингибитора с интегразой необходима конформация активного фермент-субстратного комплекса [50].
Кристаллизацию каталитического домена интегразы с 5CITEP осуществляли в отсутствие ДНК-субстрата, что говорило о способности этого ингибитора связываться с изолированным ферментом в отличие от дикетокислоты L-731,988. Возможно, что возникшее противоречие связано с использованием при кристаллизации лишь одного домена фермента, структура которого в составе полноразмерной интегразы может отличаться.
Для того чтобы понять роль тех или иных структурных мотивов дикетокислот и 5CITEP в их связывании с ферментом и его ингибировании, была изучена активность ряда производных этих соединений [5, 48, 49]. Были синтезированы аналог L-731,988, в котором карбоксильная группа была заменена на тетразольное кольцо - DKA 1, и аналог 5CITEP, тетразольную группу которого заменили на карбоксильную группу -DKA 2 (табл. 2) [48]. Исследования показали, что карбоксильные производные проявляют большую ингибирующую активность, чем тетразольные производные, причем различия в их активности наиболее значительны при использовании в качестве кофактора интегразы ионов Mg2+.
Оптимизация структуры ненуклеотидной части олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1
Наряду с низкомолекулярными соединениями и соединениями пептидной природы в качестве ингибиторов интеграции ВИЧ-1 используются олигонуклеотиды. Как обсуждалось в обзоре литературы, соединения данного класса могут быть наиболее специфичными ингибиторами интеграции, поскольку субстратом интегразы является именно ДНК. Кроме того, олигонуклеотиды могут обладать меньшей токсичностью по сравнению с низкомолекулярными соединениями и, в отличие от ингибиторов пептидной природы, не вызывать иммунного ответа организма.
Из обзора литературы следует, что одно- и двуцепочечные олигонуклеотиды могут взаимодействовать с интегразой ВИЧ-1 и ингибировать ее каталитическую активность [108, 109, 110]. Эффективность ингибирующего действия зависит от длины и последовательности олигонуклеотидов и ДНК-дуплексов [ПО]. В частности, олигонуклеотиды, последовательности которых соответствуют участкам узнавания интегразы в вирусной ДНК (субстратоподобные), обладают большим сродством к ферменту по сравнению с олигонуклеотидами произвольной последовательности При этом об эффективном ингибировании можно говорить только в случае протяженных олигонуклеотидов с длиной не менее 20 звеньев [109,110]. Однако трудно представить, что ингибиторы на основе протяженных олигонуклеотидов будут селективны в клетке, содержащей большое количество ДНК-связывающих белков.
Введение модификаций в структуру олигонуклеотида: присоединение к олигонуклеотиду молекулы акридина или введение в его структуру модифицированного гетероциклического основания, оксоцитозина, - позволило использовать для ингибирования интегразы in vitro одноцепоченые 11-звенные олигонуклеотиды [114,115]. Показано, что такие модифицированные олигонуклеотиды ингибируют интегразу в реакциях З -процессинга и переноса цепи, вызывая разрушение комплекса фермента с субстратом - вирусной ДНК. В случае субстратоподобных олигонуклеотидов и ДНК-дуплексов предполагают конкурентный механизм действия [108, НО]. Считается, что они связываются с активным центром интегразы и, таким образом, препятствуют взаимодействию фермента с ДНК субстратом и проведению реакции З -концевого процессинга [108]. Короткие модифицированные олигонуклеотиды проявляют ингибирующую активность как в условиях конкурентного связывания с ДНК-субстратом, так и при действии на пресформированный фермент-субстратный комплекс. В связи с этим было высказано предположение, что взаимодействие с интегразой ингибиторов на основе коротких модифицированных олигонуклеотидов происходит в месте, отличном от активного центра фермента, и приводит к нарушению способности интегразы связывать ДНК [115, 112]. Причем, в случае конъюгатов олигонуклеотидов с акридином, их способность нарушать ДНК-связывающую функцию интегразы обусловлена взаимосвязанным действием обоих составляющих конъюгата. Немодифицированные 11-звенные олигонуклеотиды ингибируют интегразу при более высоких концентрациях (IC50 для олигонуклеотидов 10-45 мкМ), чем их конъюгаты с акридином (/Cso 2.5-5 мкМ), и практически не способны вызывать диссоциацию комплекса интегразы с ДНК [115]. Тоже самое верно и для акридина (IC50 90 мкМ). Предполагают, что отрицательно заряженный олигонуклеотид взаимодействует с интегразой за счет образования электростатических контактов, в то время как акридин формирует гидрофобные контакты с некоторым гидрофобным участком фермента. Образование дополнительных контактов со стороны акридина способствует фиксации ингибитора на поверхности фермента, что, в свою очередь, вызывает конформационные изменения в структуре интегразы, которые и приводят к нарушению связывания ДНК и диссоциации фермент-субстратного комплекса.
Таким образом, на сегодняшний день короткие модифицированные олигонуклеотиды являются единственными ингибиторами интеграции, вызывающими разрушение комплекса интегразы с вирусной ДНК. Учитывая тот факт, что именно этот комплекс считается основной мишенью ингибиторов интегразы in vivo, соединения, способные подавлять его каталитическую активность, рассматриваются как наиболее перспективные препараты. В связи с этим мы решили продолжить более детальное изучение механизма действия модифицированных олигонуклеотидов, а также постараться увеличить их ингибирующую активность. В качестве объектов исследования были выбраны конъюгаты олигонуклеотидов, поскольку в нашей лаборатории накоплен богатый опыт по синтезу таких соединений, позволяющий существенно изменять их свойства за счет модификации каждой составляющей конъюгата. Нам необходимо было заменить молекулу акридина на другой остаток, который, с одной стороны, был бы существенно менее токсичен, а с другой, увеличивал бы ингибирующее действие конъюгата. Кроме того, следовало повысить устойчивость олигонуклеотидной части конъюгата к нуклеазному гидролизу для того, чтобы иметь возможность исследовать активность конъюгатов в экспериментах на ВИЧ-инфицированных культурах клеток Необходимо было также подобрать подходящий носитель для эффективной доставки ингибиторов в клетки. Важной задачей нашей работы было также изучение механизма ингибирования интегразы и установление участка фермента, с которым взаимодействует ингибитор.
Для наших исследований мы выбрали ll-звенный олигодезоксирибонуклеотид следующего состава: поскольку его конъюгат с акридином обладал наибольшей ингибирующей активностью по сравнению с конъюгатами олигонуклеотидов других последовательностей [115].
Прежде всего, нам было необходимо подобрать замену цитотоксичной молекуле акридина. Следовало найти такую молекулу, которая была бы нетоксична для клетки, и введение которой в состав конъюгата с олигонуклеотидом сохраняло или усиливало бы его способность разрушать комплекс интегразы с ДНК. Как уже отмечалось выше, мы предполагаем, что акридин в составе конъюгата образует с интегразой гидрофобные контакты. По этой причине, для синтеза конъюгатов олигонуклеотида 11-D мы выбрали такие гидрофобные соединения, как флуоресцеин (FI), эозин (), тетраметилродамин (R), холестерин (Choi), тиохром (Th) и олеиновая кислота (01) (рис 21). Молекулы флуоресцеина, эозина и тетраметилродамина, как и молекула акридина, содержат в своей структуре конденсированную ароматическую систему. Ее присутствие в структуре конъюгата может сохранить те его контакты с интегразой, которые необходимы для ингибирования фермента
Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе ВИЧ-1 и определение участка связывания
Как отмечалось выше, для акридиновых конъюгатов было высказано предположение об их связывании с интегразой в месте, отличном от активного центра фермента, и о разрушении фермент-субстратного комплекса за счет конформационных изменений в структуре интегразы, вызванных взаимодействием с олигонуклеотидным конъюгатом. Прямых доказательств такого механизма действия олигонуклеотидных ингибиторов получено не было. Для того чтобы идентифицировать участок фермента, с которым взаимодействует олигонуклеотидный ингибитор, мы решили осуществить его ковалентное присоединение к интегразе, подвергнуть полученный продукт протеолитическому гидролизу, выделить конъюгат ингибитора с пептидом и определить его массу с помощью масс-спектрометрии.
В настоящее время метод ковалентного связывания белков с нуклеиновыми кислотами широко используется для изучения ДНК-белковых взаимодействий [129]. Для ковалентного связывания олигонуклеотидного ингибитора с интегразой мы остановили свой выбор на химическом методе присоединения, основанном на введении реакционноспособной группы в состав нуклеиновой кислоты. Как неоднократно отмечалось выше, предполагается, что отрицательно заряженная олигонуклеотидная часть ингибитора взаимодействует с интегразой за счет образования, главным образом, электростатических контактов с положительно заряженными остатками Lys и Arg. Известно, что первичная структура интегразы содержит большое число остатков лизина - 26 из 288 аминокислот. В связи с этим, вероятность успешного присоединения ингибитора к лизину в составе интегразы была достаточно высока. Для осуществления ковалентного присоединения ДНК к остатку лизина в составе белка в качестве реакционноспособной группировки, вводимой в состав ДНК, хорошо подходит альдегидная группа. Известны примеры получения ДНК-белковых конъюгатов восстановлением имина, образующегося при взаимодействии остатков лизина с 2-дезоксирибонолактоновыми звеньями [130, 131], альдегидной группой, возникающей в результате ферментативного образования АР-сайтов [132,133] или 2 ,3 -диальдегидной группировкой, получаемой при окислении остатка рибозы [134,135].
В нашей лаборатории был разработан метод синтеза олигонуклеотидов, содержащих 2-оксоэтильную группировку при 2 0-атоме в составе модифицированного уридина или цитидина (соединение 2, рис. 30) [136, 137]. В процессе автоматического синтеза в любое положение олигонуклеотидной цепи вводится модифицированный уридин или цитидин, содержащий 2,3-дигидроксипропильную группировку (соединение 1, рис. 30). Данная группировка может быть окислена до альдегидной группы в мягких Олигонуклеотиды, содержащие 2-оксоэтильную группировку при 2 0-атоме, способны реагировать с различными аминосоединениями, в том числе и с Е-аминогруплами остатков лизина. При этом исключается возможность протекания побочной реакции Р-элиминирования с разрывом межнуклеотидной связи, имеющей место в случае использования диальдегидных производных олигонуклеотидов [134, 135, 138]. Примеры использования олигонуклеотидов с 2-оксоэтильной групгшровой для ковалентного присоединения ДНК к фактору транскрипции NF-кВ И эндонуклеазе рестрикции SsoII демонстрируют высокие выходы продуктов присоединения (10-20%) [139, 140]. Кроме того, небольшой размер 2 -0-(2-оксоэтильного) остатка позволяет предполагать, что в образовании ковалентной связи с олигонуклеотидом будет задействована є-аминогруппам максимально сближенного с ним лизина Важно отметить, что аминокислотные остатки аргинина не способны образовывать ковалентную связь с альдегидной группой в составе олигонуклеотида.
Для осуществления ковалентного присоединения к интегразе были синтезированы олигонуклеотидные ингибиторы, содержащие 2,3 дигидроксипропильную группировку. Поскольку мы не обладали какой-либо информацией о том, с каким из нуклеотидов может быть сближен остаток лизина, то мы выбрали два положения в структуре олигонуклеотида, в которые были введены модифицированные звенья. В структуре олигонуклеотида Т1 нуклеотид с 2,3-дигидроксипропильной группировкой (I/ ) располагался вблизи 5 -конца, а в случае олигонуклеотида Т2 - вблизи его 3 -конца и гидрофобной молекулы, входящей в состав конъюгата.
В качестве ненуклеотидной компоненты конъюгата была выбрана молекула флуоресцеина в связи с доступностью реагента, простотой синтеза конъюгата и его достаточно высокой ингабирующей активностью. Присоединение флуоресцеина к олигонуклеотидам, содержащим 2,3-дигидроксипропильную группировку, проводили согласно схеме на рисунке 22.
Синтез конъюгатов олигонуклеотида с флуоресцеином, эозином и тетраметилродамином
В исследованиях, проводимых в культуре клеток, обычно не удается обнаружить активности олигонуклеотидов, если не обеспечить их эффективную доставку в клетку. Одним из способов, позволяющим улучшить транспорт олигонуклеотидов через клеточную мембрану, является использование носителей, образующих с олигонуклеотидами комплексы за счет электростатических взаимодействий. В качестве таких носителей применяют соединения различной природы: пептидные конструкции, липосомы, синтетические полимеры и дендримеры [145, 146, 147] и др. При выборе носителя для внутриклеточного транспорта олигонуклеотидов необходимо учитывать ряд факторов, таких как: эффективность доставки олигонуклеотидов в цитоплазму и ядро с помощью носителя, его цитотоксичность, доступность, стоимость, а также простоту приготовления его комплекса с олигонуклеотидом.
В нашем распоряжении было два типа носителей: синтетический полимер полидиметиламиноэтил-метакрилат (pDMAEMA), синтезированный в научной группе к х.н. Н.С. Мелик-Нубарова (кафедра ВМС химического факультета МГУ) и ряд носителей пептидной природы, любезно предоставленные нам доктором Ж. Дивита (отдел биофизики Центра исследований биохимии макромолекул, Монпелье, Франция) в рамках сотруднечества по проекту 6-ой рамочной программы Европейского Сообщества. pDMAEMA (рис. 40) является _и _„ , ч упз -Вг водорастворимым катионным полимером, I _ -СН2-С— способным образовывать с ДНК комплексы за счет rnnu О С электростатических взаимодействий. Показано, что О такие комплексы проникают в клетку по механизму эндоцитоза [148, 149, 150, 151]. Эффективность HN проникновения зависит от молекулярной массы пзи J полимера (степени полимеризации) и соотношения ДНК/полимер в комплексе. В нашем случае степень Рис. 40. Строение pDMAEMA. полимеризации п составляла 100 звеньев.
Одним из пептидных векторов был специально сконструированный 27-звенный пептид MPG, следующего строения: Ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV NHCH2CH2SH. Его гидрофобный N-конец содержит фрагмент белка gp41 ВИЧ-1, ответственный за его слияние с клеточной мембраной, а гидрофильный С-конец включает фрагмент Т-антигена вируса SV-40, ответственный за ядерную локализацию [152]. Данный вектор ранее использовали для доставки в клетку как одноцепочечных олигонуклеотидов, так и плазмидных ДНК [153]. Показано, что олигонуклеотиды в комплексе с MPG менее, чем за 1 час, с эффективностью 90% проникают в клетки различных клеточных линий и локализуются преимущественно в ядре. Поскольку эффективность доставки олигонуклеотидов в клетки с помощью MPG одинакова при температурах 4 С и 37 С, то предполагают, что их проникновение протекает по механизму, отличному от эндоцитоза. Возможно, что процесс проникновения включает формирование пептидом при взаимодействии с липидами клеточной мембраны пороподобной структуры [154].
Структура второго пептидного вектора, называемого далее Пептид 1, включает 21 аминокислотный остаток: KETWFETWFTEWSQPKKKRKV. Данный пептид был разработан для доставки в клетки незаряженных или слабо заряженных ПНК [155]
Структура третьего вектора, Пептида 2, в настоящее время является объектом готовящегося патента. Пептид 2, как и Пептид 1, амфифилен. В лаборатории д-ра Ж. Дивита показано, что Пептид 2 может быть использован для эффективной доставки коротких олигонуклеотидов. Как и в случае с MPG, предполагается, что проникновение комплексов олигонуклеотидов с Пептидом 1 и Пептидом 2 через мембрану клетки происходит по механизму, отличному от эндоцитоза.
Прежде всего, следовало выяснить, способны ли выбранные нами носители образовывать с олигонуклеотидным ингибитором комплексы для его дальнейшей доставки в клетки. Кроме того, необходимо было определить, при каком минимальном молярном соотношении ингибитора к носителю весь ингибитор связан в комплекс. Для этого мы воспользовались методом электрофореза в агарозном геле. Олигонуклеотидный ингибитор смешивали с различными количествами носителя, смесь инкубировали для формирования комплекса, а затем наносили на агарозный гель. Поскольку массы и заряды свободного олигонуклеотида и олигонуклеотида, связанного в комплекс с носителем, различны, то и их скорости миграции в геле тоже различны. Это позволяет отделить свободный олигонуклеотидный ингибитор от его комплекса.
По результатам структурных исследований, для испытаний на ВИЧ-инфицированных клетках мы выбрали два конъюгата: 2 -0-метил-олигонуклеотид с эозином и олеиновой кислотой. В экспериментах по выбору носителя для доставки ингибитора в клетку мы использовали только конъюгат с эозином. Присутствие в его составе молекулы-флуорофора позволяло следить как за его миграцией в геле, так и за его проникновением в клетку без дополнительного введения какого-либо маркера. Однако следует отметить, что по флуоресцентному свечению можно было следить лишь за миграцией свободного олигонуклеотидного ингибитора; его комплекс с носителем в геле был не виден, поскольку при его образовании происходило тушение флуоресценции.
Для формирования комплекса с пептидными носителями ингибитор смешивали с пептидами в молярном соотношении от 1:1 до 1:40. Электрофоретический анализ показал, что в случае MPG полного связывания олигонуклеотидного ингибитора в комплекс с носителем не происходит даже при максимальном соотношении ингибитор/носитель, использованном в данном эксперименте (рис. 41). Некоторое количество комплекса образуется только при соотношениях 1:20 и 1:40. Этот результат оказался для нас в достаточной мере неожиданным, поскольку, как отмечалось выше, пептид MPG ранее успешно использовался для доставки в клетки различных ДНК и РНК конструкций [153]. Возможно, отсутствие образования комплекса между MPG и 11-ОМ-Е объясняется малым размером олигонуклеотидной части ингибитора и его высокой гидрофобностью Ранее этот носитель использовался для доставки в клетки более длинных ( 18-звеньев) олигонуклеотидов и ДНК.
В пользу этого предположения говорят полученные нами результаты по образованию комплексов 11-ОМ-Е с Пептидом 1 и Пептидом 2, первый из которых были специально разработан для доставки в клетки незаряженных или слабозаряженных ПНК, а второй - для доставки коротких олигонуклеотидов. Так в случае Пептида 1, при молярном соотношении ингибитор/носитель 1:10 и выше миграция ингибитора в геле замедляется, что указывает на образование его комплекса с носителем. Однако данный комплекс в условиях электрофореза не устойчив. При использовании же в качестве носителя Пептида 2, уже при молярном соотношении 1:5 весь ингибитор связан в прочный комплекс.
